Enzimas II

Dr. Frey Francisco Romero Vargas

Departamento de Biología
Universidad Nacional de San Agustín
1. Definición de la cinética enzimática
2. Importancia de estudiar cinética enzimática
3. Influencia de la concentración de sustrato en la velocidad de reacción
4. Ecuación de Michaeles-Menten
5. Grafico doble reciproco de Lineweave-Burk
6. Significado de Km, Kcat y Km/Kcat
7. Inhibidores enzimáticos
8. Tipos de inhibición enzimática
9. Regulación enzimática
 Cinética enzimática
Estudio de las velocidades de las reacciones enzimáticas. (Que
tan rápido se consume los reactivos y se forman los productos)

Velocidad de una reacción se puede hacer por medición de

color, medición de presión de gases, cambios de temperatura o
directamente cambios de concentración, entre otros.
Teoría general de la acción de las enzimas – 1913.
La cinética enzimática es estudiada para:

• Determinar las constantes de afinidad de los sustratos y de los inhibidores

• Conocer las condiciones optimas de la catálisis
• Ayuda a entender los mecanismos de reacción
• Determinar la función de una determinada enzima en una ruta metabólica.

Comprender y controlar la velocidad de las reacciones

resulta muy importante en casi todas las áreas, en todo
sistema vivo, un número enorme de reacciones debe
interconectarse con suavidad.
 1. Recuerde que los sustratos inducen
cambios conformacionales en las enzimas

La necesidad de múltiples
interacciones débiles para
impulsar la catálisis es una de
las razones de que las enzimas
sean grandes biomoléculas.
2. Mecanismos de las enzimas para facilitar la
catálisis
 Ureasa

PM= 483 kDa; seis subunidades

polipeptidicas iguales.
Se halla en frijol, haba, soya y otras
leguminosas también.
Poseen sitios catalíticos sulfhidrilo
(afectado por metales pesados).
 Forma hiperbólica de la
curva cinética de la enzima

• La mayoría de las enzimas presentan una

cinética de Michaelis-Menten, en la que el
gráfico de la velocidad inicial de reacción Vo
frente a la concentración de sustrato [S], es
hiperbólico (de forma similar a la curva de
disociación de oxígeno de la mioglobina).
• Por el contrario, las enzimas alostéricas
muestran con frecuencia una curva
sigmoidal que tiene una forma similar a la
curva de disociación de oxígeno de la
hemoglobina.
Velocidad de reacción

La concentración de sustrato
tiene influencia en la velocidad
de reacción.
La concentración del sustrato afecta la velocidad
de reacciones catalizada por enzimas
Constante de Michaelis:
Cantidad de sustrato necesaria para
obtener la MITAD DE LA VELOCIDAD
MAXIMA DE LA REACCION.

Km es numéricamente a la mitad de
Vmáx

Estado estacionario: momento de la

reacción en que la ES permanece
aprox. constante en el tiempo.
 La Curva
Sustrato –
Velocidad
Casos de la ecuación de Michaelis-Menten
Equilibrios involucrados en cinética enzimática
La enzima (E) se une al sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES):

El complejo (ES) se puede disociar liberando a la enzima libre y el producto de la reacción

(P):

• La segunda reacción es mas lenta, es la reacción que limita a la velocidad.

• La velocidad inicial máxima de la reacción (Vmax) se alcanzará cuando todas las
moléculas de la enzima estuvieran en la forma ES (enzima saturada).
La cinética de las reacciones químicas se pudo
estudiar por esta ley

• A partir de esos equilibrios o

constantes era necesario tener una
ecuación.
• La velocidad de la reacción es dada
por la Ley de Guldberg – Waage

V = k [A] . [B]
Un problema muy difícil!
Ecuación de Michaelis - Menten

Simplificación del equilibrio de cinética enzimática

 Michaelis y Menten consideraron los tiempos
iniciales de la reacción
• En los primeros segundos de la reacción, en esas condiciones la velocidad
Variación de las concentraciones de los componentes de la reacción
enzimática en función del tiempo

Se establece un EQUILIBRIO ESTACIONARIO

• Ahora yo tengo ecuación de 1 variable
La curva que expresa la relación entre [S] y Vo tiene la misma formula
general para la mayoría de las enzimas que pueden ser expresadas
algebraicamente por la ecuación de Michaelis-Menten:

Esta ecuación es derivada a partir de la hipótesis de que el paso

limitante de la velocidad es la ruptura del complejo ES formando E + P.
Curva de saturación de una reacción
enzimática
 Km corresponde a la concentración de
sustrato donde Vo es igual a la mitad de Vmáx

El Km es único para cada par enzima-sustrato

Transformando la ecuación de
Michaelis-Menten…
 Grafico doble reciproco de
Lineweaver-Burk

Transformaciones algebraicas de la
ecuación de Michaelis-Menten en
una forma que nos permite calcular
los valores exactos de Vmax y Km.
 Significado de Km

“Cuanto menor el valor de Km, mas fuerte es la interacción

entre sustrato y enzima”.
¿Cómo hacer un experimento para determinar Km y Vmax?
Control de la vía glucolítica

Mayoría de los tejidos:

Hexoquinasas I – III
Km = 0.1 mM

En el Hígado:
Hexoquinasa IV / Glicoquinasa
Km = 10 mM
Hipersensibilidad al alcohol
 Unidades
Unidad de actividad enzimática (AEnz): Cantidad de P o de S consumido por unidad de tiempo.
P.ej. 1 UAE puede definirse cómo:
La cantidad de enzima que transforma un mmol de sustrato por minuto (mmol/min)
La cantidad de enzima que sintetiza 1 mol de P por segundo
Se determina en condiciones óptimas (pH, T y [S])

Unidad Internacional (UI): cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mmol de

producto por minuto en condiciones óptimas (pH, T, [S]).

Actividad especifica (AEsp): número de unidades de enzima por miligramo de proteína

(mmol/min x mg proteína o AEnz/mg proteína).

Número de recambio o Kcat: número de moléculas de S convertidas en P por unidad de tiempo

y por molécula de enzima en condiciones de saturación.
Kcat = Vmáx/[E]total.
 Constante catalítica (Kcat)
• Numero de renovaciones (turnover)
• Kcat = Vmax /[E]total
• Corresponde al valor de la constante de velocidad del paso limitante
(ej. Kcat = K2)

• Cuanto mayor el valor de Kcat, mas rápida será la reacción.

Ejemplo de Kcat
• Vmáx calculada seria 3mM/min de
reacción. “Actividad enzimática”
• Esta actividad se mide en Unidades
Internacionales.
• U.I. de enzima, es cantidad de E capaz de
transformar 1mmol S/min de reacción.

Transformar las unidades de velocidad en micromoles de S/min (multiplicando por el volumen

de reacción).
Vmax = 3mM/min
= 3mmoles/min.L x 1mL x 10-3 L/mL
= 3x10-3 mmoles S/min.

Kcat = K2
Vo = K2 [ES] La K2 es el paso mas lento de estas reacciones.
En condiciones de cantidad de E sea catalítica y la cantidad de S sea saturada.
Por lo tanto, condiciones de Vmax, la E total estará asociada al sustrato, entonces [ES] = [Etotal]
[E] = 1 nm = 1x10-3 mM
Vmax = Kcat [Etotal] → 3mM/min = Kcat . 1x10-3 mM → Kcat = 3000 min-1
 Comparativo de Km, Kcat y Kcat/Km
para algunas enzimas y sustratos

Constante de especificidad: constante de velocidad para la conversión de E +S

→ E+P cuando la [S] <<<< Km
Comparativo de Km, Kcat y Kcat/Km
para algunas enzimas y sustratos
 Inhibidores
• Sustancias que ralentizan o detienen la actividad de una enzima
• Son usados en el estudio del mecanismo de reacciones biológicas, pero otros son toxinas o se
encuentran asociados a patologías.
• Fundamentales en el tratamiento contra patógenos o farmacológico
 Inhibición enzimática
• Dependiendo del mecanismo de acción del inhibidor, se tienen dos tipos generales de
inhibición enzimática.
 Inhibición competitiva

• La afinidad de la enzima por el sustrato disminuye (Km ↑) pero si son adicionadas

cantidades mayores de sustrato, la velocidad máxima acaba siendo alcanzada (Vmax es =).
• El inhibidor tiene estructura espacial semejante al sustrato de la enzima
• La inhibición competitiva es el mecanismo de acción de ciertas
drogas usadas para tratar infecciones bacteriana en los animales

Acido p-amino benzoico (PABA)

 Inhibición acompetitiva

La afinidad de la enzima por el sustrato aumenta (Km disminuye), pero todavía se adiciona cantidades mayores de
sustrato, la velocidad máxima siempre disminuye (Vmax ↓).
 Inhibición no competitiva

La afinidad de la enzima por el sustrato no se altera (KM es =), pero la velocidad máxima
siempre disminuye (Vmax ↓), así se adicione cantidades mayores de sustrato.
Inhibición mixta
Resumen
 Inhibición irreversible

Inhibidores irreversibles
son aquellos que se
combinan con un grupo
funcional en la molécula, o
la destruyen, o forman una
asociación covalente
estable.
Inhibición irreversible de la ciclooxigenasa por aspirina
 Inhibición de la actividad enzimática

Inhibidores: Compuestos que se unen a la enzima y afectan su acción, esa unión

puede ser irreversible o reversible.
Inhibidores irreversibles: reaccionan con a enzima y la inactivan definitivamente.
Son aminoácidos mas susceptibles: grupos OH de serinas o SH de cisteínas.
Ejemplos de inhibidores irreversibles que se enlazan:
• Serina; compuestos organofosforados y muchos insecticidas
• Cisteina; iodoacetato o iodoacetamida
Acido Acetil Salicílico (Aspirina) – grupo acetil se une a la serina e inactiva la
cicloxigenasa (participa de la síntesis de prostaglandinas).
Penicilina – Inhibe enzimas que participan de la síntesis de la pared bacteriana.
Regulación de enzimas

Mecanismos de regulación
a) Alostérico
b) Modificación covalente
c) Activación proteolítica (irreversible)
d) Unión a proteínas reguladoras
e) Compartimentalización
 Proteínas alostéricas

Proteínas capaces de cambiar de conformación al unirse a un sustrato - Modulador

Este cambio conformacional puede hacer que la actividad proteica:

• Aumente – Alosterismo Positivo
• Disminuya – Alosterismo Negativo

El modulador puede ser:

El mismo sustrato de la enzima (proteína) – Homotrópico
Una sustancia diferente al sustrato de la enzima - Heterotrópico
 Regulación
alostérica
Enzima alostérica:
Cambio conformacional inducida por la
unión de moduladores en una región
diferente del sitio activo.

• Modulador positivo
• Modulador negativo
Control alostérico
Control alostérico por
retroalimentación
(Feedback)

Ejemplo: treonina deshidratasa

Isoenzimas

Ejemplo: la lactato deshidrogenasa cataliza

la transformación de pirúvico a láctico, que
se produce en condiciones de anoxia,
dando lugar a la fermentación de la glucosa.
Regulación de enzimas
 Sistemas multi-enzimáticos

• Son asociaciones de enzimas que realizan funciones

complementarias, actuando de modo secuencial,
catalizando reacciones consecutivas: el producto de
una reacción es el sustrato de la siguiente.
• La eficacia de la reacción aumenta, al favorecer el
encuentro de la enzima y el sustrato.
• Existen dos niveles de asociación:
• Complejos multienzimaticos: Existe unión
covalente entre las enzimas. Generalmente estas
enzimas no funcionan fuera del complejo. Ej.
Sintasa de acidos grasos de levadura (7 enzimas).
• Asociación a membranas. Ej. Cadena respiratoria
en la membrana mitocondrial interna.