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NTE INEN 1529-7 (1990) (Spanish): Control
microbiológico de los alimentos.
Determinación de microorganismos coliformes
por la técnica de recuento de colonias
CDU: 663.1 AL 01.05-305
Norma Técnica CONTROL MICROBIOLOGICO D ELOS ALIMENTOS. INEN 1 529-7
Ecuatoriana DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS COLIFORMES. POR
Obligatoria LA TECNICA DE RECUENTO DE COLONIAS 1990-02
1. OBJETO
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción
1.1 Esta norma establece la técnica de recuento de colonias en un medio sólido.
2. ALCANCE
2.1 Este método es indicado para productos que contienen una alta carga de coliformes y
coliformes psicrotrofos inespecíficos.
3. TERMINOLOGIA
3.1 Coliformes. (Coliaerógenes). Bacterias de forma bacilar, Gram negativas, aerobias y anaerobias
facultativas, móviles e inmóviles, no esporuladas que forman colonias características en agar Cristal
°
Violeta Rojo neutro Bilis (V R B) o similar cuando se incuban a 30 ± 1 C los productos
°
refrigerados y a 35 ± 1 C los productos que se mantienen a temperatura ambiente y se utiliza el
medio y el método descrito. Este grupo es utilizado como indicador del grado de higiene.
3
3.2 Recuento de coliformes. Es la determinación del número de coliformes viables por gramo o cm
de muestra de alimento.
4. RESUMEN
4.1 Este método utiliza la técnica del recuento en placa por siembra en profundidad en agar Cristal
°
Violeta-rojo neutro Bilis (VRB) o similar y una temperatura de incubación de 30 ± 1 C para
°
productos refrigerados y 35 ± 1 C para productos que se mantienen a temperatura ambiente, por 24 ± 2h.
5. EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO
5.1 Equipo usual en un laboratorio microbiológico . En particular:
3
5.1.1 Pipetas serológicas de punta ancha de 1, 5 y 10 cm graduadas en 1/10 de unidad.
5.1.2 Cajas Petri
5.1.3 Autoclave
(Continúa)
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5.1.4 Incubador regulable, rango de temperatura de 25 - 70 ± 1°C.
5.1.5 Balanza de capacidad no inferior a 2 500 g y de 0,1 g de sensibilidad.
5.1.6 Cuenta colonias
3
5.1.7 Frascos de boca ancha de 250, 500 y 1 000 cm con tapa de rosca autoclavables.
5.1.8 pH-metro.
3
5.1.9 Erlenmeyer de 500 y 1 000 cm .
6. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE
6.1 Agar Cristal Violeta-rojo neutro bilis (V R B) ver preparación agares en la Norma INEN 1 529-1.
6.2 Solución de Peptona al 0,1% ver preparación diluyentes en la Norma INEN 1 529-1
7. PREPARACION DE LA MUESTRA
7.1 Preparar la muestra según uno de los procedimientos indicados en la Norma INEN 1 529-2.
8. PROCEDIMIENTO
3
8.1 Utilizando una sola pipeta estéril pipetear por duplicado alícuotas de 1cm de cada una de las
diluciones decimales en placas Petri adecuadamente identificadas. Iniciar por la dilución de
menor concentración.
3
8.2 Inmediatamente, verter en cada una de las placas inoculadas aproximadamente 20 cm de agar
°
cristal violeta-rojo netro-bilis(VRB) o similar recientemente preparado y temperado a 45 ± 2 C. La
adición del medio de cultivo no debe pasar más de 15 minutos a partir de la preparación de la primera
dilución.
8.3 Delicadamente mezclar el inóculo de siembra con el medio de cultivo imprimiendo a la placa
movimientos de vaivén, cinco veces en una dirección; hacerla girar en sentido de las agujas del reloj cinco
veces. Repetir este proceso pero en sentido contrario.
8.4 Como control de esterilidad del medio, verter la cantidad de agar en una placa sin inóculo.
3
8.5 Dejar reposar las placas para que solidifique el agar. Luego verter en la superficie otros 6 cm
de agar todavía fundido y dejar solidificar.
(Continua)
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° °
8.6 Invertir las placas e incubarlas a 30 ± 1 C, para productos refrigerados y a 35 ± 1 C para
productos que se mantienen a temperatura ambiente, por sólo 24 ± 2 horas.
8.7 Pasado el tiempo de incubación, seleccionar las placas que presenten 30 - 150 colonias y examinar
con luz transmitida. Contar todas las colonias de 1 - 2 mm de diámetro (mínimo de 0,5 mm) de color
rojo amoratado rodeadas por un halo rojizo.
8.8 Para el control de rutina en planta, en general, no es necesario realizar ensayos confirmatorios.
Pero cuando sea necesario, especialmente con productos que contengan otros azúcares que la
lactosa, proceder como a continuación se indica.
8.8.1 Seleccionar un número de colonias equivalentes a la raíz cuadrada del total de las colonias
típicas.
3
8.8.2 A cada una de estas colonias inocularlas en tubos individuales que contengan 10 cm de caldo BGBL de
concentración simple y un tubo Durhan.
° °
8.8.3 Incubar a 30 ± 1 C, para productos refrigerados y a 35 ± 1 C para productos que se
mantienen a temperatura ambiente, durante 24 - 48 h.
9. CALCULOS
9.1 Si transcurridas las 48 horas hay presencia de gas en los tubos confirma la presencia de coliformes.
9.2 Para el cálculo basarse en el número de colonias confirmadas en relación al número de colonias
sospechosas.
9.3 El número de microorganismos se calcula multiplicando el número "n" de colonias de
coliformes (8.7) por el respectivo factor de dilución (f).
3
Coliformes/g ó cm = n x f U F C
Siendo:
n = número de colonias típicas
f = factor de dilución
U F C = unidades formadoras de colonias.
(Continua)
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10. ERRORES DE METODO
10.1 La diferencia entre los resultados de las placas duplicadas de una dilución no debe exceder del
15% del valor inferior. Caso contrario repetir el ensayo.
11. INFORME DE RESULTADOS
11.1 Si las placas examinadas no contienen colonias, expresar los resultados de la siguiente forma:
Recuento estimado de coliformes (<) 1,0 multiplicado por el respectivo factor de dilución:
-1
Ejemplo: Si en las placas correspondientes a la dilución 10 no hubo desarrollo de colonias típicas
3 1
el recuento se expresará así: Recuento estimado de coliformes/g ó cm <1,0 x 10 U.F.C.
11.2 Cuando las dos placas de la dilución elegida presentan un número de colonias comprendido
entre 30 - 300, contar las colonias de ambas placas, sacar la media aritmética de los dos valores y
multiplicar por el respectivo factor de dilución.
11.3 Cuando las placas correspondientes a la dilución elegida contiene un número de colonias algo
menos de 30 ó algo más de 300, contar todas las colonias en ambas placas y reportar como 11.2.
3
11.4 En todo caso, reportar como recuento de coliformes/g ó cm utilizando sólo dos cifras
significativas que corresponderán al primero y segundo dígitos (comenzando por la izquierda) del
número de colonias. El redondeo de los números debe hacerse según la Norma INEN 52.
11.5 Mayores detalles se establecen en la Norma INEN 1 529-4
(Continua)
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APENDICE Z
Z.1 NORMAS A CONSULTAR
INEN 52 Reglas para redondear números
INEN 1 5 29-1 Control microbiológico de los alimentos. Preparación de medios de cultivo.
INEN 1 529-2 Control microbiológico de los alimentos. Preparación de muestras
INEN 1 529-4 Control microbiológico de los alimentos. Recuento microbiológico.
Z.2 BASES DE ESTUDIO
Norma International ISO 1482 Microbiology-General Guidance for the enumeration of coliforms-Colony
°
count Technique at 30 C. Primera Ed. Ginebra, 1978.
I.C.M.S.F Microorganismos de los alimentos 1. Técnicas del análisis microbiológico. Editorial Acribia,
Zaragoza, España.
FAO-FOOD AND NUTRITION PAPEL 14/4 Manual of food quality control 4. M i c r o b i o l o g i c a l
a n a l i s i s , Roma, 1979.
Food and Drug Administration Bureau of foods Division of Microbiology, Bacteriological Analitical
Manual, 5ta. Ed. 1978.
Centro Nacional de Alimentación y Nutrición. Método de examen microbiológico para alimentos y
bebidas. Normas recomendadas. Manual Práctico, Madrid, 1976.
International Dairy Federation; FIL-IDF-73 Milk and Milk Products count of Coliform Bacteria.
Internacional Dairy Federation. Bruselas, 1974.
Mossel D.A., Moreno García, B. Microbiología de los alimentos, Edit. Acribia, Zaragoza, España 1982.
Harrigan W.F. McLance, M.E. Métodos de laboratorio en microbiología de los alimentos y productos
l á c t e o s . León, España 1979.
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INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
Documento: TITULO: CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS Código:
NTE INEN 1529-7 ALIMENTOS. DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS AL 01.05-305
COLIFORMES POR LA TECNICA DEL RECUENTO DE
COLONIAS
ORIGINAL: REVISIÓN:
Fecha de iniciación del estudio: 1988-03-28 Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo
Oficialización con el Carácter de
por Acuerdo No. de
publicado en el Registro Oficial No. de
Fecha de iniciación del estudio:
Fechas de consulta pública: de a
Subcomité Técnico: AL 01.05 Microbiología de los Alimentos
Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: 1988-07-14
Integrantes del Subcomité Técnico:
NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA:
Dra. Nelly Camba (Presidenta) INSTITUTO NACIONAL DE PESCA-ESPOL
Sr. Fernando Peñafiel BALANCEADOS VIGOR
Dra. Luz Guerrero PASTEURIZADORA QUITO
Ing. Hayde Llerena PASTEURIZADORA QUITO
Ing. Edwin Santamaría GELEC S.A.
Dr. Víctor Villaroel INEDECA NESTLE S.A.
Ing. Mario Paredes UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO
Dra. Magdalena Baus MINISTERIO DE SALUD PUBLICA
Dra. Rosa de León INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE-QUITO
Dra. Teresa Avila DIRECCION MUNICIPAL DE HIGIENE-QUITO
Ing. Luz Viteri DIRECCION MUNICIPAL DE HIGIENE-
AMBATO
Dra. Hipatia Navas INEN
Ing. Marcelo Prócel (Secretario Técnico) INEN
Otros trámites: 4 Esta norma sin ningún cambio en su contenido fue DESREGULARIZADA, pasando de
OBLIGATORIA a VOLUNTARIA, según Resolución de Consejo Directivo de 1998-01-08 y oficializada
mediante Acuerdo Ministerial No. 235 de 1998-05-04 publicado en el Registro Oficial No. 321 del 1998-05-20
El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1990-02-08
Oficializada como: OBLIGATORIA Por Acuerdo Ministerial No. 158de 1990-04-25
Registro Oficial No. 433de 1990-05-09
