TEMA 7.

TÉCNICAS DE PCR
7.1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (de la terminología inglesa polymerase chain
reaction)¸es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de
copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN
molde.

Aunque en un principio la PCR se diseñó para amplificar un único fragmento corto de ADN
presente en una molécula mucho mayor, el desarrollo posterior de la técnica ha permitido
amplificar fragmentos de gran tamaño (hasta 35 kb) y se han desarrollado diferentes variantes
que permiten:

 Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple). ∙

Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR).
 Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en
una muestra (PCR cuantitativa, PCR a tiempo real).

Las ventajas de las técnicas de PCR y sus variantes sobre otras técnicas utilizadas en biología
molecular son claras:

 Como técnica de amplificación. Respecto a las técnicas de clonación suponen un

considerable ahorro de tiempo (la PCR tiene lugar en horas, mientras que la clonación
tarda días) y, además, están completamente automatizadas (la clonación es un
proceso manual).
 Como técnica de detección. Respecto a las técnicas de hibridación, la PCR requiere una
cantidad de muestra mucho menor y, además, permite la cuantificación de secuencias
concretas (PCR en tiempo real).

Actualmente, esta posibilidad de conseguir altos niveles de amplificación en tiempos cortos y

su mayor sensibilidad de detección han convertido a la PCR en la técnica básica de cualquier
laboratorio de biología molecular.

Sus aplicaciones son innumerables en todos los campos de la biología, la medicina e incluso la
paleontología. Algunos ejemplos son: el diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades, la
evolución y respuesta a tratamientos, los estudios de expresión génica, la mutagénesis, los
estudios filogenéticos, etc.

¡Tenlo en cuenta!

La principal ventaja de la PCR, que es su gran sensibilidad, es también causa de su principal

problema: la contaminación, que puede producirse por material no amplificado, como
aerosoles, microorganismos ambientales, células de descamación, etc., o por material
amplificado de PCR anteriores.

Para minimizar la contaminación resultan calves las medidas de prevención que van desde el
diseño de los mismos laboratorios, hasta los procedimientos de trabajo y el flujo de las
muestras. Por eso es muy importante tener en cuenta el cumplimiento de las normas de
funcionamiento y de buenas prácticas que rigen en el laboratorio.
7.2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR
La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación
del ADN. Consiste en repetir secuencialmente ciclos de replicación de ADN in vitro, de manera
que a partir de una única molécula de ADN molde se obtienen múltiples copias.

Este diseño repetitivo es la clave de la amplificación puesto que las copias nuevas obtenidas en
cada ciclo sirven también de molde para sintetizar otras copias nuevas en los ciclos siguientes,
produciéndose un aumento exponencial en el número de copias a cada ciclo de replicación
sucesivo que se realice. Ahora bien, para conseguir estoy hay que solucionar dos problemas:

 ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie (se replique) el
fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN?
 ¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la
temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde?

La solución al primer problema fue el diseño de cebadores específicos que permiten la

amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN, y la solución al segundo problema
fue el descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables.

7.2.1. LOS CEBADORES O PRIMERS

Los cebadores son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las
regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar.

Se diseñan siempre por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a
la región de interés, pero en extremos y cadenas opuestas:

 El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´🡪5´se denomina
cebador F o forward.
 El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´🡪3´se denomina cebador R
o “reverse”.

El sustrato idóneo para la actividad enzimática de la ADN polimerasa es una molécula

monocatenaria de ADN (molde) con una pequeña región en doble hélice, a la que se une y
empieza a incorporar nucleótidos con bases complementarias a las de la hebra molde. En el
caso de la PCR, esa pequeña región en doble hélice la proporcionan los

cebadores, una vez que se unen a sus secuencias complementarias en las hebras molde
previamente desnaturalizadas.

Un juego de cebadores, por lo tanto, define y delimita la región diana de una molécula de ADN
que se va a amplificar, que será la comprendida entre ambos. Es decir, fijan la especificidad de
la reacción, haciendo posible la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN de
entre una mezcla compleja de moléculas. Por supuesto que, para conseguir este objetivo, su
secuencia debe ser única en el ADN que se estudia.
REQUISITOS QUE DEBEN CUMPLIR LOS CEBADORES

En situaciones ideales, los cebadores deben cumplir una seria de requisitos en cuanto a:

 Longitud. Debe estar comprendida entre 18 y 30 nucleótidos. Por debajo de 15

nucleótidos carecen de especificidad y determinan la aparición de productos
amplificados no específicos; por encima de 35 nucleótidos se unen peor al ADN molde
y disminuyen el rendimiento de la reacción.
 Composición de bases. Los mejores resultados se obtienen con cebadores que tienen
un contenido en G+C comprendido entre el 40 y el 60%.
 Secuencia. Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra e
intermoleculares, para evitar la formación de estructuras secundarias del tipo de
horquillas y la formación de dímeros de cebadores.
 Temperatura de fusión. La Tm de los cebadores debería estar en el rango de 52- 65ºC.
Además, la diferencia entre las Tm de los dos cebadores de una pareja debe ser
inferior a 5ºC, para que se unan con la misma eficiencia al ADN molde.

7.2.2. ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES

Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas nuevas de ADN es necesario que el ADN
molde sea monocatenario. Esto hace que cada ciclo de la PCR tenga que comenzar por una
fase de desnaturalización por calor, lo que supone un problema para las ADN polimerasas
convencionales puesto que son termolábiles, es decir, se inactivan a temperaturas elevadas.

En los primeros experimentos para diseñar la técnica, esta dificultad se superaba añadiendo
enzima nueva en cada ciclo, lo que la convertía en una técnica costosa, larga, con alto riesgo
de contaminación y difícilmente automatizable.

El hecho que posibilitó un desarrollo espectacular de la PCR en poco tiempo fue el

descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables.

Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de un grupo especial de

arqueobacterias extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas.

Al igual que las ADN polimerasas bacterianas convencionales, estas enzimas catalizan la
incorporación de nucleótidos en dirección 5´🡪3´a partir de una pequeña región con doble
hélice utilizando como molde un ADN monocatenario y en presencia de iones magnesio
(Mg2+), pero tienen dos características diferenciales que las hacen idóneas para su uso en
PCR:

 Realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 70 y

75ºC. Esto permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas relativamente
elevadas, fijando unas condiciones de alta rigurosidad, lo cual maximiza la
especificidad de la reacción.
 Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de
incubación a 95ºC (por encima de los 40 minutos), lo que garantiza que la enzima no
se va a inactivar durante las fases de desnaturalización del ADN.
Las ADN polimerasas termoestables se pueden clasificar en función de sus capacidades
enzimáticas secundarias. Estas pueden ser:

 Actividad exonucleasa 5´->3´, pero sin actividad exonucleasa 3´->5´. Además de la

actividad polimerasa tienen actividad exonucleasa 5´->3´, pero carecen de actividad
exonucleasa 3´->5´. Esto hace que no sean capaces de corregir errores (eliminar
nucleótidos mal incorporados). Es el caso de la Taq ADN polimerasa que tiene una tasa
de error de aproximadamente 1 cada 100000 nucleótidos incorporados.
 Actividad exonucleasa 5´->3´y actividad exonucleasa 3´->5´. Son enzimas con
actividad correctora, ya que detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo (con
una base nitrogenada no complementaria de la correspondiente en el ADN molde), lo
eliminan y continúan la elongación de la cadena incorporando el nucleótido correcto.

La tasa de error de estas enzimas es mucho menor, del orden de 1 por cada millón de
nucleótidos incorporados, lo que las hace especialmente útiles para aplicaciones de PCR que
requieren alta fidelidad de replicación, tales como amplificación de secuencias para análisis de
mutaciones por secuenciación o para estudios de expresión.

 Actividad transcriptasa inversa. Algunas ADN polimerasas termoestables tienen

capacidad para utilizar ARN como molde, es decir, presentan actividad transcriptasa
inversa en presencia de iones manganeso (Mn2+), por lo que pueden utilizarse para
sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN.

7.2.3. EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR

Como ya se ha mencionado, la PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación.
Cada ciclo consta de tres fases:

I. Desnaturalización del ADN molde.

II. Hibridación de los cebadores con el ADN molde.

III. Extensión de los cebadores.

El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una molécula de ADN nueva por cada
fragmento de ADN molde presente en la mezcla de reacción. Esta molécula de ADN nueva
servirá también de molde en el siguiente ciclo.

FASE I. DESNATURALIZACIÓN

La desnaturalización debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura suficientemente

elevada para garantizar la desnaturalización completa de ADN molde, sin prolongarse
excesivamente para evitar la inactivación de la ADN polimerasa. Por ejemplo, la Taq ADN
polimerasa pierde actividad cuando es sometida a 95ºC por un tiempo prolongado de más de
40 minutos. Normalmente, la fase de desnaturalización se realiza a 94-95 ºC durante 15-30
segundos.
FASE II. HIBRIDACIÓN

La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing, en inglés) se realiza

habitualmente a una temperatura de entre 50 y 65ºC. El valor concreto depende de la Tm de
los cebadores y suele estar comprendido en el rango Tm +/- 5 ºC.

Distinguimos:

 Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm de los cebadores¸ implican

mayor rigurosidad y, en consecuencia, mayor especificidad (menos hibridación
inespecífica de los cebadores y disminución de la cantidad de productos no deseados).
El inconveniente es un rendimiento menor.
 Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm de los cebadores se pueden traducir
en un mayor rendimiento de la hibridación, ya que los cebadores hibridan más
eficientemente. El inconveniente es la posible aparición de productos no deseados por
hibridación inespecífica de los cebadores.

FASE III. EXTENSIÓN

La extensión o elongación de los cebadores de la ADN polimerasa copiando la hebra molde se

realiza a la temperatura óptima de polimerización de la enzima empleada, que en el caso de la
Taq ADN polimerasa es de 72ºC.

El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de polimerización de la

enzima y la longitud del fragmento que se quiere amplificar.

La Taq ADN polimerasa, por ejemplo, tiene una velocidad de polimerización de alrededor de
60 nucleótidos/segundo. Para esta enzima, se recomiendan tiempos de extensión de entre 30
y 45 segundos para amplificar fragmentos menores de 1 kb, UN minuto para fragmentos de
entre 1 y 1,5 kb y dos minutos para fragmentos de entre 1,5 y 3 kb.

Para enzimas con actividad correctora hay que considerar tiempos de extensión más
prolongados, aproximadamente de 2 minutos para fragmentos de 1 kb.
7.2.4. PRODUCTOS DE AMPLIFICACION DE LA PCR
Tras un número n de repeticiones del ciclo básico de la PCR se obtienen varios tipos de
productos de amplificación, unos deseados y otros no deseados, pero en proporciones muy
diferentes.

Para entender cómo se obtienen estos productos, vamos a estudiar qué ocurre en los primeros
ciclos de PCR a partir de una única molécula de ADN molde nativa.

Primer ciclo de PCR

Consta las fases:

 Fase de desnaturalización inicial. Se separan las dos cadenas de la molécula de ADN

nativa, que vamos a denominar N+ y N-.
 Fase de hibridación. Cada cebador se une a su secuencia diana.
 Fase de extensión. Se sintetizan dos nuevas cadenas de ADN, que incluyen el
fragmento que queremos amplificar pero que tienen una longitud muy superior,
puesto que la ADN polimerasa continúa replicando la hebra molde hasta que se inicia
la fase de desnaturalización del segundo ciclo. Vamos a denominar a estas dos
cadenas nuevas E+ y E-.

Al finalizar el primer ciclo, estas dos nuevas cadenas están formando doble hélice con las
regiones complementarias del ADN molde: N+/E- y N-/E+. Estas moléculas son productos
intermedios largos no deseados de la PCR.

Resultado final del ciclo 1: 2 productos no deseados (2x1) y 0 productos no deseados.

Segundo ciclo de PCR

Consta de dos fases:

 Fase de desnaturalización. Se disocian todas las estructuras en doble hélice,

obteniéndose cuatro cadenas de ADN que pueden actuar como molde: N+. N-, E+ y E-.
 Fase de hibridación y extensión. Se habrán sintetizado cuatro nuevas cadenas de
ADN, que formarán doble hélice con las hebras que han actuado de molde: N+/E-,
N-/E+, E+/A- y E-/A+.

Las cadenas que se sintetizan utilizando las hebras E como molde (A+ y A-) corresponden
exactamente al fragmento que queremos amplificar. Las moléculas E+/A y E-/A+ son también
productos intermedios no deseados.

Resultado final del ciclo 2: 4 productos no deseados (2x2) y 0 productos deseados.

Tercer ciclo de PCR

Consta de las fases:

 Fase de desnaturalización. Se obtienen 8 hebras molde: N+, N-, 2 E+, 2 E-, A+ y A-.
 Fase de hibridación y extensión. Las 8 hebras molde darán lugar a 8 heterodúplex al
finalizar el ciclo: N+/E-, N-/E+. 2 E+/A-, 2 E-/A+, 2 A+/A

Las moléculas A+/A- son los productos deseados, que coinciden con el fragmento que
queremos amplificar y reciben el nombre de amplicones.
Resultado final del ciclo 3: 6 productos no deseados (2x3) y 2 amplicones.

Cuarto ciclo de PCR y siguientes

Consta de dos fases:

 Fase de desnaturalización. Se usarán como molde 16 hebras: N+, N-, 3 E+, 3 E 4 A+ y 4

A-.
 Fase de hibridación y extensión. Las 16 hebras den lugar a 16 heterodúplex: N+/E-,
N-/E+, 3 E+/A-, 3 E-/A+, 8 A+/A-.

Resultado final del ciclo 4: 8 productos no deseados (2x4) y 8 amplicones. En los siguientes
ciclos los resultados finales serán los siguientes:

 Resultado final del ciclo 5: 10 productos no deseados (2x5) y 22 amplicones.

 Resultado final del ciclo 6: 12 productos no deseados (2x6) y 52 amplicones.
 Resultado final del ciclo 7: 14 productos no deseados (2x7) y 114 amplicones.

Y así sucesivamente, de manera que, en cada ciclo, el número de productos no deseados

aumenta aritméticamente, mientras que el número de amplicones aumenta
exponencialmente.

Al finalizar la PCR, tras n ciclos de amplificación:

 El número de productos no deseados será 2n (70 para 35 ciclos de amplificación).

 El número de amplicones se aproximára a 2 (>1010 para 35 ciclos de amplificación).

Aunque el rendimiento de la PCR nunca es del 100% es evidente que con esta técnica se van a
obtener millones de copias de cada molécula molde presente en la muestra original.

7.3. PCR A TIEMPO FINAL

En principio, la PCR se concibió como técnica de amplificación a tiempo final, ya que el
resultado de la reacción no se conoce hasta que se termina y se analizan sus productos
mediante electroforesis.

En esta categoría de PCR a tiempo final se incluyen la PCR estándar y sus distintas
modalidades, así como otro tipo de PCR desarrolladas con posterioridad, como la PCR anidada,
la PCR múltiple y la RT-PCR.

7.3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

La PCR estándar, convencional o básica es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica
un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de
amplificación a tiempo final.

Para entender bien su funcionamiento hay que estudiar en profundidad cuatro aspectos: la
composición de la mezcla de reacción, la preparación de las muestras, la programación del
termociclador y el análisis de los productos amplificados.
La mezcla de reacción

La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el
medio de reacción para que la PCR se desencadena de forma adecuada.

Consiste en un tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para
la replicación del ADN. El tampón aporta el pH y la concentración salina adecuados para la
óptima actividad de la ADN polimerasa con un máximo de fidelidad.

Suelen ser tampones a base de Tris con cloruro potásico (KCl), a un pH de entre 8,3 y 9,0.
Normalmente, el tampón de reacción adecuado se suministra en forma concentrada (2x, 5x o
10x) juntamente con la ADN polimerasa.

Los reactivos que se disuelven en el tampón son principalmente: cloruro magnésico,

desoxinucleótidos trifosfato, cebadores, ADN polimerasa y ADN molde. En ocasiones, en
función del resultado obtenido, pueden ser necesarios otros aditivos o potenciadores para
optimizar la PCR.

 Cloruro magnésico

Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg2+) como cofactor para
desarrollar su actividad. Estos iones se aportan a la mezcla de reacción en forma de cloruro
magnésico (MgCl2).

o La ausencia o una concentración excesivamente baja de Mg2+ libre en la

mezcla de reacción determina la inactividad de la ADN polimerasa.
o Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la
replicación.

Cada ADN polimerasa tiene una concentración óptima de Mg+2 libre para su buen
funcionamiento. Como referencia, la concentración final estándar de MgCl2 en la mezcla de
reacción para la Taq ADN polimerasa es de 1,5 Mm.

 Desoxinucleótidos trifosfato

La mezcla de reacción debe contener los cuatro desoxinucleótidos que componen las
moléculas de ADN en forma de desoxinucleótidos trifosfato para que la ADN polimerasa pueda
usarlos como sustrato para incorporarlos a las cadenas en crecimiento.

Los cuatro desoxinucleótidos trifosfato deben estar presentes en la misma concentración, pues
en caso contrario disminuye la fidelidad de la enzima. Se suministran concentrados en una
concentración total 10 Mm (2,5 mM de cada desoxinucleótido). La concentración final
estándar en la mezcla de cada uno es de 200 μM.

 Cebadores

Como se ha mencionado anteriormente, los cebadores son claves para realizar una
amplificación específica con éxito. La concentración final de cada cebador en la mezcla de
reacción debe ser la misma y debe establecerse de forma experimental para cada pareja.
Como referencia, concentraciones finales de entre 200 y 400 mM de cada cebador suelen dar
buenos resultados.

 ADN polimerasas

La ADN polimerasa es el otro reactivo clave para realizar una PCR con éxito. La elección de una
u otra ADN polimerasa dependerá de la fidelidad requerida en la amplificación, de la longitud
del fragmento que se va a amplificar y, en ocasiones, de la secuencia que se va a amplificar.

Habitualmente las ADN polimerasa se suministran concentradas en soluciones con un 50% de

glicerol y los fabricantes indican su concentración óptima de trabajo, que suele oscilar entre 1
y 2,5 unidades para un volumen de reacción final de 50 microlitros.

 ADN molde

El ADN molde es un componente imprescindible de la mezcla de reacción, ya que contiene el

fragmento de interés que se quiere amplificar. Normalmente se utiliza ADN purificado por
cualquiera de los métodos descritos en anteriores unidades.

Para que la PCR se desarrolle de manera óptima, hay que tener en cuenta tanto la calidad
como la cantidad de ADN molde.

o Calidad del ADN molde. En condiciones ideales, el ADN molde para PCR debe
cumplir los siguientes criterios de calidad:

+ Alto grado de integridad. ADN de alto peso molecular, no degradado ni

fragmentado y sin mellas.

+ Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2, lo que garantiza que no está contaminado

con proteínas.

+ Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR, bien por

inactivación de la ADN polimerasa, bien por secuestro del Mg2+ libre.

o Cantidad de ADN molde. La cantidad idónea para obtener los mejores

resultados en una PCR dependerá de la complejidad del ADN que se estudia.
Como referencia, cuando se trabaja con ADN plasmídico se obtienen buenos
resultados con cantidades de 0,1-1 ng y con ADN genómico bacteriano suelen
ser suficientes cantidades de entre 1 y 10 ng.
En el caso de ADN genómico cantidades de entre 100 y 300 ng suelen dar
buenos resultados. No es aconsejable sobrepasar los 10 ng de ADN/microlitro
de mezcla de reacción, o lo que es lo mismo, los 500 ng de ADN molde para un
volumen de reacción final de 50 microlitros.
 Otros aditivos y potenciadores

Una vez optimizados todos los componentes básicos de la mezcla de reacción, lo esperado es
obtener un buen resultado. Sin embargo, en ocasiones el rendimiento de la PCR es bajo o
aparecen amplificados productos no deseados.

ANEXO de aditivos utilizados en PCR para suplir los problemas derivados de la contaminación,
la naturaliza del ADN molde o la secuencia de los cebadores (os lo subiré aparte al Classroom)
Preparación de las muestras

La preparación de las muestras requiere ajustar el volumen de la reacción, elaborar la mezcla

“máster” y establecer los controles positivo y negativo.

 Ajuste del volumen de reacción:

Al diseñar una PCR, hay que decidir el volumen final de mezcla de reacción, en el que se
llevará a cabo la reacción. Normalmente este volumen es de 25 o 50 µl.

Una vez fijado este parámetro y teniendo en cuenta que todos los componentes de la mezcla
de reacción, incluido el tampón, se suministran concentrados, hay que calcular los volúmenes
de cada reactivo que se añadirá a la mezcla, dependiendo de la concentración final que
queramos obtener. La diferencia entre la suma de los volúmenes de cada componente y el
volumen final de mezcla de reacción se completa con agua estéril grado PCR.

 Mezcla “máster”:

Como las reacciones de PCR se realizan en volúmenes muy pequeños y los componentes se
suministran concentrados, las cantidades que se van a pipetear de cada uno de ellos son muy
pequeñas (entre 0,5 y 5 µl), por lo que la posibilidad de introducir errores de pipeteo es
elevada.

Además, como normalmente se realizan múltiples reacciones simultáneamente, los posibles

errores cometidos en cada tubo son distintos, por lo que las distintas PCR se realizarán en
condiciones diferentes.

Para evitar este problema y conseguir que la composición de la mezcla de reacción sea
homogénea para todas las pruebas que se realicen simultáneamente, es preferible preparar
una única mezcla de reacción, denominada mezcla máster (master mix), que incluya todos los
componentes, excepto el ADN molde.

La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una

reacción por el número de muestras que se van a procesar simultáneamente + 1 (es mejor que
sobre y no que falte mezcla para el último tubo), teniendo en cuenta que en el número de
muestras hay que incluir los controles positivos y negativo de la técnica.

Una vez completada la mezcla máster, se reparte la cantidad adecuada a cada tubo de
reacción y se añaden los respectivos ADN molde.

 Control positivo y control negativo:

Además de las muestras problema en las que tendrá lugar la reacción PCR, en cada tanda se
prepara un control positivo y un control negativo de la técnica.

+ Control positivo: Es un tubo con mezcla máster al que se añade ADN molde control
que contiene el fragmento que se quiere amplificar.

+ Control negativo o blanco: Es un tubo con mezcla máster en el que se sustituye el

ADN molde por un volumen igual de agua estéril de grado PCR, de manera que no
habrá ADN presente en la reacción.

Una vez que las muestras y los controles ya están preparados, se llevan al termociclador para
iniciar la PCR.
  Programación del termociclador

El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de PCR.

Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para
que se desarrollen de forma automatizada. Esta programación incluye tres etapas principales,
que se terminan con una incubación final para el mantenimiento de los productos de la
reacción hasta su retirada de la máquina.

1. Desnaturalización inicial. Es la etapa que inicia la reacción de PCR. Consiste en

calentar la mezcla de reacción a 94-95 ºC durante varios minutos para asegurar la
completa desnaturalización de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en la
mezcla de reacción.

2. Ciclos de replicación. Para esta etapa se programan:

 Las temperaturas y los tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico
de PCR: desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión.
 El número de veces que se va a repetir el ciclo, es decir, el número de ciclos de
replicación.

El número de ciclos de replicación va a depender del número inicial de copias del fragmento
que se quiere amplificar en la muestra en estudio. Cuanto más abundante sea el fragmento
que se va a amplificar, menor número de ciclos de replicación serán necesarios para acumular
una cantidad suficiente de ampliicones. Típicamente, el número de ciclos oscila entre 25 y 35,
aunque para moldes escasos o problemáticos se pueden aumentar hasta 40. Por encima de 40
ciclos aumenta considerablemente la probabilidad de que aparezcan productos no deseados
inespecíficos y la ADN polimerasa pierde actividad por el tiempo acumulado a temperaturas
de desnaturalización.

3. Extensión final. Es la etapa que finaliza la reacción de PCR. Consiste en una

incubación única a la temperatura óptima de polimerización de la ADN polimerasa
durante 5-10 minutos, para aseguraros de que todos los productos de PCR están
completos y en forma de doble hélice.

4. Mantenimiento. La programación del termociclador finaliza siempre con una última

incubación a 4 ºC sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren
del termociclador, anulando la actividad de la enzima.

 Analisis de los productos amplificados

Una vez finalizada la reacción de PCR se recuperan las distintas muestras amplificadas de
termociclador y se analiza el resultado (detección de los productos amplificados) mediante
una electroforesis en gel (normalmente agarosa 0,5-2,0 % con un agente intercalante
fluorescente), junto con un marcador de tamaños.

El gel se ilumina con luz UV en un transiluminador para visualizar las bandas de amplificación.
La presencia de una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado
correctamente. La observación de varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de
productos de ampliación no deseados. Esto es debido a que durante la PCR se han amplificado
inespecíficamente fragmentos de ADN distintos de la diana específica, por lo que habrá que
repetir la reacción variando la programación del termociclador o la composición de la mezcla
de reacción hasta conseguir un resultado específico.

 Resultado positivo

Cuando la PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la observación de una banda
específica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra que se
estudia y garantizar por tanto un resultado positivo. Pero si existieran problemas de
contaminación de la mezcla máster, ¿cómo descartar que no se trate de un falso positivo?

Por eso, en cada tanda de PCR se procesa simultáneamente un control negativo o blanco, en el
que el ADN molde se sustituye por agua de grado PCR. En el gel de la electroforesis, la calle
correspondiente al blanco debe aparecer limpia, sin bandas, Si en el blanco se detecta alguna
banda, ello indicaría contaminación de algún reactivo o pipeta que se hayan usado en la
técnica, lo que invalida los resultados de la tanda.

 Resultado negativo

La ausencia de la banda especifica en una muestra problema indica, a priori, que la muestra no
contiene la secuencia diana y, por tanto, el resultado sería negativo. Pero, realmente, esta no
es condición suficiente para afirmar que el resultado es negativo, puesto que algún reactivo
empleado puede no funcionar correctamente o la muestra puede contener inhibidores de la
PCR. ¿Cómo se descartan las posibilidades?

El control positivo de la técnica, que se procesa simultáneamente con las muestras, sirve para
validar la mezcla de reacción. Si todos los reactivos funcionan bien, en el control positivo se
observará la banda específica. En caso contrario hay algún problema en la mezcla máster y se
invalida la tanda. Para descartar la presencia de inhibidores en una muestra hay que realizar
un control positivo de la muestra, consiste en una nueva PCR en la que se amplifica un gen
control presente en la muestra. Si este control amplifica bien, se confirma que la muestra es
negativa para la secuencia que se estudió inicialmente. Si el control positivo de la muestra no
amplifica, a muestra no es apta para PCR.

7.3.2. MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR

La PCR estándar se utiliza mayoritariamente con fines diagnósticos, amplificando secuencias
menores de 3,5 kb, para lo que las condiciones descritas hasta ahora suelen dar buenos
resultados.

Sin embargo, el intento de minimizar la producción de productos no deseados o la necesidad

de amplificar fragmentos de gran tamaño o con gran fidelidad para otras aplicaciones ha
derivado en el desarrollo de variantes o modalidades de la PCR estándar adaptadas a cada
necesidad, como:

 La PCR con inicio en caliente.

 La PCR de grandes fragmentos.
 La PCR de alta fidelidad.
PCR con inicio en caliente

Aunque las ADN polimerasas utilizadas en PCR tienen una temperatura óptima de acción
alrededor de los 70ºC, muestran también una actividad polimerasa residual a temperaturas
inferiores.

Esto hace que, durante el proceso de preparación de la mezcla de reacción, en el transporte

hasta el termociclador y durante la rampa ascendente de la temperatura hasta alcanzar por
primera vez la temperatura de desnaturalización, se puedan generar productos de
amplificación inespecíficos no deseados.

La PCR con inicio caliente (hot start-PCR) es un tipo de PCR basado en eliminar la actividad de
la enzima a bajas temperaturas para evitar la aparición de productos de amplificación no
deseados, relacionada principalmente con la naturaleza de los cebadores.

Esto se puede lograr usando varias estrategias:

 Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa. Es la forma más sencilla. Se

preparar la mezcla de reacción sin la ADN polimerasa, se dispensa en los tubos y estos
se colocan en el termociclador.
 Aislando la ADN polimerasa del resto de componentes de la mezcla. Consiste en
mantener la enzima aislada del resto de componentes de la mezcla hasta que se
alcance una temperatura elevada.
El aislamiento se consigue, por ejemplo, incluyendo las ADN polimerasa en el interior
de esferas de cera, de manera que cuando se alcanzan temperaturas elevadas en la
desnaturalización inicial, al fundirse la cera, la enzima se libera a la mezcla de reacción.
 Suministrando la ADN polimerasa inactiva. Esto se consigue bloqueándola con un
anticuerpo específico, o bien, modificándola químicamente mediante unión termolábil
a un grupo bloqueante.
En cualquier caso, al alcanzar la temperatura de desnaturalización inicial la enzima
recobra su actividad, bien por desnaturalización del anticuerpo bloqueante, bien por
ruptura de la unión termolábil al grupo químico que estaba unida.

PCR de grandes fragmentos

El rendimiento de la PCR estándar suele disminuir drásticamente cuando se amplifican

fragmentos mayores de 5 kb. La explicación es la acumulación de productos truncados, más
cortos que el amplicon específico y que, por lo tanto, no pueden ser usador como molde en los
siguientes ciclos. Estos productos truncados se producen probablemente por la incorporación
de nucleótidos erróneos que ralentizan o detienen directamente la polimerización.

La PCR de grandes fragmentos es una variante de la PCR estándar que permite aumentar el
rendimiento cuando se amplifican fragmentos de entre 5 y 35 kb.

El diseño de estas PCR afecta a la composición de la mezcla de reacción y a la programación del

termociclador.
La mezcla de reacción

Las variaciones de composición en la mezcla de reacción respecto a las que se han visto en la
PCR convencional son:

 Mezcla de ADN polimerasa. Es la modificación más importante. Consiste en la

utilización de una mezcla de dos ADN polimerasas termoestables:
o Una ADN polimerasa mayoritaria (elevada concentración) sin actividad
correctora. - Otra minoritaria (baja concentración) con potente actividad
correctora (actividad exonucleasa 3´->5´)

De esta forma, cuando la ADN polimerasa mayoritaria incorpora un nucleótido erróneo y

detiene la polimerización (lo que originaría un producto truncado), esta enzima con actividad
correctora puede eliminar el nucleótido erróneo y continuar con la polimerización.

 Uso de aditivos. En la mezcla de reacción se suelen incluir aditivos como el glicerol,

que estabiliza las ADN polimerasas y el dimetilsulfóxido (DMSO), que favorece la
desnaturalización.
 Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción. Experimentalmente, se
ha demostrado que concentraciones más bajas de potasio favorecen la eficiencia de la
amplificación de fragmentos largos.

La programación del termociclador

Es evidente que para polimerizar con éxito fragmentos de gran tamaño en el momento de
programar el termociclador hay que aumentar considerablemente el tiempo de extensión en
cada ciclo. Dependiendo de la longitud del fragmento que se va a amplificar se pueden
programar tiempos de extensión de hasta 25 minutos.

Por el contrario, los tiempos de desnaturalización se acortan (2-10 segundos) para minimizar la
inactivación de las polimerasas.

PCR de alta fidelidad

Par algunas aplicaciones a las que van a ser destinados los productos de PCR, como expresión
génica o clonación, se requiere una PCR de alta fidelidad.

La PCR de alta fidelidad son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en
los amplicones mutaciones puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos.

En estos casos conviene realizar variaciones en las condiciones estándar de la composición de

la mezcla de reacción. Estas son:

 Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora. ∙ Favorecer las

condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima, ajustando: - El pH de la mezcla
de reacción. Algunas enzimas presentan mayor fidelidad a pH más bajo del habitual y
otras a pH más alto.
 o La concentración de Mg2+. Un exceso suele disminuir la fidelidad de las
polimerasas.

7.3.3. OTRAS TÉCNICAS DE PCR A TIEMPO FINAL

Además de la PCR estándar disponemos de otras técnicas que nos permiten incrementar en
gran medida las aplicaciones de la PCR. Entre ellas están la PCR anidad, la PCR múltiple y la PCR
con transcripción inversa.

PCR anidada

La PCR anidada (nested-PCR), consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas, de

manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la
primera.

Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar es
bajo (poca cantidad de producto amplificado) o para aumentar la especificidad en los casos en
que no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados con una PCR estándar.

Los cebadores usados en ambas PCR son distintos:

 En la primera PCR se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que

incluye la región de interés. Se denominan cebadores externos.
 En la segunda PCR se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el
interior del fragmento, amplificado en la primera PCR. Se denominan cebadores
internos.

La muestra que se tiene que amplificar en la 2nda PCR para reamplificar la región de interés
que está contenida en su secuencia.
Esquema de una PCR anidad. En la primera PCR se amplifica un fragmento mayor que la diana mediante un juego de
cebadores externos. Los amplicones sintetizados en la primera PCR se utilizan como muestra en una segunda PCR
con un par de cebadores internos para amplificar el fragmento deseado.

PCR múltiple

La PCR múltiple (multiplex-PCR) consiste en la amplificación de varias secuencias diana a la vez,

en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR.

Se consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una
región diferente. Estas parejas de cebadores tienen que cumplir varios requisitos:

 La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser
similar, puesto que, al usarse un único programa de termociclador, todos los cebadores
deben unirse al ADN molde con la misma eficiencia a la temperatura programada para
la fase de hibridación.
 Los amplicones generados por cada pareja de cebadores deben tener un tamaño
suficientemente diferente para poder separarse en la electroforesis y visualizarse como
bandas individuales.
 Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros formando dímeros
u oligómeros.

La aplicación más sencilla de la PCR múltiple es la incorporación de un control positivo interno

en una reacción de detección.

El control positivo interno consiste en añadir a la mezcla de reacción una pareja de cebadores
diseñados para amplificar una secuencia control que tiene que estar presente en el ADN molde
problema.

De esta manera, los resultados negativos se confirman directamente en una única PCR, sin
necesidad de realizar una PCR adicional de control positivo de la muestra.

Tres resultados serían posibles:

 Positivo. Se observan dos bandas en la electroforesis: la específica de la secuencia que

se está estudiando y la del control positivo.
 Negativo. Se visualiza solo la banda del control positivo.
 PCR no válida. No se observa ninguna banda, lo cual indica que la muestra contiene
inhibidores de la PCR.
PCR con transcripción inversa (RT-PCR)

La PCR con transcripción inversa o RT-PCR (reverse transcription-PCR) permite amplificar y

analizar moléculas de ADN.

Dado que las ADN polimerasas termoestables utilizan ADN como molde, para amplificar ARN
mediante PCR es necesario realizar:

1. Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o

transcriptasa inversa.

2. Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como
molde y lo amplifica.

Estos dos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo tubo.

Las RT, al igual que las ADN polimerasas, necesitan cebadores que formen una pequeña región
de doble hélice en el ARN molde para poder sintetizar el ADNc. En el caso de la RT-PCR, a partir
de un ARN purificado se pueden seguir tres estrategias diferentes:

 Una estrategia similar al random priming para marcar sondas, utilizando como
cebadores una mezcla de hexonucleótidos, que hibridan al azar en múltiples posiciones
de todas las moléculas de ARN presentes en la muestra. Con esta estrategia se
transcribe todo el ARN de la muestra a ADNc:
 Usar como cebador un oligo-dT, que hibridará con las colas poli-A de los ARNm
presentes en la muestra. Con esta estrategia se transcriben a ADNc todas las moléculas
de ARNm presentes en la muestra.
 Usar un cebador específico de una secuencia determinada, más concretamente, uno
de los cebadores que se va a utilizar en la PCR posterior. Con esta estrategia se
transcribe a ADNc, exclusivamente un fragmento de ARN que contiene la secuencia
que queremos amplificar.

Esquema
de una PCR con

transcripción inversa (RT-PCR). En una primera etapa se sintetiza un ADNc a partir de una molécula de ARNm
mediante una transcriptasa inversa y un cebador (en el esquema, un cebador específico de secuencia). Al finalizar
esta etapa se obtiene heterodúplex ARNm/ADNc. En una segunda etapa se realiza una PCR estándar con cebadores
específicos, de manera que en el primer ciclo se sintetiza ADNc bicatenario y a partir del segundo ciclo se producen
los amplicones específicos.

7.4. PCR A TIEMPO REAL

En la PCR a tiempo real se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de
productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo.

La PCR a tiempo real se realiza en un termociclador a tiempo real¸ que, además de las
funciones típicas de un termociclador convencional, incorpora un lector de fluorescencia, de
manera que puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier
momento de la PCR.

Las ventajas de la PCR a tiempo real sobre la PCR a tiempo final son evidentes:

 Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra, ya que

el resultado se puede obtener incluso antes de que termine la PCR.
 Resultados más fidedignos, puesto que la detección instrumental de fluorescencia es
más objetiva y sensible que la tinción con bromuro de etidio de un gel de
electroforesis.
 Minimiza los problemas de contaminación, ya que tanto la amplificación como la
detección se realizan en el mismo tubo cerrado.
 Dado que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado, la
PCR a tiempo real permite la cuantificación, tanto de los amplicones producidos, como
del ADN diana inicial presente en la muestra.

Para entender bien el funcionamiento de la PCR a tiempo real, en este apartado nos vamos a
detener en el estudio de la cinética de la amplificación y los sistemas fluorescentes de
detección de amplicones, para poder estudiar sus aplicaciones más importantes.

7.4.1. CINÉTICA DE AMPLIFICACIÓN

Una vez se consigue asociar fluorescencia con producción de amplicones, se puede estudiar la
cinética de la amplificación de la PCR, mediante las curvas de amplificación.

La curva de amplificación es una curva de tipo sigmoide que se obtiene al representar la

emisión de fluorescencia en cada ciclo de PCR respecto del número de ciclo en que se produce.

La curva tiene tres zonas claramente diferenciadas, que corresponden a tres fases de la cinética
de amplificación:

 Zona o fase de ruido, en el que la única fluorescencia que se detecta es debida a la

señal fluorescente de fondo en cada tubo. Corresponde a los primeros ciclos de PCR,
en los que el número de amplicones sintetizados está por debajo del nivel de detección
del aparato, y por lo tanto lo está la fluorescencia asociada a ellos.
La amplitud de esta zona de la curva va a depender de la cantidad de secuencias diana
en la muestra. Cuanto menor es el número de secuencias diana en la muestra, más
ciclos se necesitan para obtener un número de amplicones por encima del nivel de
detección del aparato.
  Zona o fase de crecimiento exponencial. La curva en esta zona es lineal y de gran
pendiente. Abarca un número reducido de ciclos (de 4 a 6) y corresponde a la auténtica
fase exponencial de producción de amplicones.

 Zona o fase de meseta. En esta zona la curva es también lineal, pero de pendiente
reducida, debido a la drástica disminución del rendimiento en los últimos ciclos de
PCR, probablemente por agotamiento de sustratos, pérdida progresiva de la actividad
polimerasa, saturación de la enzima, etc.

Estas curvas son producidas por el termociclador a tiempo real para cada reacción y para ello
se necesita añadir a la mezcla de reacción un sistema fluorescente de detección de los
amplicones.

Curva de amplificación característica de una PCR a tiempo real: a) zona de ruido, correspondiente a los ciclos en los
que la cantidad de amplicón específico se encuentra por debajo del límite de detección del termociclador (umbral);
b) zona de crecimiento exponencial; c) zona de meseta.

7.4.2. SISTEMAS FLUORESCENTES DE DETECCIÓN DE AMPLICONES

Los sistemas fluorescentes de detección de amplicones pueden ser de dos tipos:
independientes de secuencia o específicos de secuencia.

Sistema de detección independientes de secuencia

Los sistemas de detección independientes de secuencia se basan en el empleo de agentes

fluorescentes intercalantes.

Los agentes fluorescentes intercalantes son sustancias fluorescentes que aumentan su emisión
de fluorescencia cuando se intercalan en el ADN de doble hélice. En consecuencia, el aumento
del número de amplicones en cada ciclo de PCR se correlaciona con un aumento en la emisión
de fluorescencia. En este caso, la medida de fluorescencia se realiza al final de cada ciclo de

amplificación, al terminar la fase de extensión, porque en ese momento todos los amplicones
se encuentran en forma de doble hélice.

El principal inconveniente de este sistema de detección es su baja especificidad, ya que el

agente intercalante se une a cualquier molécula de ADN en doble hélice, incluyendo los
productos inespecíficos no deseados y los dímeros de cebadores.
Sistemas de detección específicos de secuencia

Los sistemas de detección específicos de secuencian se basan en la utilización de sondas

oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos que hibridan de manera específica en la región
central del amplicón.

De esta manera, la fluorescencia se asocia solo con los productos deseados, aumentando la
especificidad de la detección. Ahora bien, una sonda marcada con un fluorocromo emite
fluorescencia siempre que se excita con la longitud de onda adecuada, independientemente de
que esté libre en solución o unida a su secuencia diana. Entonces, ¿cómo conseguir que la
sonda solo emita fluorescencia si se une al amplicón? Para solucionar este problema se usan
dos fluorocromos acoplados a la sonda, según el principio de transferencia de energía
fluorescente por resonancia (FRET)

 Principio de transferencia de energía fluorescente por resonancia (FRET)

La transferencia de energía fluorescente por resonancia o FRET (fluorescence resonance energy

transfer) consiste en la transferencia de energía lumínica de un fluorocromo a otro. Para que
esto ocurra, ambos fluorocromos deben estar próximos físicamente y el
espectro de emisión del primer fluorocromo tiene que solaparse con el
espectro de excitación del segundo fluorocromo (zona gris en la figura). El
fluorocromo que transfiere energía se denomina donante y el que la recibe
se denomina aceptor.

Si se cumplen ambas condiciones, el fluorocromo donante absorbe energía

cuando se excita con una longitud de onda adecuada, y en lugar de emitir
fluorescencia transfiere esa energía al fluorocromo aceptor, el cual a su vez
se excita y emite su fluorescencia característica.

En este caso, el aceptor actúa como “neutralizador” o “apantallador” del

donante (quencher, en inglés) evitando que emita su fluorescencia característica.

Existen también moléculas no fluorescentes capaces de recibir energía fluorescente por

resonancia. Se denominan quencher no fluorescentes.

Sondas de hidrólisis

Las sondas de hidrólisis o sondas TaqMan son oligonucleótidos sintéticos que tienen un
fluorocromo donante, denominado notificador (reporter en inglés) en el extremo 5´y un
quencher (fluorescente o no) en el extremo 3´.

La sonda híbrida específicamente en la región central del fragmento que se amplifica y para
evitar que la ADN polimerasa pueda extenderlo tiene el extremo 3´fosforilado. Con este tipo de
sondas la fluorescencia se mide al final de la ase de extensión de cada ciclo.
Balizas moleculares

Las balizas moleculares (molecular beacons) son un tipo especial de sondas oligonucleotídicas
específicas para PCR a tiempo real.

Como las sondas de hidrólisis, portan un notificador en posición 5´y un quencher en posición 3
´, pero se diferencian porque ambos extremos son secuencias cortas repetidas e invertidas (y,
por tanto, complementarias), mientras que la parte central es la auténtica sonda con una
secuencia complementaria a la región central del fragmento que se amplifica. En condiciones
normales, estas sondas adquieren una estructura secundaria en forma de horquilla (por la
complementariedad de sus extremos), con la región central formando un bucle. En esta
disposición, el notificador y el quencher están muy próximos, por lo que no se detecta la
fluorescencia del notificador.

Cuando la sonda se une al ADN molde, los dos extremos, que no se pueden aparear con el ADN
molde, se separan de manera que el notificador puede emitir fluorescencia cuando es excitado.
Con estas donas, la fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación.

Sondas FRET

Las sondas FRET son parejas de sondas que hibridan dentro del amplicón, en regiones
adyacentes.

Una de ellas porta un notificador en posición 3´y la otra un quencher fluorescente en posición
5´. Al hibridar con sus respectivas secuencias diana, ambos fluorocromos quedan muy
próximos (entre una y cinco bases), de manera que al excitar el notificador se produce
transferencia de energía al quencher, que se excita y emite su fluorescencia. Con estas sondas,
la fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación, excitando el notificador y detectando
el quencher.
Sistema de detección específicos de secuencia. A) Esquema de un ciclo de una PCR a tiempo real usando sondas de
hidrólisis o TaqMan. Cuando la sonda está entera, independientemente de que esté libre en solución o unida al ADN
molde, la excitación del notificador provoca una transferencia de energía fluorescente del notificador al quencher,
por lo que no hay emisión de fluorescencia (1 y 2). Durante la extensión del cebador, la ADN polimerasa hidroliza la
sonda, nucleótido a nucleótido, con su actividad exonucleasa 5´🡪3, por lo que tanto el notificador como el quencher
se liberan al medio y se separan (3 y 4). Al final de la extensión se excita el notificador y emite fluorescencia (5). B)
Esquema del funcionamiento de las balizas moleculares en PCR a tiempo real. C) Esquema del funcionamiento de las
sondas FRET en PCR a tiempo real.

7.4.3. APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL

Las aplicaciones más importantes de la PCR a tiempo real son la PCR cuantitativa a tiempo real
y la detección de mutaciones mediante curvas de fusión.

PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)

La PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) es una aplicación de la tecnología PCR a tiempo real
que permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra.

Para realizar este cálculo, el termociclador a tiempo real detecta el llamado punto de corte (Cp)
o ciclo umbral (Ct).

El punto de corte (Cp) (del inglés crossing point) o ciclo umbral (Ct) (del inglés threshold cycle)
es el ciclo de PCR en el cual la fluorescencia de la muestra alcanza un valor por encima del
límite de detección.

En la curva de amplificación el Cp es el ciclo en que se pasa de la zona de ruido a la de

crecimiento exponencial, mediante un giro brusco hacia arriba.

El Cp de una muestra es inversamente proporcional a la cantidad inicial de la molécula diana en

la muestra. Cuanto mayor sea el número de secuencias diarias en la muestra, menos ciclos de
PCR serán necesarios para alcanzar el Cp. Partiendo de esta base, la cuantificación puede
expresarse de dos maneras en términos absolutos o en términos relativos.

Cuantificación absoluta

Las pruebas de cuantificación absoluta expresan el resultado final (cantidad de secuencia diana
en la muestra) en unidades de concentración (por ejemplo, µg/µl) o en número de copias por
unidad de volumen.

Este tipo de cuantificación requiere la elaboración de una curva de calibración con patrones
que tengan una concentración o número de copias conocido. Estos patrones se procesan
simultáneamente, en la misma ronda de PCR que las muestras problema.

El software de análisis del termociclador establece una curva de calibración a partir de los Cp
de los patrones e interpola el Cp de cada muestra para calcular el resultado.

Estas pruebas son muy útiles para cuantificar cargas virales, respuestas a tratamientos (control
de eficacia de fármacos), estudios de cuantificación de expresión génica, etc.

Cuantificación relativa

Los resultados de las pruebas de cuantificación absoluta pueden estar condicionados por la
mejor o peor purificación de las distintas muestras, la eficiencia de la síntesis de ADNc (cuando
se estudia ARNm), errores de pipeteo, etc. Estas posibles causas de error o de imprecisión se
pueden evitar realizando una cuantificación relativa.
La cuantificación relativa consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en
relación con la concentración de un gen de referencia que está presente en todas las muestras
con un número constante de copias.

En este tipo de pruebas no es necesaria una curva de calibración con patrones.

Curvas de fusión y detección de mutaciones

Otra aplicación importante de la PCR a tiempo real es la detección de mutaciones mediante las
curvas de fusión.

La curva de fusión es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la

temperatura.

Los termocicladores a tiempo real están preparados para realizar curvas de fusión de los
productos amplificados. En principio, esta función se diseñó como un control de especificidad
para detectar la amplificación de productos no deseados cuando se utiliza un agente
intercalante como sistema de detección.

La curva se realiza una vez que ha concluido la PCR. Para obtenerla, se baja la temperatura
hasta un punto que garantice que todo el ADN se encuentra en forma de doble hélice (60-65
ºC).

A partir de aquí la temperatura se va elevando lentamente hasta alcanzar la temperatura de

desnaturalización (95 ºC) al tiempo que se monitoriza continuamente la variación de la
intensidad de fluorescencia.

Supongamos que la PCR ha sido específica y no se han sintetizado productos no deseados. Al

principio, la fluorescencia es máxima y va disminuyendo lentamente hasta llegar al punto de
fusión del amplicón, en el que se produce una disminución brusca de la fluorescencia y aparece
un punto de inflexión en la curva.

Para visualizar mejor el punto de fusión, el software del termociclador calcula otra curva
basada en la deriva de la anterior, denominada curva de picos de fusión, porque en esta curva
el punto de fusión del amplicón se visualiza como un pico.

Si al finalizar la PCR se han sintetizado también productos no deseados, dado que estos tienen
puntos de fusión distintos que el amplicón, en la curva de fusión aparecerán varios puntos de
inflexión y en la curva de picos de fusión aparecerán varios picos.

Actualmente se están utilizando las curvas de fusión obtenidas con sondas fluorescentes únicas
o parejas de sondas FRET para detectar mutaciones puntuales. La detección se basa en la
disminución importante que experimenta la Tm del híbrido que forma una sonda pequeña
cuando en la secuencia diana hay una base desapareada (mutación puntual).

Cuando se usa una sonda única (por ejemplo, una baliza molecular), esta debe cubrir una
región de la mutación. Al inicio de la curva, la fluorescencia es máxima porque la sonda está
unida al amplicón, y a medida que aumenta la temperatura la fluorescencia disminuye porque
la sonda se va despegando.

Tres tipos de curva de picos de fusión son posibles:

  Curva con un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de
fusión de la sonda. Indica que el ADN molde no presenta mutaciones.
 Curva con un único pico de fusión a una temperatura menor al punto de fusión de
sonda. Indica la presencia de una mutación en homocigosis.
 Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura del punto de fusión de la sonda y
el otro a una temperatura menor. Indica una mutación en heterocigosis.

El empleo de sondas FRET tiene el mismo fundamento, pero tienen que cumplir dos requisitos:

 La sonda con el notificador tiene que hibridar en la región de la mutación. ∙ La sonda

con el notificador debe tener una Tm ligeramente inferior a la sonda con el quencher
(para que se despegue antes).

Curvas de fusión y picos de fusión de dos muestras obtenidas de una PCR a tiempo real. Muestra A. Solo se observa
un punto de inflexión en la curva de fusión y un único pico de fusión, que corresponde al ampicón específico.
Muestra B. Se observan dos puntos de inflexión en la curva y dos picos de fusión, uno correspondiente al amplicón
específico y otro a un producto de amplificación inespecífico no deseado.