Universidad Autónoma del Estado de México

Facultad de Odontología – Cirujano Dentista

Microbiología general

Practica No. 1: “Microscopia”

Alumnos; Grupo 3, Equipo 3:

Cruz Bahena Lisset Perla
Flores Antonio Ximena
Olvera Flores Iván de Jesús

Profesores:

DR. EN C. ISAIAS DE LA ROSA GOMEZ

E. EN ES. LUIS MANUEL LAREDO MOYSEN
Título de la práctica: "Microscopía"

Objetivos: Conocer la técnica instrumental para el manejo del microscopio óptico, junto con el
reconocimiento de sus partes y observación de las características morfológicas de los
microorganismos Escherichia coli y Candida albicans (tinción de Gram, morfología y
agrupación.

Antecedentes:

El microscopio (del griego μικρός micrós, ‘pequeño’, y σκοπέω scopéo, ‘mirar’) es una
herramienta que permite observar objetos, que son demasiado pequeños para ser observados
a simple vista.

Fig. 1: Partes del microscopio óptico.

Un microscopio óptico compuesto está formado por las siguientes partes:

Oculares. Son las lentes que forman la imagen que observamos con nuestros ojos. Todos los
microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo. Por eso a los microscopios
actuales se les llama binoculares. Los primeros microscopios eran monoculares, es decir,
poseían un solo ocular. Hay que tener en cuenta que en los microscopios más avanzados tanto
el objetivo como el ocular suelen estar compuestos por varias lentes. Al menos uno de los
oculares puede regularse para alejar o acercar la lente al objetivo, permitiendo ajustar el
enfoque a las condiciones de visión, dioptrías, de cada observador. Los dos oculares también
se pueden acercar o separar para ajustar su separación a la separación de los ojos del
observador.

Objetivos. Los objetivos son las lentes que reciben la luz directamente tras atravesar la
sección histológica y quizá sean los elementos más importantes del microscopio. Hoy en día
los microscopios ópticos poseen un tambor o revólver donde se encuentran varios objetivos.
Cada uno de ellos posee lentes que permiten diferentes aumentos. Las magnificaciones de los
objetivos más usados suelen ser de 10, 20, 40 y 100 aumentos. Rotando el revólver se puede
seleccionar el objetivo y por tanto el aumento al que queremos observar la preparación. Aparte
de los aumentos, los objetivos tienen una serie de características para mejorar la imagen. Así,
pueden ser acromáticos, de fluorita o apocromáticos, los cuales corrigen alteraciones
cromáticas, de campo plano que eliminan la curvatura del campo de observación, de contraste
de interferencia, etcétera.

Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x) es necesario emplear un líquido

denominado aceite de inmersión, que se añade entre el objetivo y la muestra. Esto es debido a
que la refracción de la luz es alta en el aire y provoca alteraciones en la imagen que se
manifiestan cuando se usan objetivos con esta capacidad de aumento. El aceite de inmersión
reduce enormemente esta refracción permitiendo imágenes mucho más nítidas.

Fig. 2: Imágenes resultantes del uso de objetivos con diferentes aumentos (especificados en
las imágenes) al observar un epitelio estratificado plano queratinizado.

Platina. Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un

dispositivo para sujetar el portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la platina,
movimiento controlado manualmente.

Condensador. Es un dispositivo con una lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la
fuente sobre la sección de tejido.

Diafragma. Se sitúa entre la fuente luminosa y el condensador. Permite aumentar el contraste

de la muestra y la profundidad de campo, es decir, el espesor de la muestra que está enfocada.

Lámpara luminosa. Es la que proporciona la luz que atraviesa la sección de tejido.

Inicialmente se usaba la luz natural, la cual se podía concentrar en la sección de tejido
mediante espejos cóncavos. Actualmente se usa una lámpara cuyo haz de luz atraviesa el
diafragma, el condensador, la muestra, y tras ello penetra por el objetivo y atraviesa los
oculares hasta nuestros ojos. La intensidad de la fuente luminosa se puede regular mediante
un reóstato.
Fig. 3. Recorrido de la luz desde la fuente, pasando a través de los diferentes lentes de un
microscopio compuesto, hasta el observador.

Macrométrico y micrométrico. El enfoque de la muestra se consigue variando la distancia de

la muestra a la lente del objetivo. Esta distancia depende de los aumentos que produzca el
objetivo, mayor distancia cuanto menores aumentos, y del tipo de objetivo. La distancia se
controla mediante dos ruedas denominadas macrométrico y micrométrico, respectivamente. La
primera permite movimientos ascendentes y descendentes amplios de la platina y la segunda
ajustes finos.

Hay muchos tipos de microscopios, y pueden agruparse de diferentes maneras. Una de ellas
es describir el método que utiliza un instrumento para interactuar con una muestra y producir
imágenes, ya sea enviando un haz de luz o electrones a través de una muestra en su
trayectoria óptica, detectando las emisiones de fotones de una muestra, o escaneando a través
y a corta distancia de la superficie de una muestra utilizando una sonda. El microscopio más
común (y el primero que se inventó) es el microscopio óptico, que utiliza lentes para refractar la
luz visible que pasa a través de una muestra finamente seccionada para producir una imagen
observable. Otros tipos importantes de microscopios son:

● Microscopio simple ● Microscopio de iones en campo

● Microscopio óptico ● Microscopio de sonda de barrido
● Microscopio estereoscópico ● Microscopio de efecto túnel
● Microscopio de luz ultravioleta ● Microscopio de fuerza atómica
● Microscopio electrónico ● Microscopio virtual
● Microscopio de campo oscuro ● Estereomicroscopio
● Microscopio de contraste de fases ● Microscopio compuesto
● Microscopio confocal
Tabla 1. Tipos de microscopios.

Microscopía de fluorescencia

Los desarrollos más recientes del microscopio de luz se centran en gran medida en el auge de la
microscopía de fluorescencia en biología. Durante las últimas décadas del siglo XX, especialmente
en la era postgenómica, se desarrollaron muchas técnicas para la tinción fluorescente de las
estructuras celulares. Los principales grupos de técnicas implican la tinción química dirigida de
estructuras celulares concretas, por ejemplo, el compuesto químico DAPI para marcar el ADN, el
uso de anticuerpos conjugados con reporteros fluorescentes, la inmunofluorescencia, y las
proteínas fluorescentes, como la proteína verde fluorescente. Estas técnicas utilizan estos
diferentes fluoróforos para el análisis de la estructura celular a nivel molecular tanto en muestras
vivas como fijas.

Fig. 4: Microscopía de fluorescencia y microfotografía donde se muestra el uso de diferentes

marcadores fluorescentes y su unión a diferentes partes de la célula.
 Microscopía electrónica

Un microscopio electrónico usa electrones en lugar de fotones o luz visible para formar
imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar
amplificaciones mayores antes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud
de onda de los electrones es bastante menor que la de los fotones.

Un microscopio electrónico de transmisión de barrido ha logrado una resolución superior a 50

pm en el modo imágenes anulares de campo oscuro y ampliación de hasta aproximadamente
10 000 000 x mientras que la mayoría de los microscopios ópticos están limitados por difracción
a una resolución de aproximadamente 200 nm y ampliaciones útiles por debajo de 2 000 x. Los
microscopios electrónicos utilizan campos magnéticos moldeados para formar sistemas de
lentes ópticas electrónicas que son análogas a las lentes de vidrio de un microscopio de luz
óptica.

Fig. 5: Reproducción de uno de los primeros microscopios electrónicos construidos por Ernst Ruska
y microfotografía electrónica de barrido de una mitocondria y de transmisión de una hoja de papel.

Microscopía de luz ultravioleta

La imagen en el microscopio de luz ultravioleta (UV) depende de la absorción de esa luz por las
moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm,
por lo tanto puede alcanzar una resolución de 100 nm. La microscopía UV no es muy diferente
del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías.
La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta
puede dañar la retina. El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen
determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se
puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el ADN y el ARN de cada
célula.

El microscopio de luz UV utiliza el rango UV del espectro luminoso en lugar del rango visible,
bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle
absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda UV. Dado que el vidrio no
transmite las longitudes de onda más cortas de la luz ultravioleta, los elementos ópticos de
estos microscopios están hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos iluminados.
Además, dado que la radiación UV es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia, en
fotografía o con un escáner electrónico.

Fig. 6: Microscopía de luz UV y observación de estructuras

Microscopía de contraste de fases

El microscopio de contraste de fases es un tipo de microscopio que permite observar muestras

vivas sin necesidad de usar técnicas de tinción. La principal dificultad en la observación de
células vivas es que estas son prácticamente transparentes. Por esto, si se miran a través de
un microscopio convencional con luz transmitida resulta muy difícil o incluso imposible observar
sus detalles y estructuras microscópicas.

Fig. 7: Microscopio de contraste de fases y observación de hongos unicelulares.

La solución habitual a este problema ha sido utilizar técnicas de tinción. Esto implica la adición
de algún tipo de colorante junto con la muestra que permite aumentar el contraste de los
detalles que se quieren observar. Existen distintos colorantes y métodos de tinción adecuados
para distintos tipos de observaciones.

El problema en la utilización de colorantes es que muchas veces su adición es incompatible

con la vida de las células. Por esto, si bien son adecuados para observar células muertas, su
uso es muchas veces limitado cuando se quieren mantener las células con vida.

Para este tipo de observaciones existe el microscopio de contraste de fases. Este microscopio
manipula la luz de tal forma que es posible aumentar el contraste de la muestra observada. De
este modo es posible observar estructuras que son invisibles a través de un microscopio
convencional.

El microscopio de contraste de fases es un instrumento para poder observar todo tipo de

muestras vivas (células, microorganismos, tejidos, …) sin necesidad de utilizar colorantes. La
invención de este microscopio resultó en grandes avances en el campo de la biología ya que
permitió la observación de procesos biológicos desconocidos hasta el momento.

En este artículo encontrarás una explicación básica de la naturaleza de las ondas de luz,
necesaria para entender el funcionamiento del microscopio de contraste de fases. A
continuación encontrarás también la definición de las principales partes de este tipo de
microscopio así como una breve historia de su invención.

Microscopía de fuerza atómica

El microscopio de fuerza atómica es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas

del orden de los nanonewtons. Al rastrear una muestra, es capaz de registrar continuamente su
topografía mediante una sonda o punta afilada de forma piramidal o cónica. La sonda va
acoplada a un listón o palanca microscópica muy flexible de sólo unos 200 µm.

El microscopio de fuerza atómica ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnología, para la

caracterización y visualización de muestras a dimensiones nanométricas.
Fig. 8: Microscopio de fuerza atómica y su uso en el área de los materiales.

Microscopía de rayos X

Un microscopio de rayos X utiliza radiación electromagnética en la banda de rayos X para

producir imágenes ampliadas de objetos. Dado que los rayos X penetran en la mayoría de los
objetos, no es necesario prepararlos especialmente para observaciones con microscopía de
rayos X.

Fig. 9: Una imagen de microscopía de rayos X de una planta de canola viva de 10 días.
A diferencia de la luz visible , los rayos X no se reflejan ni refractan fácilmente y son invisibles
para el ojo humano. Por lo tanto, un microscopio de rayos X expone una película o utiliza un
detector de dispositivo de carga acoplado para detectar los rayos X que atraviesan la muestra.
Es una tecnología de imágenes de contraste que utiliza la diferencia en la absorción de rayos X
suaves en la región de la ventana de agua (longitudes de onda: 2,34–4,4 nm, energías:
280–530 eV) por el átomo de carbono (elemento principal que compone la célula viva) y el
átomo de oxígeno (un elemento del agua).

Los rayos X con microenfoque también consiguen un gran aumento mediante proyección. Un
tubo de rayos X de microfoco produce rayos X desde un punto focal extremadamente pequeño
(de 5 μm a 0,1 μm). Los rayos X se encuentran en el rango de rayos X más convencional (20 a
300 keV) y no se reenfocan.

Morfología celular

Hasta cierto punto, la forma y el tamaño de las bacterias están en relación con el género e
incluso, a veces, con una especie en concreto. Por otra parte, debido a su pequeño tamaño, es
preciso recurrir a instrumentos para su observación, los microscopios, y a métodos especiales
para visualizarlas.

Fig. 10: Algunas formas que los microorganismos pueden adoptar.

La forma de las bacterias depende de la pared celular, que les proporciona elasticidad y al
mismo tiempo rigidez. Estos microorganismos se presentan habitualmente como elementos
esféricos, conocidos como cocos, alargados, denominados bacilos, e incurvados.

Esta forma puede variar debido a distintas circunstancias exógenas, como la antigüedad del
cultivo, factores nutricionales, tratamiento con antibióticos, etc.; por otra parte, a las bacterias
que tienen deficiencias en su pared o carecen de ella, como los micoplasmas, los cambios
ambientales les afectan con mayor intensidad, por lo que no puede decirse que tengan un
aspecto determinado. En un caso u otro, a las bacterias que modifican de forma se les
denominan pleomorfas y al fenómeno, pleomorfismo.

Cocos: Su forma habitual es redondeada; sin embargo, a veces hay excepciones y aparecen
ligeramente ovoides, con un lado aplanado (con aspecto de riñón o reniformes) o con un
extremo afilado (lanceolados). En cuanto a las agrupaciones, pueden ser de dos en dos
(diplococos), de cuatro en cuatro (tétradas), en cadenas (estreptococos), en racimos
(estafilococos) o en forma de cubos (sarcinas).

Bacilos: Su forma habitual es redondeada; sin embargo, a veces hay excepciones y aparecen
ligeramente ovoides, con un lado aplanado (con aspecto de riñón o reniformes) o con un
extremo afilado (lanceolados). En cuanto a las agrupaciones, pueden ser de dos en dos
(diplococos), de cuatro en cuatro (tétradas), en cadenas (estreptococos), en racimos
(estafilococos) o en forma de cubos (sarcinas)

Exámenes tintoriales

Con el uso de los colorantes se pretende conseguir que los microorganismos contrastan
nítidamente con el medio que los rodea, destacar características diferenciales de los mismos o
incluso observar elementos estructurales. Se pueden efectuar tinciones con colorantes vitales
que colorean células vivas, aunque es más común realizar la tinción tras la fijación de la
muestra al porta. Este es un proceso por el cual casi siempre se produce la muerte de las
bacterias. La fijación se suele realizar por calor (la coagulación de las proteínas las fija al
cristal) y menos frecuentemente con compuestos químicos (p. ej., glutaraldehído o
formaldehído). La observación se realiza normalmente con objetivo 100x y aceite de inmersión.
Como ocurre para el examen en fresco, la muestra será una gota del producto patológico o del
medio líquido, o una suspensión bacteriana en solución salina isotónica. Existen varios tipos de
tinciones: simples, diferenciales o compuestas, específicas, de fluorescencia y otras

Tinción de Gram. Permite distinguir, en función de las características estructurales de su

pared, entre los dos grandes grupos de bacterias, grampositivas y gramnegativas. Se inicia
fijando la muestra por calor y se añade un colorante, el cristal violeta, que tiñe todas las
bacterias del medio.

Tras ello se fuerza la coloración con un mordiente de yodo. Si se parase la tinción en ese
momento, todas las bacterias aparecerían de color violeta. A continuación, se usa un
decolorante, alcohol acetona, que hará perder el cristal violeta a las gramnegativas. En ese
instante, las grampositivas siguen de color violeta, pero las gramnegativas no se ven al no estar
coloreadas. Para visualizar éstas se usa el colorante de contraste, generalmente safranina o
fucsina, que las tiñe de rojo. De esta forma, finalmente, las bacterias grampositivas quedarán
teñidas de violeta y las gramnegativas de rojo. Sin duda es la tinción más utilizada en
microbiología, y, en muchos casos, se usa como el primer paso del diagnóstico directo

Material:
1)Microscopio óptico.
2) Objetivos de observación (4X, 10X, 40X y 100X)
3) Laminillas de E. coli y C. albicans

Tecnica o método:

1) Ensamblar el microscopio
● Conoce los componentes del microscopio.
● Coloca el microscopio sobre una superficie limpia y plana.
● Ten el manual del microscopio a la mano.

2) Preparar los portaobjetos

● Lávate las manos antes de comenzar
● Ten a la mano un paño sin pelusas para limpiar y tocar los portaobjetos.
● Utiliza portaobjetos preparados.
● Coloca el portaobjetos en la plataforma del microscopio.
● Fija el portaobjetos en su lugar utilizando los dos broches de la plataforma.
● Enciende el microscopio.

3) Enfocar el microscopio
● Ajusta el ocular en caso de que tengas un microscopio binocular.
● Ajusta el diafragma a su abertura máxima.
● Comienza a enfocarte en el objetivo de menor ampliación.
● Si es necesario, mueve el portaobjetos para centrarlo en la plataforma.
● Enfoca el portaobjetos con la ayuda de las perillas de ajuste y el diafragma.
● Amplía la imagen con un objetivo más alto.
● Ponle un forro al microscopio cuando lo guardes.
https://es.wikihow.com/usar-un-microscopio

Resultados:
Fig. 1: Observación microscopicas con objetivo de inmersión 100X de Escherichia coli.

Tabla 1. Resultados obtenidos de la observación de uno de los po

Nombre Escherichia coli Abreviación E. coli

Morfología Bacilos Otro Aislados

Tinción de Gram Positivo (+) Color Rosa

Fig. 2: Observación microscopicas con objetivo de inmersión 100X de Candida albicans.

Tabla 2. Resultados obtenidos de la observación de uno de las laminillas

Nombre Candida albicans Abreviación C. albicans

Morfología Cocos Otro Agrupados

Tinción de Gram Negativo (-) Color Azul violeta

Discusión de resultados y conclusiones:

La forma de las bacterias depende con frecuencia del género e incluso de la especie. En
ocasiones, la morfología puede variar según las condiciones del medio en el que se
desarrollen.
Las bacterias se presentan como cocos (redondeadas), bacilos (alargadas). En casi todos los
casos pueden aparecer aisladas o en agrupaciones, siendo las más comunes las que forman
los cocos: diplococos, cadenas, racimos, sarcinas o tétradas. El pequeño tamaño de las
bacterias exige para su observación el uso de aparatos que se conocen como microscopios.
Existen diversos tipos entre los que se encuentran los ópticos compuestos: de fondo claro, de
fondo oscuro, de contraste de fases y de fluorescencia. Para visualizar microorganismos o
estructuras menores que las bacterias se emplean los microscopios electrónicos. La
observación de las bacterias con el microscopio se realiza en fresco o recurriendo al empleo de
tinciones que facilitan su visualización y la de sus estructuras y permiten distinguir entre los
distintos tipos bacterianos.

Bibliografia:

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Editorial McGrawHill.
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