Cinética enzimática
Modelo general de enzima
Modelo llave-cerradura
Tendremos a la enzima en si y al sustrato que es
la molécula que le permite actuar a la enzima,
este sustrato se unirá al sitio activo de la enzima
(sitio especifico). Este sustrato se unirá a grupos
específicos que están ordenados espacialmente
lo cual conforma al sitio activo.
Cuando el sustrato se une a la enzima, dará paso
a la formación complejo enzima sustrato, cuando
esto ocurra posteriormente la enzima catalizara
la reacción enzimática y se genere el producto, el
producto se liberará y la enzima vuelve a su
estado inactivo.
En términos energéticos, cuando se quiere
“pasar” de un sustrato a un producto estos están
en niveles diferentes de energía.
Para que esto ocurra, es decir, llevar al sustrato
al estado de energía de producto, debemos
agregar una energía para llevar al sustrato a un
estado de transición y luego de este estado se
puede ir a los productos.
La energía que necesitamos para llevar al estado
energético del sustrato a estado de transición y
posteriormente llegar al producto se llamará
ENERGÍA DE ACTIVACIÓN, esto ocurre cuando
no está presente ninguna enzima.
Cuando la enzima está presente y se forma el
complejo enzima-sustrato esta energía de
activación va a disminuir, de esta forma puedo
pasar mucho mas rápido de estado energético de
sustrato a estado energético de los productos y
por tanto, la velocidad de reacción va a aumentar
(será más rápida).
¿Qué pasa cuando la enzima actúa sobre los
sustratos en términos cinéticos?
Es decir, que le pasa a la velocidad de reacción
cuando cambian las concentraciones de ese
sustrato.
La manera más común es midiendo la velocidad
de la reacción, lo que se hace básicamente, es
agregar una cantidad fija de enzima, y cantidades
variables de sustrato en diferentes tubos, en
cada uno de estos medimos la velocidad inicial,
la cual corresponde a tomar la cantidad de
producto generado en un tiempo determinado
para luego calcular la velocidad de la reacción.
Lo que se hará es tomar la concentración de
sustrato de cada tubo y se graficara con la
velocidad de reacción de cada tubo.
Cuando se realiza eso obtendremos la grafica de
MICHAELIS-MENTEN; inicialmente la velocidad
de reacción crece conjuntamente con la
concentración de sustrato pero luego hay un
punto en que esta velocidad deja de crecer, es
decir, alcanza un valor máximo. Lo que pasa aquí
es lo que se refleja del complejo enzima-sustrato
Hay dos reacciones, la reacción en la que el
sustrato se une a la enzima para formar el
complejo enzima sustrato y luego la reacción en
que ese complejo enzima sustrato libera al
producto, estas reacciones están en equilibrio, es
decir, son reversibles (en ambos sentidos), este
sentido va a depender de la concentración de
cada una de las especies que esta presente
durante las dos reacciones.
Una enzima esta presente de dos formas, una
cuando esta no esta unida al sustrato y otra
cuando se encuentra formando el complejo
enzima-sustrato.
Cuando se aumenta la cantidad de sustrato lo
que sucederá es que el equilibrio se desplazará a
formación del complejo enzima sustrato y a su
vez cuando la concentración de este complejo
aumente, el equilibrio se desplazará a la
formación del producto.
Como se mide la velocidad de la reacción en
términos de ese producto, vemos que la
concentración de sustrato aumenta y a su vez la
velocidad de reacción, estos lo hacen de manera
proporcional.
Sin embargo hay un punto en que se llega a un
valor de concentración de sustrato en el cual casi
toda la enzima esta en complejo enzima-sustrato,
en este punto casi toda la enzima esta ocupada
produciendo producto, por lo que si en este
momento aumenta la cantidad de sustrato, es
irrelevante para la formación de producto ya que
este no aumentará, este punto se llama
Velocidad máxima de la reacción (Vmax).
Se utilizará la siguiente ecuación:
Vo= Vmax [S]
Km + [S]
Permite calcular el comportamiento de la
velocidad inicial VS la concentración de sustrato
Además de dos parámetros
Vmax (velocidad máxima) y Km (constante
de Michaelis)
Estos dos valores tienen una posición
especifica en la grafica de velocidad vs
concentración de sustrato.
Vmax: Se ubica donde la grafica toma un valor
relativamente constante
Km: Se puede deducir a partir de la ecuación de
michaelis menten pero este valor está a la mitad
de la velocidad máxima
Es decir, determino la velocidad máxima, me voy
a la mitad y posteriormente extrapolo al valor de
concentración de sustrato.
El valor de la Km es inversamente
proporcional al valor de la Vmax, es decir,
para las enzimas que tienen un valor de Km
mas bajo, su crecimiento será mucho mas
rápido (Vmax). Si el km es constante y la
Vmax variable será mucho mas rapida la
enzima que tiene mayor Vmax
La relación entre la velocidad máxima y el
crecimiento de la velocidad inicial con
respecto a la concentración del sustrato es
directamente proporcional, es decir, cuando
tengo una Vmax mas alta el crecimiento será
más alto.
Cuando se comparan enzimas y una tiene mayor
Vmax, quiere decir que la enzima tiene una
tendencia a reaccionar mucho más rápido con los
sustratos evaluados a diferencia de la otra
enzima.
Km: Afinidad de la enzima por el sustrato
Vmax: esta directamente relacionada con el
numero de sitios activos de la enzima cuando se
esta evaluando con determinado sustrato
Grafica sigmoidea
NO TODAS LAS ENZIMAS SIGUEN ESTOS
PASOS
Calcular Km y Vmax
Se hacen a partir de resultados experimentales
además donde debe variar la concentración de
sustrato y se evalúa la velocidad inicial
manteniendo constante la cantidad de enzima.
Se grafican los datos, velocidad inicial vs
concentración de sustrato.
Método 1
Se debe tomar el valor de velocidad de
reacción mas alto (Vo); se debe asumir que
ese valor va a corresponder a la velocidad
máxima de la enzima Vmax
EJ: Vo mas alto; 0,49
Vmax: 0,49 umol/min
Seguiremos lo dicho anteriormente; la Km
esta a la mitad de la Vmax y seguiremos la
siguiente ecuación.
Km = Vmax/2
E; Km= 0,49:2= 0,245 mM
Se hará una línea recta que se lleve hasta la
curva para graficar este punto, luego se
trazara una línea hacia abajo
perpendicularmente hasta tocar el eje donde
esta la concentración de sustrato y este
punto va a corresponder al valor de Km.
Método de Lineweaver-Burk
1 :Vo=km:Vmax 1: S+ 1:Vmax
Se graficará el inverso de la velocidad de
reacción con el inverso de la concentración de
sustrato, se obtendrá una recta.
Y= 1/Vo
X= 1/S
m=Km/Vmax
Intercepto con el eje Y va a ser el inverso de
la velocidad maxima
Método 2
Tomar los valores para luego graficarlos,
luego debemos trazar una línea donde este
mas cercana a todos los puntos del grafico
(equidistante)
Proyectar esa línea hasta que toque el eje Y
con el eje X.
Tomar las intersecciones de la línea con el
eje X e Y
El punto de intersección con el eje Y va a ser
el reciproco de la velocidad de reacción: 1/Vo
y asi dividirlo
Con el eje x obtendremos un valor negativo y
la formula a realizar seria: -1/Km (unidades)
mM -1, resultado es en mM
Método 3
Pendiente
Se debe obtener mediante la diferencia de
la velocidad de reacción del ultimo
experimento menos la velocidad de
reacción del primer experimento dividido en
la diferencia de la cantidad de sustrato del
ultimo experimento menos la cantidad de
sustrato del primer experimento. (mM2)
Luego debemos calcular el intersecto de la
recta con el eje Y y es el
?= Y – mx; La y menos la pendiente por X
s/mM
Inhibiciones reversibles
1. Competitiva: Sustrato e inhibidor compiten
por llegar al sitio activo; Vmax es constante y
la Km aumenta. Esto pasa porque la Km en
si es la afinidad de unión al sustrato, al
ponerle un inhibidor esta afinidad se verá
disminuida, como la afinidad es inversamente
proporcional a la Km, si tenemos baja
afinidad mi Km será mayor y si tenemos alta
afinidad mi Km será menor. El sustrato e
inhibidor tienen estructuras similares por ello
luchan por llegar al sitio activo.
2. No competitiva (mixta): Km se mantendrá
igual y la velocidad máxima va a disminuir; El
inhibidor no se parece al sustrato y se une a
un sitio diferente del sitio activo; hay un sitio
activo para inhibidor y sustrato
[Link]: Disminuyen ambos factores
Km y Vmax; ambas disminuyen; no se
parecen entre sustrato e inhibidor y se une a
un sitio activo diferente
