CURSO:
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
INFORME:
DISEÑO DE PCR
PROFESORES:
José Luis Buleje Sono
José Chou Luy
TRABAJO GRUPAL
GRUPO 3
INTEGRANTES:
Meza Cerrón, Andrea Haness
De La Cerna Medina , Diego
1. INTRODUCCIÓN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR , es una técnica de biología
molecular que revolucionó la investigación científica, el diagnóstico médico y
la genética desde su desarrollo en la década de 1980.
La PCR permite amplificar secuencias específicas de ADN de manera
exponencial, lo que ha ampliado las posibilidades de investigación y
aplicaciones en diversas áreas.
Esta se basa en la enzima DNA polimerasa, que puede sintetizar una cadena
complementaria de ADN utilizando una cadena de ADN molde y fragmentos de
ADN llamados primers. La técnica implica ciclos repetidos de tres etapas
fundamentales:
1) Denaturación: La muestra se calienta a una temperatura elevada
(generalmente entre 94-98 °C), lo que rompe los puentes de hidrógeno y
desnaturaliza la doble hélice de ADN, separando las dos cadenas.
2) Alineación : La temperatura se reduce a una zona de alineación
(aproximadamente 50-65 °C), lo que permite que los primers se unan a sus
secuencias complementarias en el ADN molde.
3) Extensión: La temperatura se ajusta para que esté en la zona de extensión
(alrededor de 72-75 °C), y la DNA polimerasa sintetiza una nueva cadena de
ADN complementaria utilizando los nucleótidos presentes en la reacción.
Usos:
- Detección y cuantificación de DNA viral o bacteriano.
- Diagnóstico de enfermedades genéticas.
- Clonación de genes.
- Medicina forense.
- Investigación genética.
Ventajas:
- Alta sensibilidad y especificidad.
- Puede amplificar trazas de DNA.
- Simple y rápida.
2. OBJETIVOS
❖ Comprender los principios de la reacción en cadena de la polimerasa ( PCR )
mediante una simulación.
❖ Comprender los factores experimentales que afectan la pureza y el
rendimiento de la reacción en cadena de la polimerasa.
3. EXPERIMENTO
3.1. MATERIALES:
1. Hacemos uso del simulador http://virtual-pcr.ico2s.org/
3.2. PROCEDIMIENTO:
1. Ingresamos a la página http://virtual-pcr.ico2s.org/
2. Seleccionamos PCR y registramos nuestro nombre
3. Seguimos las instrucciones:
Tus cebadores de PCR han llegado y te diriges al laboratorio para clonar tu gen. Los
cebadores que ha diseñado deben amplificar su gen diana de 1 kb y afortunadamente el
Prof. E. M. Eritus le ha enviado el gen ya clonado en un plásmido. Desgraciadamente, el Prof.
E. M. Eritus es un poco de la
vieja escuela, y no hay no hay métodos de ensamblaje estándar que flanqueen el gen para
que usted los aproveche de. Por lo tanto, ha incluido los sitios de restricción relevantes para
clonación posterior en los cebadores y, mientras espera sus cebadores, han preparado el
plásmido del Prof. Eritus. Todo lo que necesitas hacer es amplificarlo, moverte en tu vector
de expresión favorito y puedes pasar a
algún vector real trabajo.
Tiene acceso a dos polimerasas en el laboratorio. La polimerasa estándar NEB Taq, y
Phusion polimerasa. Cada uno viene con su propio búfer, y instrucciones ligeramente
diferentes para ejecutar la PCR. Las secuencias de cebadores son las siguientes:
Imprimadores para amplificar un fragmento de 1 kb de un plásmido de 5 kb.
4. Realizamos los siguientes experimentos:
3.3. RESULTADOS:
PCR
Taq 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Rendimiento 0.1 0.4 0 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1
Pureza (%) 10.8 17.3 0.1 12.3 10.2 10 11.8 12.1 9.7 14..4 7.9 11.7 11.5
Tiempo(min) 20 26.7 20 22.5 20 20 21.2 20 20 20 20 20 20
Phusion 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Rendimiento 0.2 0.6 0.0 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.1 0.2
Pureza (%) 13.6 21.9 0.9 19.0 13.3 13.1 14.1 14.1 12.6 15.6 10.2 14.3 14.0
Tiempo(min) 20 26.7 20 22.5 20 20 21.2 20 20 20 20 20 20
qPCR
Taq 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Rendimiento 0.1 0.4 0.0 0.2 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2
Pureza (%) 10.8 17.3 0.1 11.9 10.9 10.1 11.8 12.0 9.5 14.8 8.4 11.1 11.6
Tiempo(min) 20 26.7 20 22.5 20 20 21.2 20 20 20 20 20 20
Nuestro experimento
Número de ciclos 15
PCR Taq Phusion
Temperatura de desnaturalización 95 °C
Rendimiento 0.7 8.9
Tiempo de desnaturalización 10
Pureza (%) 14.8 47.7
Temperatura de recocido 55°C
Tiempo(min) 20 20
Tiempo de recocido 10
temperatura de extensión 72°C
tiempo de prórroga 20
qPCR Taq Phusion
Concentración de dNTP 1
Rendimiento 1.0 9.4
concentración de Primers 1
Pureza (%) 17.6 48.4
Masa de plásmido 50
Tiempo(min) 20 20
concentración de polimerasa U 1
polimerasa tipo: Phusion o Taq Taq
Pusimos las temperaturas que están en el rango normal de los indicadores y estos
fueron nuestros resultados.
4. CONCLUSIÓN
El tiempo promedio tanto en PCR , fusión y qPCR no varía mucho, casi siempre se
mantuvo en 20 minutos
En el PCR la reacción que tiene mayor porcentaje de pureza es la reacción 2, esto
debido a que es el único que tiene mayor número de ciclos ( 25).
En la reacción 3 del PCR se aprecia que en cuanto a rendimiento es nulo, y es que a
diferencia de las demás reacciones, esta es la única que se le puse una temperatura
de desnaturalización de 90 grados, esto también se aprecia en la fusión y qPCR.
Tanto en PCR, Fusión y qPCR el rendimiento de las reacciones estuvieron muy
parejas.
5. CUESTIONARIO
1. Explique las características y función biológica de los componentes que se
emplean en el PCR.
La PCR es una técnica de biología molecular que amplifica secuencias de ADN
específicas. Utiliza componentes clave, como el ADN molde, primers, DNA
polimerasa, nucleótidos, buffer de reacción y MgCl2, para llevar a cabo la
amplificación. Los primers se unen al ADN molde, la DNA polimerasa sintetiza
nuevas cadenas de ADN complementarias, y los nucleótidos proporcionan los
bloques de construcción. El buffer de reacción mantiene condiciones óptimas, y el
Mg^2+ activa la DNA polimerasa. La PCR es fundamental en genética, medicina
forense y detección de enfermedades.
2. Explique la función del análisis de electroforesis.
En la electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, se aplica una corriente
eléctrica a través de un gel, y las moléculas de ADN o ARN se mueven a través del
gel en función de su carga y tamaño. Las moléculas más pequeñas se desplazan
más rápido que las más grandes, lo que permite separar y fraccionar fragmentos
de ADN o ARN. Esto es esencial en aplicaciones como la preparación de muestras
para secuenciación de ADN, análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
genotipado.
Es utilizada para separar proteínas en función de su tamaño y carga. Las proteínas
se tiñen con un agente de tinción que permite su visualización después de la
separación. Este análisis es fundamental en la caracterización de proteínas y en la
determinación de su pureza y concentración.
La electroforesis tambien se utiliza para separar enzimas y evaluar su pureza y
actividad.
3. ¿Qué factor o factores aumentaron la producción y la pureza del PCR?
Los factores que influyen son el diseño apropiado de los cebadores, la calidad y
concentración del ADN, la concentración de magnesio, el tipo y la cantidad de ADN
polimerasa y el programa de amplificación.
4. ¿Cuál es la diferencia entre el PCR y el qPCR? Explique
PCR (Reacción en Cadena de la qPCR(PCR en tiempo real o PCR
Polimerasa cuantitativa)
➔ Es una técnica que se utiliza para ➔ Cuantifica la cantidad de una
amplificar y producir múltiples secuencia de ADN o ARN
copias de una secuencia de ADN específica en una muestra, lo que
específica con el propósito de lo hace especialmente útil en
preparar muestras para aplicaciones de expresión génica,
secuenciación, análisis de detección de patógenos,
restricción, genotipado y otras cuantificación de copias de
aplicaciones. genes y más
➔ Su resultado principal es la ➔ La detección se lleva a cabo en
generación de más ADN de la tiempo real durante la
región de interés. amplificación. Se utilizan sondas
➔ La detección de productos se o colorantes fluorescentes que
realiza generalmente después de emiten señales a medida que la
la amplificación, mediante amplificación progresa. Esto
electroforesis en gel, tinción con permite la medición continua de
agentes de tinción como el la cantidad de productos
bromuro de etidio, o técnicas amplificados y la generación de
similares. Esto proporciona una curva de amplificación. La
información cualitativa sobre la cuantificación se realiza
presencia o ausencia de la comparando los datos de la
secuencia amplificada muestra con una curva estándar.
➔ Tiene un rango de detección ➔ El qPCR es altamente sensible y
limitado y generalmente es permite la cuantificación precisa
menos sensible que el qPCR en de cantidades de ADN o ARN en
términos de cuantificación. No es un rango más amplio, desde
adecuado para mediciones algunas pocas copias hasta miles
precisas de cantidades de ADN o de copias. Esto lo hace ideal para
ARN en muestras. aplicaciones que requieren alta
sensibilidad y precisión
5. ¿Cuál es la función de una termociclador en el PCR?
Su función principal es controlar y regular los cambios de temperatura durante el
proceso de PCR, que consiste en ciclos de calor y enfriamiento para amplificar
secuencias de ADN específicas. A continuación, se describen las funciones clave de
un termociclador en el PCR:
I. En el primer paso de cada ciclo, el termociclador eleva la temperatura a una
zona de desnaturalización, generalmente alrededor de 94-98 °C. Esta alta
temperatura rompe los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos
cadenas de ADN, desenrollando la doble hélice y separando las cadenas.
II. En el segundo paso, la
temperatura se reduce a una
zona de alineación, que suele
estar entre 50-65 °C. En esta
etapa, se permite que los primers
se anclen a sus secuencias
complementarias en el ADN
molde.
III. En el tercer paso, la temperatura
se ajusta para que esté en la zona
de extensión, generalmente entre
72-75 °C. En esta etapa, la enzima
DNA polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la
cadena molde utilizando los nucleótidos presentes en la reacción. La
temperatura elevada ayuda a la DNA polimerasa a trabajar de manera
óptima.
IV. El termociclador repite estos tres pasos (denaturación, alineación y
extensión) durante un número específico de ciclos, generalmente entre 20 y
40, dependiendo de la aplicación. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN
objetivo, lo que resulta en una amplificación exponencial de la secuencia
deseada.
V. Después de completar el número programado de ciclos, el termociclador
suele mantener la reacción a una temperatura de conservación
(generalmente 4-10 °C) para mantener las muestras hasta que sean recogidas
o procesadas.
6. ¿Cuáles son las aplicaciones del uso del PCR?
Algunas de las aplicaciones más comunes del PCR son:
Diagnóstico de enfermedades El PCR se utiliza para detectar la presencia de
infecciosas agentes infecciosos como virus, bacterias y
hongos en muestras clínicas, lo que es esencial
para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas, incluyendo el VIH, la hepatitis,
enfermedades respiratorias y enfermedades de
transmisión sexual.
Perfil genético y pruebas de Para amplificar y analizar marcadores
paternidad genéticos, como STRs (microsatélites cortos en
tándem), para la identificación de individuos y
la determinación de relaciones familiares.
Investigación genética Se emplea para amplificar fragmentos de ADN
específicos, lo que permite la secuenciación de
genes, la identificación de mutaciones
genéticas, el análisis de expresión génica y la
investigación de la variabilidad genética en
poblaciones.
Biología molecular y En investigación científica, el PCR se usa para
microbiología clonar genes, estudiar la expresión génica,
analizar la estructura y función de proteínas, y
realizar análisis de diversidad microbiana.
Terapia génica Se utiliza para la identificación de dianas
terapéuticas y el monitoreo de la respuesta a
tratamientos médicos.
Detección de mutaciones Se utiliza para identificar mutaciones genéticas
causantes de enfermedades hereditarias, lo
que es fundamental para el asesoramiento
genético.
REFERENCIAS
● Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). (2016, 13 septiembre). Conogasi.
https://conogasi.org/articulos/reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-pcr-2/#:~:text=dNTPs%3A%20son%20nuc
le%C3%B3tidos%20que%20sirven,aparato%20que%20automatiza%20la%20PCR.
. ● Khanacademy.org. [citado el 28 de octubre de 2023]. Disponible en:
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/
a/polymerase-chain-reaction-pcr
● Reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Genome.gov. NHGRI; 2019 [citado el 28 de
octubre de 2023]. Disponible en:
https://www.genome.gov/es/about-genomics/fact-sheets/Reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa
● Bing.com. [citado el 28 de octubre de 2023]. Disponible en:
https://www.bing.com/search?q=reacción+cadena+polimerasa&form=ANNTH1&refig=df967
6b52dd64502be0c15f46196e74c&pc=HCTS&sp=1&lq=0&qs=OS&pq=reaccion+cadena+po
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