Tema 2.

Técnicas basadas en
reacciones antígeno-anticuerpo
secundarias
1. Las técnicas secundarias
Las técnicas secundarias no valoran directamente los complejos inmunes, sino que lo hacen de
forma indirecta, atendiendo a los cambios físicos visibles que se producen en el medio. Las
uniones antígeno-anticuerpo pueden producir distintas reacciones, entre las que destacan dos,
que inducen cambios físicos visibles y que constituyen el fundamento de muchas técnicas
secundarias:
➢ Reacciones de aglutinación. Cada anticuerpo puede unirse a varios antígenos, y cada uno
de estos a varios anticuerpos; como consecuencia, se forma una red de antígenos y
anticuerpos que provoca una aglutinación en el medio.
➢ Reacciones de precipitación. Algunas uniones antígeno-anticuerpo son complejos
demasiado grandes para mantenerse en disolución y precipitan en el medio.
Otro grupo de técnicas secundarias lo forman las de fijación del complemento que utilizan los
hematíes como sistema revelador. En este caso lo que se observa en el medio es la lisis de los
hematíes.
2. Técnicas de aglutinación
Las técnicas de aglutinación se basan en la capacidad que tienen los antígenos particulados
multivalentes para unirse a sus anticuerpos
complementarios dando lugar a inmunocomplejos o
agregados visibles a simple vista.
¡Tenlo en cuenta!
Los antígenos multivalentes son los que tienen
varios epítopos o puntos de unión al anticuerpo.
Si tenemos en cuenta las diversas clases de anticuerpos,
IgM es el de mayor poder aglutinante, porque su
estructura es pentamérica, es decir, tiene diez puntos de
unión al antígeno (su valencia es 10). Por eso es el más
eficaz para entrecruzar epítopos dispuestos sobre
partículas próximas.
La aglutinación ocurre cuando las concentraciones de
antígeno y anticuerpo son equivalentes. Si existe
desequilibrio, tanto por exceso de antígeno como por
exceso de anticuerpo, se produce un fenómeno de zona, y
el resultado es un falso negativo.
➢ Si hay exceso de antígeno se bloquean los dos
fragmentos Fab de la molécula de anticuerpo (paratopos)
y se impide que las partículas antigénicas queden unidas
entre sí.
➢ Si hay exceso de anticuerpos se bloquean todos los
puntos de unión del antígeno (epítopos) y, de igual modo,
se impide la agregación de las partículas antigénicas.
Dependiendo de que el antígeno sea particulado o haya necesidad de insolubilizarlo mediante
fijación sobre un soporte (partículas o células), existen dos tipos de reacciones de aglutinación:
directa e indirecta.

Aglutinación Suspensión de bacterias, protozoos, esporas.

directa Suspensión de hematíes (con Ag de grupos sanguíneos): Hemaglutinación
directa.
Aglutinación Suspensión de partículas (bolitas de látex, bentonita, carbón activo) con Ag
indirecta soluble adsorbido.
Suspensión de hematíes sensibilizados con Ag: Hemaglutinación indirecta.

2.1. Técnicas de aglutinación directa

Estas técnicas se basan en detectar la reacción de aglutinación que provoca la formación
de algunos inmunocomplejos.
Se utiliza una suspensión de antígenos formes o particulados (bacterias, protozoos,
esporas), que en sus membranas o paredes celulares expresan los determinantes
antigénicos o epítopos que van a intervenir en la formación de los complejos inmunes.
Cuando esta suspensión antigénica se enfrenta a un
suero problema que contiene anticuerpos frente a esos
epítopos, se producirá la correspondiente aglutinación
por formación de los inmunocomplejos. La lectura es
inmediata, dado que a simple vista se aprecia la
formación de esos agregados insolubles. La forma de
visualizarlos depende del soporte sobre el que se realice
la reacción:
➢ Si se realiza sobre un soporte plano (portaobjetos, tarjeta), la reacción positiva implica
la formación de «grumos», que son los patógenos unidos entre sí por los anticuerpos
específicos formando agregados macroscópicos.
➢ Si se realiza en una placa de microtitulación el positivo se evidencia por la formación
de un velo en la superficie del pocillo correspondiente. Si no hay aglutinación, los
antígenos particulados sedimentan en el fondo de los pocillos, en forma de botón.
Las técnicas de aglutinación pueden ser cualitativas o semicuantitativas si se efectúan
diluciones del suero y se determina el título. El título, como en cualquier otra técnica, es
una medida relativa de la actividad de los anticuerpos.
Las técnicas directas, tanto de aglutinación como de precipitación, se empezaron a utilizar
para identificar bacterias o tipificar eritrocitos, pero debido a su simplicidad y sensibilidad
se comenzaron a aplicar para la identificación de anticuerpos, para el diagnóstico de
procesos infecciosos.
• Prueba rápida de aglutación en placa
Un ejemplo de técnica de aglutinación directa es la
prueba rápida de aglutinación en placa, que utiliza una
suspensión de bacterias del género Brucella teñidas con
rosa de Bengala como antígeno; se emplea para el
diagnóstico de brucelosis. Esta prueba permite,
mediante una sencilla reacción de aglutinación, hallar
anticuerpos específicos frente a Brucella. Se usa solo
como prueba de descarte, porque a menudo se obtienen
resultados falsamente positivos.
 • Hemaglutinación directa
Un tipo especial de aglutinación directa es la hemaglutinación directa. Esta técnica se
aplica a la determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO y Rh.
Aunque se conocen más de cien antígenos de membrana del eritrocito, no todos
desencadenan reacciones de transfusión tan severas como los antígenos mencionados
(ABO y Rh).
➢ Antígenos ABO. Los anticuerpos contra los antígenos ABO son isohemaglutininas
(-iso, de la misma especie), pues los antígenos son de origen humano y se
descubren ordinariamente por una reacción de aglutinación con células de un
tipo ABO conocido.
En otras palabras, el suero que contiene anticuerpos contra los antígenos A y B
hace que se aglutinen los eritrocitos en cuya superficie existen dichos antígenos.
Hay cuatro fenotipos ABO básicos:
▪ Tipo A: eritrocitos con antígenos A.
▪ Tipo B: eritrocitos con antígenos B.
▪ Tipo AB: eritrocitos con antígenos A y B.
▪ Tipo O: eritrocitos sin antígenos A ni B.

A B AB O
Antígenos
sobre los
eritrocitos

Anticuerpos
en el Ninguno
plasma

➢ Antígenos Rh. Los antígenos Rh de los grupos sanguíneos recibieron su nombre

por haberse identificado inicialmente en los eritrocitos del mono Rhesus (Macaca
mulata).
▪ Rh+: los eritrocitos poseen un antígeno denominado Rho o antígeno D. El
antígeno D es el que determina el Rh: las personas con genotipo DD o Dd son
de tipo Rh+.
▪ Rh-: los eritrocitos no poseen el antígeno Rho o antígeno D. Las personas con
genotipo dd son de tipo Rh-.
Para determinar qué antígenos están presentes y, por tanto, a qué grupo sanguíneo
pertenece la sangre, esta se pone en contacto con anticuerpos monoclonales contra
los antígenos A o B, o el Rh, y la aparición de una aglutinación demuestra la existencia
de ese antígeno en los hematíes.
Para la determinación de grupos sanguíneos:
1. Se desinfecta el dedo medio o el lóbulo de la oreja, y se pincha con una lanceta
estéril hasta obtener tres gotas que se colocan separadamente sobre una placa de
vidrio.
2. Se añade una gota de antisuero A sobre la primera gota y se mezcla.
3. Se añade una gota de antisuero Rh sobre la segunda gota y se mezcla.
4. Se añade una gota de antisuero B sobre la tercera gota y se mezcla
 Se observa cada gota para ver si en alguna se ha
producido una reacción de aglutinación. Se puede
ver por debajo de la placa a simple vista, o en caso
de duda, al microscopio.
2.2. Técnicas de aglutinación indirecta
A diferencia de la aglutinación directa, en esta se emplean antígenos inicialmente solubles,
que hay que insolubilizar mediante fijación a un soporte sólido inerte (bolas de látex,
partículas de bentonita, carbón activo o gelatina), o a una célula (eritrocitos). De este
modo se conforma un antígeno particulado (partícula sensibilizada con el antígeno).
Las técnicas más habituales son la aglutinación en látex en placa y la hemaglutinación
indirecta, así como una variante de esta última: la inhibición de la hemaglutinación.
• Aglutinación de látex en placa
Una de las técnicas de aglutinación indirecta que más se usan es la aglutinación de
látex en placa. La reacción positiva se evidencia por la aparición de un moteado
característico, ausente en la reacción negativa. Normalmente, la técnica es cualitativa
con resultado positivo o negativo, pero puede convertirse en semicuantitativa si se
lleva a cabo con diluciones seriadas de un suero.
Las partículas de látex son pequeñas esferas de poliestireno suspendidas en un
tampón sobre las que se pueden unir antígenos o anticuerpos solubles mediante
interacciones hidrofóbicas entre sitios de la proteína y la superficie de poliestireno de
las partículas. Así quedan «sensibilizadas» y se pueden utilizar para la detección de
anticuerpos o antígenos, según el caso. La técnica es muy sencilla y se puede utilizar en
condiciones de campo, mezclando ambos reactivos y efectuando la lectura por
observación de la formación de agregados visibles en los positivos, que hacen que la
suspensión pierda el aspecto lechoso uniforme.
Una reacción de aglutinación en látex de uso frecuente en el laboratorio clínico es la
determinación de anticuerpos antiestreptolisina O (anticuerpos ASO). La estreptolisina
O es una enzima inmunogénica y tóxica
producida por estreptococos β hemolíticos
de los grupos A, C y G. La determinación
de anticuerpos ASO en el suero de un
paciente se aplica al diagnóstico de fiebre
reumática, glomerulonefritis acuda y otras
infecciones estreptocócicas. Existen kits
comerciales que proporcionan los
reactivos necesarios; la técnica es muy
sencilla y no requiere equipamiento de
ningún tipo.
• Hemaglutinación indirecta (HAI)
En lugar de partículas inertes como el látex, se pueden usar como soporte de los
antígenos hematíes convenientemente tratados. En este caso la técnica se denomina
de hemaglutinación indirecta (HAI).
Hay que destacar que no se trata de antígenos de los propios hematíes, como ocurre
con la hemaglutinación directa para determinación de grupos sanguíneos, sino de los
hematíes como soporte para unirles antígenos de distinta procedencia, frente a los
que se buscan anticuerpos específicos.
 La HAI se efectúa en placa de microtitulación con diluciones seriadas de los sueros.
Para la lectura, la aparición de un velo rosáceo en el pocillo supone un resultado
positivo, dado que los hematíes están agregados por los anticuerpos; en cambio, la
presencia de un anillo o botón de color rojo se interpreta como negativo, ya que, si no
existen anticuerpos específicos, los hematíes no se aglutinan, y pasado el tiempo de
incubación de la técnica, sedimentan en el fondo de los pocillos.
Estas técnicas requieren la utilización de un control negativo para comprobar que no
haya hemaglutininas en el suero problema.
En el pocillo para el control negativo se deposita suero problema, y sobre él se añaden
hematíes no sensibilizados. Si se obtiene un resultado positivo, ello indicará que los
hematíes han sido agregados por anticuerpos naturales (hemaglutininas).
Si este es el caso, un resultado positivo con los hematíes sensibilizados no tendrá
ningún valor, dado que no es posible discriminar si la aglutinación se debe a la reacción
antígeno-anticuerpo que se busca o a la
acción de las hemaglutininas.
Ante un positivo en el control negativo,
hay que repetir la reacción, pero
preincubando el suero problema con
hematíes no sensibilizados para eliminar
las hemaglutininas.
• Inhibición de la hemaglutinación (IHA)
Esta técnica es una variante de la técnica de hemaglutinación indirecta. La
hemaglutinación se debe a la capacidad que tienen algunos virus y bacterias de unirse
a receptores de membrana (formados por residuos del ácido N-acetilmurámico) de
hematíes de mamíferos y aves. Esto se puede aprovechar para detectar en un suero
problema anticuerpos específicos frente a esos virus o bacterias.
En ausencia de anticuerpos específicos, los
antígenos del patógeno provocarían la
aglutinación de los eritrocitos.
Por el contrato, si se incuban esos
patógenos con el suero de un paciente que
contenga anticuerpos específicos (por
ejemplo, frente al virus de la rubeola), los
anticuerpos neutralizarían los antígenos
bacterianos o víricos, inhibiendo así su
capacidad para aglutinar hematíes.
La lectura es, por tanto, lo contrario de la de
las pruebas de hemaglutinación.
En el diagnóstico de la rubeola, la formación
de un velo en los pocillos de la placa de
microtitulación (hemaglutinación) indica un
resultado negativo, es decir, que no existen
anticuerpos antirrubeola en el suero problema.
En cambio, la aparición de un botón en el fondo del pocillo es un positivo porque la
inhibición de la hemaglutinación indica la presencia de anticuerpos específicos
antirrubeola en el suero problema, que se unen a las partículas víricas inhibiendo así
su capacidad aglutinante de los hematíes.
 • Pruebas de Coombs
Basadas también en una reacción de hemaglutinación están las pruebas de Coombs (o
de la antiglobulina) directa e indirecta.
Estas pruebas usan el reactivo de Coombs, que es un antisuero animal contra
globulinas humanas y que contiene, por tanto, anticuerpos frente a las
inmunoglobulinas humanas. Cuando se incuba con eritrocitos lavados del paciente, el
reactivo de Coombs provoca su aglutinación.
Existen dos variantes de la prueba de Coombs:
➢ La prueba de Coombs directa permite la detección de anticuerpos unidos a los
eritrocitos.
Entre sus aplicaciones está el diagnóstico de anemias autoinmunes o de anemia
hemolítica en un recién nacido Rh+ hijo de una madre Eh.
➢ La prueba de Coombs indirecta permite la detección de inmunoglobulina anti-Rh
en el suero materno.
Se incuba el suero problema con hematíes Rb+, si hay IgG anti-Rh se unirán a
estos hematíes y, al añadir el reactivo de Coombs, se producirá la aglutinación de
los hematíes.
También se utiliza para detectar algunos grupos sanguíneos como el antígeno Duffy.

3. Técnicas de precipitación
Las técnicas de precipitación se basan en la reacción de la precipitación que ocurre cuando
un antígeno soluble multivalente se une con su anticuerpo específico (bivalente en el caso de
las IgG, o decavalente en el caso de las IgM), dando lugar a inmunocomplejos que precipitan
en el medio de la reacción.
Es decir, dos componentes que por separado son solubles, precipitan cuando se unen para
formar un inmunocomplejo.
Al igual que sucede con las reacciones de aglutinación, es necesario trabajar con
concentraciones equimoleculares de antígeno y anticuerpo, es decir, en el punto de
equivalencia. En caso contrario, se puede producir un «fenómeno
de zona», con un resultado falso negativo.
Esto es fácil de comprobar, mezclando concentraciones crecientes
de antígeno en solución con un suero que contenga anticuerpos
específicos. Como consecuencia de las uniones antígeno-
anticuerpo se forman grandes agregados que precipitan. Al ir
añadiendo el antígeno se alcanza una concentración óptima,
después de la cual se forma menos precipitado.
Si se representa gráficamente, se obtiene una curva en forma de
campana de Gauss. Tanto el exceso de anticuerpo (izquierda)
como el exceso de antígeno (derecha) comportan una
disminución de la concentración de inmunocomplejos formados.
3.1. Técnicas de precipitación en medio líquido
Las reacciones de precipitación en medio líquido se basan en medir la turbidez que
produce la precipitación de inmunocomplejos en un medio líquido.
La medición de la turbidez se puede realizar mediante dos técnicas analíticas, la
turbidimetría y la nefelometría, que se basan en la dispersión de un haz de luz incidente.
Se pueden utilizar para determinar anticuerpos, factores del complemento, proteínas de
fase aguda y otras proteínas séricas.
En cualquier caso, las reacciones de precipitación en
medio líquido apenas se utilizan en la actualidad en el
inmunodiagnóstico, ya que han sido desplazadas por las
reacciones de precipitación en gel.
• Inmunoturbidimetría
Mediante la turbidimetría se puede comparar la intensidad del rayo de luz emergente
con la del rayo incidente, y temiendo en cuenta que existe relación entre la
concentración del analito y la transmitancia medida en un espectrofotómetro, se
puede determinar la concentración de analito.
La inmunoturbidimetría aplica este principio, midiendo la concentración de complejo
inmune que se forma (es el analito en este caso). Se utiliza para muestras que
contienen grandes concentraciones de partículas dispersantes.
Si se aplica a la determinación cuantitativa de IgA, IgG e IgM en suero humano, se
utilizan antisueros con anti-IgA. anti-IgG y anti-IgM, respectivamente.
Se producen inmunocomplejos que generan una turbidez medible por fotometría a
365 nm. La cantidad de inmunocomplejos formados es proporcional a la concentración
de inmunoglobulina presente en la muestra
• Inmunonefelometría
Cuando la muestra contiene pequeñas concentraciones de partículas dispersantes, es
más recomendable recurrir a la inmunonefelometría que a la inmunoturbidimetría.
Siempre que se disponga de los anticuerpos monoclonales necesarios, se puede aplicar
a la estimación de Ig, componentes del complemento (C3, C4), haptoglobina, proteína
C reactiva, etc.
Esta técnica mejora la sensibilidad utilizando un láser (luz monocromática) y
agregando polietilenglicol a la solución, lo que aumenta el tamaño del agregado.
Los complejos antígeno-anticuerpo formados se cuantifican mediante el gradiente de
difracción del rayo láser que producen. Se mide la dispersión de la luz en un ángulo
aproximado de 70%.
La principal limitación de esta técnica radica en la interferencia que puede causar la
turbidez propia de la muestra, ya sea por la presencia de complejos inmunes
preexistentes o de otros agregados moleculares insolubles de origen no inmunológico.
Este aspecto se controla mediante la utilización de un «blanco» de muestra.
Es un método sensible, reproducible y rápido, gracias al grado de automatización de
los nefelómetros disponibles actualmente en el mercado.
Los nefelómetros más simples se basan en una lectura de punto final; se utiliza un
exceso de anticuerpos que se van añadiendo a la muestra hasta llegar al punto de
equivalencia, momento en que se realiza la medida de la luz dispersada.
Existen otros modelos de nefelómetros más sofisticados, que utilizan un sistema de
lectura continua para computar la cinética de la formación de los complejos, es decir,
el cambio de señal por unidad de tiempo.
3.2. Técnicas de precipitación en gel
En la actualidad es más frecuente la utilización de un soporte semisólido que de un medio
líquido.
El soporte es un gel de agar 0 agarosa, cuya preparación es muy sencilla:
1. Se disuelve agarosa al 1% en tampón fosfato PBS o solución salina, en caliente (por
encima de 30 C).
2. El gel que se forma se deposita en caliente sobre el soporte en que se va a efectuar la
reacción.
3. Se deja enfriar.
4. Una vez frio y solidificado, se excavan en él los pocillos necesarios con un sacabocados.
Los componentes de la reacción se depositan en los pocillos, difunden a través del gel y en
la zona donde alcanzan el punto de equivalencia, es decir, donde existen concentraciones
equiparables de antígeno y anticuerpo, forman los inmunocomplejos y aparecen líneas,
arcos o bandas de precipitación, que se ven a simple vista
La velocidad de difusión de un antígeno o anticuerpo en el gel depende de varios factores:
➢ La concentración.
➢ La temperatura: cuando es elevada se favorece la difusión.
➢ El tamaño de las moléculas: la velocidad de difusión es inversamente proporcional
al peso molecular.
➢ La viscosidad del medio: una viscosidad elevada hace disminuir la velocidad de
difusión.
Como la velocidad de difusión depende de estos factores, si se trabaja con una mezcla de
diferentes anticuerpos o con una solución con diferentes proteínas antigénicas, se van a
formar varias bandas de precipitación. El número de bandas de precipitación formadas
representa el número de complejos antígeno-anticuerpo formados.
Existen diferentes modalidades de precipitación en gel, en función de que:
➢ Difundan por el gel uno o los dos Doble difusión
componentes de la reacción. Técnicas de
Inmunodifusión radial
➢ La difusión sea espontánea o forzada por difusión
Inmunoelectroforesis
aplicación de un campo eléctrico. espontánea
Inmunofijación
➢ Se trate de una técnica cualitativa o Técnicas de
cuantitativa. difusión forzada Contrainmunoelectroforesis
Las principales, que estudiaremos a continuación, en campo Electroinmunodifusión
son las siguientes: eléctrico
• Doble difusión o reacción de Ouchterlony
Los dos componentes de la reacción (antígeno y anticuerpo) difunden libremente por
el gel. La reacción más sencilla consiste en disponer solución de agarosa en caliente
sobre un portaobjetos, extenderla y dejar que se enfríe. De este modo, ya está
preparado el soporte de la reacción. A continuación, se excavan dos pocillos con un
sacabocados, uno en cada extremo del portaobjetos, y ya se pueden dispensar la
solución antigénica en uno de ellos y el suero en el que buscamos anticuerpos
específicos en el otro.
A medida que los dos componentes de la reacción van
difundiendo libremente por el agar, se irá formando
un gradiente de concentraciones. En el espacio entre
los dos pocillos habrá una determinada zona en la que
los reactivos se encuentren en su relación de
 equivalencia, y es ahí donde se formará un precipitado que sobre el gel se detectará
como una banda blanca visible a simple vista. Las concentraciones de anticuerpo y
antígeno que difunden hacia los extremos del portaobjetos se pierden
Aunque se trata de una técnica cualitativa, la distancia a la que se forman las bandas
de precipitación nos permite deducir la estructura o la concentración relativa de los
componentes de la reacción, ya que la banda se formará más próxima al pocillo que
contenga el componente menos concentrado y/o de mayor tamaño molecular.
Por esta razón, si enfrentamos un antígeno a
diferentes diluciones de un suero que contiene
anticuerpos específicos, la distancia a la que se
forman las bandas de precipitación va variando en
función de la concentración de anticuerpos.
Es fácil efectuar la demostración experimental, con
una pequeña placa de Petri cubierta con el gel de
agarosa. Se excava un pocillo central, donde se
coloca la solución antigénica y varios pocillos en
circulo, alrededor del central, con seis diluciones
crecientes del suero.
El hexágono que tienden a formar las bandas
resultantes de la precipitación aparece desplazado,
respecto del pocillo central, hacia los pocillos que
contienen la menor concentración de anticuerpos,
es decir hacia las diluciones más altas.
Cuanto menor sea la concentración de la proteína
(anticuerpo) que difunde por el gel, menor será la
distancia que tiene que recorrer hasta encontrar la
concentración equivalente (punto de equivalencia) del antígeno.
Entre las aplicaciones de la doble difusión en gel están los
estudios de identidad entre antígenos. Se puede determinar
la existencia o no de determinantes comunes entre
antígenos estudiando las bandas de precipitación formadas:
➢ La reacción de identidad total (I), corresponde a los
antígenos que comparten todos los determinantes
antigénicos -las bandas de precipitación se fusionan
➢ En la reacción de no identidad (II), ningún determinante
es compartido y por lo tanto son antígenos distintos.
➢ En la reacción de identidad parcial (III), hay algunos
determinantes comunes y otros diferentes, siendo estos
últimos los responsables de que se forme un espolón
dirigido hacia el pocillo con menos determinantes
reactivos.
• Inmunodifusión radial o técnica de Mancini
La inmunodifusión radial o técnica de Mancini se basa en la difusión libre de uno de los
componentes de la reacción (antígenos o anticuerpos) por un gel que lleva
incorporado el otro componente (anticuerpos o antígenos).
En este caso, la formación de los complejos da lugar a la formación de un anillo de
precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración del componente que
difunde por el gel.
 La difusión ocurre en todas las direcciones a
partir del pocillo, y se irá formando, como en la
doble difusión, un gradiente de concentración; la
diferencia es que, en este caso, sea cual sea la
dirección en que difunda el componente
depositado en los pocillos, llegará un momento
en que se encuentre con la concentración
equivalente del componente incorporado en el
gel. En consecuencia, el resultado no será una
línea sino un anillo de precipitación.
Si en los pocillos excavados en un gel con
anticuerpo incorporado se dispensa una serie de
diluciones de un antígeno, se puede establecer
una recta patrón, representando gráficamente el
diámetro de los anillos de precipitación frente a
la concentración radial.
Este procedimiento permite conseguir una
determinación cuantitativa de un antígeno en
una muestra problema, dibujando la curva patrón
a partir de unos controles que se ponen a
difundir en el gel, paralelamente a las muestras
problema, e interpolando en la curva el valor de
los diámetros medidos de las muestras problema.
Esta técnica resulta muy útil en inmunología clínica para cuantificar fracciones
plasmáticas de proteínas como inmunoglobulinas, factores de coagulación o
componentes del complemento.
Así, por ejemplo, si se pretende determinar la concentración de IgG en un suero, se
utilizan placas con inmunoglobulinas anti-IgG humanas en el gel.
Existen kits comerciales que incluyen:
➢ Las placas de agar con el anticuerpo incorporado.
➢ Un control de concentración conocida.
➢ Una tabla de concentración del antígeno en la muestra problema en función de los
diámetros o radios de los anillos de precipitación.
Con ellos solo hay que dispensar el control y los problemas en los
pocillos correspondientes, medir los diámetros una vez transcurrido
el tiempo de incubación y ver en la tabla a qué concentración del
antígeno problema corresponde el diámetro obtenido.
También existen kits que proporcionan placas divididas en
secciones y diferenciadas por colores, que permiten
determinaciones diferentes en una misma placa, por ejemplo, de
IgG. IgA e IgM.
• Inmunoelectroforesis
Combina la separación proteica por electroforesis y la inmunodifusión, y sus
principales aplicaciones son:
➢ La identificación de fracciones proteicas especificas en una mezcla antigénica.
➢ El hallazgo en una muestra biológica, normalmente suero, de anticuerpos
específicos frente a una determinada fracción antigénica.
➢ La determinación de la pureza de un antígeno.
 Los componentes de la mezcla se separan primero aplicando una corriente eléctrica; a
continuación, se lleva a cabo una difusión libre en gel de las fracciones obtenidas.
Es una técnica cualitativa, cuya principal ventaja es la
especificidad, puesto que la separación previa permite
la obtención de arcos o bandas de precipitación
exclusivamente frente a una determinada fracción
antigénica.
La principal aplicación, aunque hoy en día está bastante
en desuso, es la separación de proteínas presentes en
suero y otras muestras biológicas. En los análisis de
inmunoglobulinas, utilizando antisueros con anti-lgG,
anti-IgM o anti-IgA se pueden estudiar las líneas de
precipitación correspondientes a cada uno de los
anticuerpos mayoritarios en un suero.
• Inmunofijación
Es una variante de la anterior y se utiliza en el laboratorio para evaluar las proteínas
del mieloma. El mieloma múltiple es una proliferación anómala de células plasmáticas
malignas, caracterizada por la producción excesiva de una molécula de
inmunoglobulina con un tipo de cadena pesada y un tipo de cadena ligera,
denominada paraproteína.
Para ello, el suero problema, dispuesto en cinco carriles diferentes, se somete a
electroforesis. A continuación. cada carril se recubre con un antisuero específico,
obtenido en animales, frente a las cadenas pesadas humanas γ, α y (IgG, IgA e IgM,
respectivamente), y las cadenas ligeras Ƙ y λ. No se incluye la cadena pesada ɛ, dado
que el mieloma por IgE es excepcional.
Cuando el anticuerpo reconoce al antígeno adecuado, se forma un precipitado que
queda atrapado en el gel. Se lava para eliminar las proteínas no precipitadas y se tifie
para identificar la proteína que han formado los inmunocomplejos. Así se identifica el
tipo de paraproteina.
En la mayoría de los pacientes de mieloma múltiple se aprecia una producción
excesiva de las cadenas ligeras (Ƙ o λ) por parte de las células plasmáticas malignas,
cuyo peso molecular es lo suficientemente
bajo para permitir su excreción a través de
la orina. Esas cadenas ligeras son las
denominadas proteínas de Bence-Jones, y
su presencia en orina se denomina
proteinuria de Bence-Jones.
• Contrainmunoelectroforesis (CIEF)
Esta técnica consiste en una doble difusión forzada mediante la aplicación de un
campo eléctrico.
Tiene la ventaja de que permite disminuir el tiempo de incubación y aumentar
considerablemente la sensibilidad de la técnica, ya que la totalidad de los
componentes dispuestos en el pocillo migran en sentidos opuestos, sin «perderse»
 hacia los extremos del portaobjeto o placa, donde
no se encuentra el componente complementario.
Es una técnica cualitativa.
Se practica en geles de agar, eligiendo el pH de
forma que los anticuerpos tengan carga positiva o
neutra y el antígeno, carga negativa. Aplicando un
voltaje a través del gel, el antígeno y el anticuerpo
se mueven uno hacia el otro (los anticuerpos
hacia el cátodo, y los antígenos hacia el ánodo)
hasta que se encuentran en el punto de
equivalencia, donde se forman los complejos
inmunes y por tanto las líneas de precipitación.
• Electroinmunodifusión (EID)
Se trata de una inmunodifusión radial forzada por aplicación de corriente eléctrica, lo
que, al igual que en el caso anterior, hace a la técnica más rápida y más sensible. A
esta técnica se la conoce también como electroforesis «en cohete» (rocket).
Los antígenos son sometidos a electroforesis en un gel que lleva incorporado el
anticuerpo o suero. El pH del gel se elige en el punto isoeléctrico de los anticuerpos,
con lo que tendrán carga neta 0, y no migrarán bajo la acción del campo eléctrico. Por
tanto, solamente migrarán los antígenos.
Se forman precipitados en forma de cohetes, que tienen una altura proporcional a la
concentración de antígeno presente en al pocillo, de forma que los valores
desconocidos se determinan por interpolación en una curva patrón, al igual que se ha
descrito para la inmunodifusión radial. Es por tanto una técnica cuantitativa.

4. Técnicas de fijación del complemento

Estas técnicas proporcionan una medida indirecta de anticuerpos que no dan reacciones
visibles. Se basan en que la formación de inmunocomplejos activa el sistema del complemento
y produce complejos que lesionan las membranas de eritrocitos y otras células.
4.1. El sistema del complemento
Está constituido por un conjunto de proteínas plasmáticas que, ante ciertos estímulos, se
activan en forma de cascada. Es parte de la inmunidad innata, aunque uno de sus
mecanismos de activación (la vía clásica) requiere la participación de anticuerpos Y, por
tanto, supone que se ha puesto en marcha la respuesta específica.
Entre sus acciones biológicas destacan:
➢ Inducción del proceso inflamatorio: reclutamiento y activación de fagocitos,
degranulación de mastocitos.
➢ Opsonización y fagocitosis.
➢ Lisis de membranas celulares.
➢ Eliminación de inmunocomplejos circulantes.
Como parte integrante de los mecanismos defensivos de la inmunidad innata, puede ser
activado por dos vías:
➢ La vía alternativa, por polisacáridos y membranas microbianas.
➢ La vía de las proteínas de fase aguda: lectina fijadora del manano (MBL) y proteína C
reactiva.
Estas vías son filogenéticamente más antiguas y más rápidas en cuanto a su puesta en
marcha, pero una vez iniciada la respuesta adaptativa, también se puede activar la vía
clásica, que requiere la participación de IgM e IgG.
Todas las vías confluyen en un punto, que es la formación de la C3 convertasa, una de las
enzimas clave en la activación secuencial del sistema del complemento. A partir de ahí hay
una fase efectora común, que culmina con la formación del CAM (complejo de ataque a la
membrana), responsable de la formación de poros en la membrana celular y de lisis
osmótica.

4.2. Reacción de fijación del complemento

La lisis de membranas celulares por el complemento es una de las consecuencias de su
activación. La vía clásica comienza con la unión de antígenos de membrana a anticuerpos
específicos, y termina con la formación de numerosos poros en esa membrana y la
consecuente lisis de esa célula.
Si el anticuerpo se une a antígenos de membrana de eritrocitos, al unirse y activarse el
complemento, se producirá la hemólisis. Esta reacción se puede utilizar para medir niveles
de anticuerpos en el suero. El fundamento es la utilización como «sistema revelador» de
eritrocitos y anticuerpos frente a esos eritrocitos (hemolisinas).
Esta técnica se utilizó por primera vez en 1906 en el diagnóstico de la sífilis, y se conoce
como reacción de Wassermann. Con posterioridad se ha utilizado para la identificación y
titulación de antígenos, así como para su caracterización, subtipificación y clasificación
(relaciones y parentescos serológicos).
Tiene la desventaja de que es una prueba compleja, particularmente con respecto a la
estandarización y preparación de los reactivos requeridos, los cuales deben ser
chequeados cuidadosamente antes de aplicar la técnica. Hay que prestar especial atención
a:
➢ La hemolisina, que se debe calentar a 56 *C durante 30 min para destruir su
complemento.
➢ La adición de la cantidad adecuada de complemento, lo cual es fundamental debido a
que cantidades menores provocan lisis incompleta mientras que cantidades excesivas
pueden no ser completamente fijadas por el complejo inmune y dar resultados falsos
negativos.
➢ La adición de la cantidad adecuada de antígeno, ya que en cantidad excesiva el
antígeno interfiere con la fijación de complemento, mientras que cantidades
insuficientes pueden no fijar el complemento en cantidades demostrables.
La fijación de complemento es una técnica que se aplica a la detección de anticuerpos en
un suero, utilizando el correspondiente antígeno, como reactivo «conocido» de la
reacción. Por ejemplo, se usa para el diagnóstico serológico de brucelosis,
de la coccidioidomicosis, de la histoplasmosis, etc.
El procedimiento básico es el siguiente:
1. Incubar el suero problema con el antígeno y el complemento. Para hacerlo:
➢ Se inactiva el complemento del suero problema calentándolo a 56 ºC durante 30
min.
➢ Se preparan diluciones crecientes del suero problema inactivado.
➢ Se añade una cantidad conocida del suero a una cantidad de antígeno conocida. Si
haya anticuerpos (Acp), se formarán los correspondientes inmunocomplejos.
➢ Se añade complemento. En caso de que haya inmunocomplejos, estos fijarán el
complemento y lo agotarán. Hay que utilizar la cantidad exacta de complemento
necesaria para lisar los eritrocitos. cuando no se hayan «gastado» en la incubación
anterior; por eso es importante descomplementar el suero problema.
2. Añadir un sistema indicador (eritrocitos con hemolisinas en su superficie).
➢ Se añade el «sistema hemolítico». constituido por hematíes de carnero y suero de
conejo con anticuerpos (Ace) contra los eritrocitos de carnero (hemolisina), que
forman complejos antígeno-anticuerpo.
3. Interpretación de los resultados:
➢ Se observa la lisis de los eritrocitos: negativo. Significa
que hay complemento libre que no se fijó en la primera
reacción y, por tanto, que no hay anticuerpos en el suero
(el complemento no se ha gastado en la incubación
anterior, porque no se formaron inmunocomplejos).
➢ No se observa la lisis de los eritrocitos: positivo. Significa
que el complemento se ha agotado en la reacción
anterior debido a la presencia de anticuerpos específicos
en el suero problema. Esos anticuerpos han provocado la
formación de inmunocomplejos y la fijación del
complemento (lo cual hace que no quede complemento
libre).
La reacción se suele realizar en placas de microtitulación. Puede
haber problemas derivados de que algunos anticuerpos pueden
fijar el complemento en ausencia de antígeno, esto ocurre
cuando el suero problema ya contiene inmunocomplejos, o a
causa de que algunos antígenos pueden presentar actividad anticomplemento. Por esta
razón se deben incluir controles de solo anticuerpo y solo antígeno, para verificar que
ninguno de ellos fija el complemento por sí solo.