Curso: Aspectos teóricos y aplicaciones de la citometria de flujo

Introducción teórica a la
citometria de flujo.

Dra Irene Sales

Responsable Plataforma Citómica, Unitat d’Alta
Tecnolgía (UAT), VHIR
 Qué es la Citometría de flujo?

La citometría es una técnica que permite medir

simultáneamente múltiples características
físicas y químicas de células o partículas en
suspensión que atraviesan un haz de luz
(laser), y ofrece la posibilidad de separar las
células (sorting) en función de sus
características.
 Historia de la citometría de flujo

Fulwyler, describe el
proceso de separación
electrostática.
1930 1940 1950 1960 1965 1970

1934 1947 1953 1969

Moldavan, Primer Gucker, Crosland-Taylor, Van Dilla, primer
contador celular Citómetro diseñó la cámara citómetro de flujo a
automatizado. de flujo para de flujo. Aplica el partir de la cámara
detectar principio de de flujo con ejes
bacterias en Reynolds (1883) ortogonales, en el
aerosoles. al flujo laminar. National Laboratory
de Los Alamos.
 Historia de la citometría de flujo

• 1970 Se construyen los primeros citómetros de flujo.

• 1980- Actualidad se han producido muchos adelantos en

las aplicaciones de la citometría de flujo en el campo de la
investigación clínica-biológica, sobretodo a partir del
desarrollo de los anticuerpos.
 Componentes de un citómetro de
flujo
Fluídica • Flujo laminar (sistema presurizado).
• Cámara de flujo (enfoque hidrodinámico).

Óptica

Electrónica

Informática
 Fluídica (I)

Cámara de
flujo
LASER

Tanque Líquido
de arrastre
(SHEATH) Tanque de Deshechos Muestra
(WASTE) (suspensión celular)
 Fluídica (II)

Flujo laminar

Flujo turbulento
 Fluídica (III)

La cámara de flujo: Cámara de

Flujo
 determina las características del
flujo Líquido de
arrastre
 permite el ENFOQUE
HIDRODINÁMICO
Células
 se produce la intercepción entre el
láser y la muestra, PUNTO DE
Muestra
INTERROGACIÓN

LASER
 Fluídica (IV)
 Enfoque hidrodinámico permite el paso
individualizado de las células a través de la cámara
de flujo.
 La disminución de la presión y el aumento de la
velocidad en el centro del flujo provoca la focalización
(Efecto Venturi 1797, explicado por el principio de
Bernoulli, 1738).
 Fluídica (V)

• La velocidad del líquido de arrastre viene determinada

por la presión a la que está sometido, no modificable en
la mayoría de citómetros analizadores.

• La diferencia de presiones entre el líquido de arrastre y

la muestra, determina la velocidad del paso de células
por la cámara de flujo (low/med/high).
 Componentes de un citómetro de
flujo
Fluídica • Flujo laminar (sistema presurizado).
• Cámara de flujo (enfoque hidrodinámico).
• LASER (Light Amplification by Stimulated
Óptica
Emission of Radiation).
• Luz dispersada y fluorescencia.
• Sistema de filtros para la recolección de la señal.
Electrónica

Informática
 Óptica (I)

Velocidad de muestra baja Velocidad de muestra alta

Haz del
laser

Muestra
Intensidad de luz

Líquido de
arrastre

Máxima iluminación Iluminación variable

CV bajos CV altos
 Óptica (II)
· Cada célula (evento) que atraviesa la fuente de luz (láser) genera
una señal (dispersión de la luz, fluorescencia) que es recogida por
espejos y filtros ópticos.

· La especificidad de la detección está controlada por la selección de

longitudes de onda por parte de espejos y filtros ópticos.
 Óptica (III)

· Los filtros ópticos absorben o reflejan determinadas

longitudes de onda.
· Tipos de filtros:
 Paso largo (Long Pass)

 Paso corto (Short Pass)

 Paso de banda (Band Pass)

 Espejos Dicroicos

 Neutros
 Óptica (IV)

Combinando los distintos filtros podemos detectar los distintos

fluorocromos que presente la muestra simultáneamente.
 Qué información da un citómetro
de flujo sobre una célula

1. Tamaño celular (Forward Scatter,

FSC).
2.Complejidad o granulosidad celular
(Side Scatter, SSC).
3.Fluorescencia (FL).
 Qué información da un citómetro
de flujo sobre una célula

1. Tamaño celular (FSC).

2.Complejidad o granulosidad celular
(SSC).
3.Fluorescencia (FL).
 1. Tamaño celular (FSC)
Difracción. Recogida entre 0.5 y 2 º. Proporcional al tamaño celular.

Refracción. Entre 2-15º. Información sobre la estructura celular

externa. Depende del índice de refracción entre el medio y las
células. Disminuye en las células muertas.

LASER

www.the-aps.org/education/lot/cell/cell.JPG
 Qué información da un citómetro
de flujo sobre una célula

1. Tamaño celular (Forward Scatter,

FSC).
2. Complejidad o granulosidad celular
(SSC).
3. Fluorescencia (FL).
 2. Complejidad o granulosidad
celular (SSC)
Luz dispersada lateralmente, recogida
a 90º .
Nos informa sobre la estructura
celular interna.

LASER

www.the-aps.org/education/lot/cell/cell.JPG
2. Complejidad o granulosidad
celular (SSC)
 Qué información da un citómetro
de flujo sobre una célula

1. Tamaño celular (FSC).

2.Complejidad o granulosidad celular
(SSC).
3.Fluorescencia (FL).
 3. Fluorescencia (FL).
· El fluorocromo absorbe la
energía del láser, vibra y emite
fotones de una longitud de
onda mayor que la del láser.

Muestra Líquido de
arrastre

· La fluorescencia emitida por

cada fluorocromo o colorante
debida a la excitación del láser es
recogida a 90º. SSC
Fluorescencia
Fuente de luz

FSC
 3. Fluorescencia (FL).
Las células negativas también son detectadas.

PE FL FITC FL 488nm SSC

LASER

Detector
Espejos del FSC
Dicroicos Lente
Confocal
 3. Fluorescencia (FL).
La especificidad de la detección está controlada por la
selección de las longitudes de onda mediante espejos y filtros
ópticos.
PE FL FITC FL 488nm SSC
LASER

Filtros de paso de
banda
Detector del
Espejos Lente confocal FSC
dicroics
 3. Fluorescencia (FL).
EXITACIÓN EMISIÓN
Fluoresceína (FITC) 519 nm
488 nm
Ficoeritrina (PE) 578 nm
Ficoeritrina-Cianina5 (PECy5) 670 nm
Peridinín-clorofil·la (PerCP) 675 nm
561 nm
Ficoeritrina (PE) 578 nm
Ficoeritrina-Cianina5 (PECy5) 670 nm
633 nm Aloficocianina (APC) 660 nm
Aloficocianina H7 (APC-H7) 785 nm
Aloficocianina-Cianina7 (APC-Cy7) 767 nm

405 nm Alexa405 421 nm

Alexa430 540 nm
Pacific Blue 455 nm

365 nm
Hoechst33342 460 nm
DAPI 461 nm
Indo1 401 nm
 3. Fluorescencia (FL).
EXITACIÓN EMISIÓN
Fluoresceína (FITC) 519 nm
488 nm
Ficoeritrina (PE) 578 nm
Ficoeritrina-Cianina5 (PECy5) 670 nm
Peridinín-clorofil·la (PerCP) 675 nm
561 nm
Ficoeritrina (PE) 578 nm
Ficoeritrina-Cianina5 (PECy5) 670 nm
633 nm Aloficocianina (APC) 660 nm
Aloficocianina H7 (APC-H7) 785 nm
Aloficocianina-Cianina7 (APC-Cy7) 767 nm

405 nm Alexa405 421 nm

Alexa430 540 nm
Pacific Blue 455 nm

365 nm
Hoechst33342 460 nm
DAPI 461 nm
Indo1 401 nm
 3. Fluorescencia (FL).
Ensayo multicolor: combinación de 2 o más fluorocromos

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Intensidad relativa
Intensdad relativa

Excitation Excitation
Emission Emission

Fluoresceína (FITC) Ficoeritrina (PE)

 3. Fluorescencia (FL).
Solapamiento y Compensación
FITC
Exempl FL1 FL2
PE
e
Intensidad Relativa

W W
H H

488
Longitud de onda

505-520 570-590
 3. Fluorescencia (FL).
Ejemplo

Solamente deberíamos
detectar fluorescencia en
el canal del FITC (FL1).
FL2-%FITC(FL1)

Seleccionamos la
población de interés

Una vez compensada

solamente tenemos
fluorescencia en el detector
que nos interesa.
 3. Fluorescencia (FL).
Cómo compensamos?
• Para compensar lo que hacemos es restar señal de un
detector a otro.
• Se necesitan controles positivos con una sola fluorescencia
conocida.
• Los equipos analógicos restan la señal antes de procesarla
y por lo tanto, no se puede recuperar.
• Los equipos digitales procesan la señal entera y después
aplican matrices.
%FL2 compensación= Median FL2pos-Median FL2neg x 100
Median FL1pos-Median FL1neg
 3. Fluorescencia (FL).
Comprovación de la compensación
 3. Fluorescencia (FL).
Qué fluorocromos escogemos y porqué?
Fluorocromos más brillantes para los marcajes “dim” EVITANDO el
solapamiento de los espectros con la población brillante!

Com se define y se mide el brillo de un fluorocromo?

Por su capacidad de discriminar Células DIM de les Negativas así como
las Células Negativas del Background.

Esta capacidad está influenciada por el CV, el ruido electrónico,

backgound, autofluorescencia celular….
Por lo tanto, una medida de Sensibilidad de resolución de un fluorocromo
es el ÍNDICE DE TINCIÓN.
 3. Fluorescencia (FL).
Índice de Tinción (Stain Index)

Es una medida del brillo

D= Distancia de la población
positiva de la negativa
W= Anchura de la población
negativa

1. Interesan fluorocromos con elevados Índices de Tinción.

2. Interesa MINIMIZAR las compensaciones.
3. Fluorescencia (FL).
 3. Fluorescencia (FL).

Ejemplo: Estudiamos la expresión de CD62L (débil) en la población CD8

(alta).
CD8 FITC/CD62L PE

• El FITC tiene un elevado grado de solapamiento con el PE.

• Compromete la resolución en el canal del PE.
• Menor Sensibilidad de resolución en la población problema
(CD62L).

1. Escoger otro fluorocromo para el CD8 con menos solapamiento en

PE (ex. PerCP-Cy5.5 ó APC).
2. Escoger otro fluorocromo para el CD62L igual de brillante, que
no se solape con el FITC (ex. APC)
 3. Fluorescencia (FL).
Tándems
• 2 fluorocromos unidos
químicamente:
PE-Cy5
PE-Cy7
APC-Cy5
APC-Cy7
PerCP-Cy5.5...

Inconvenientes:
• Pueden degradarse a consecuencia de: luz, fijación, elevadas
temperaturas…
• Emitiendo en el detector del fluorocromo parental:
Ej. APC-Cy7 al degradarse emitirá en APC y PE-Cy7 en PE dando
Falsos positivos
 3. Fluorescencia (FL).
Tándems

Prevención: Alternativa: APC-H7

• Minimizar la exposición a la • Más estable a la luz y
luz, calor y evitar fijaciones con temperatura.
formaldehído. • Más estable a la fijación con
• Si no se pueden evitar las formaldehído.
fijaciones: usar soluciones • Bajo solapamiento en otros
estabilizantes. detectores.
 3. Fluorescencia (FL).

Controles para un experimento de citometria:

• control de autofluorescencia: células sin marcar.

• control isotípico

• Controles compensación: Single color, FMOs

 3. Fluorescencia (FL).

Controles para un experimento de citometria:

• control de autofluorescencia: células sin marcar.

• control isotípico

• Controles compensación: Single color, FMOs

 3. Fluorescencia (FL).

Controles para un experimento de citometria:

• control de autofluorescencia: células sin marcar.

• control isotípico

• Controles compensación: Single color, FMOs

 3. Fluorescencia (FL).

Controles Isotípicos:
• Tenemos en cuenta la tinción inespecífica de un anticuerpo con
un ISOTIP determinado conjugado a un fluorocromo en concreto.
Ex. Mouse IgG1 FITC

• Distintos isotipos presentan distinto background:

 3. Fluorescencia (FL).

Controles para un experimento de citometria:

• control de autofluorescencia: células sin marcar.

• control isotípico

• Controles compensación: Single color, FMOs

 3. Fluorescencia (FL).

Controles de compensación: se realizan para aquellos

experimentos en los que se combinan 2 o más fluorescencias.

• Single Color: cada fluorocromo por separado.

• FMOs
 3. Fluorescencia (FL).

FMO: “Fluorescence Minus One”

• Los controles FMO contienen todos los anticuerpos de la muestra menos
1.

• El detector en el cual no hay anticuerpo es el que el FMO proporciona el

control negativo:

Ejemplo.
CD3 CD4 CD8 CD25 CD127 CD45.
El FMO para situar la región de positividad para el CD25 sería:

– CD3 CD4 CD8 --- CD127 CD45

 3. Fluorescencia (FL).

FMO: “Fluorescence Minus One”

Ejemplo: CD3 FITC / CD4 PE / CD8 PE-Cy5 / CD45RO PE-Cy7.

Control Isotípic FMO Tots Ac

 3. Fluorescencia (FL).
Ejemplo. CD4 FITC / IL-2 PE
¿Dónde situamos el cuadrante de positividad para la IL-
2 PE?

Dades procedents Joseph Trotter,

Cytometry Part A 69A:1037–1042 (2006)
 3. Fluorescencia (FL).
Otros aspectos a considerar:
• Unión inespecífica:
ex. PE-Cy5 se pueden unir inespecíficamente a las Fc expresadas en
limfocitos B, monocitos y células dendríticas.

Solución:
- Células de Rata o Ratón: usar bloqueo de FC comerciales.
- Células humanas: Cocktails de IgGs, suero humano.
- Usar otros tándems de baja o nula afinidad por los receptores Fc: PE-
TexasRed y PE-Cy7.

• Efecto del tamaño del fluorocromo en marcajes intracelulares: No

influye! Recomendación usar fluorocromos brillantes.
 3. Fluorescencia (FL).
Creación de paneles multicolor
1. Seleccionar los florocromos de acuerdo al instrumento que vamos a usar.

2. Adecuar el brillo de los florocromos al nivel de expresión del antigeno.

• Florocromos Brillantes - Antígenos poco expresados
• Florocromos débiles - Antígenos muy expresados

3. Minimizar el solapamiento de espectros de emisión en marcadores que se

expresan en la misma célula.

4. Evitar combinaciones que generen falsos positivos en caso de degradación

del florocromo.

5. Intentar, dentro de lo posible, usar florocromos excitados por el LASER rojo

en antígenos que se expresen en células con alta autoflorescencia.

IV Fórum de usuarios FACS

 Componentes de un citómetro de
flujo
Fluídica • Flujo laminar (sistema presurizado).
• Cámara de flujo (enfoque hidrodinámico).

Óptica • LASER .
• Luz dispersada y fluorescencia.
• Sistema de filtros para la recolección de la señal.
Electrónica • Amplificación mediante PMTs.
• Conversión a valores digitales.
Informática
 Electrónica (I)
La fluorescencia generada por cada célula es recogida por diversos
detectores fotomultiplicadores de la señal (PMTs).
PMTs convierten la señal luminosa recibida en pulsos eléctricos.

Intensidad

LASER

Tiempo
 Electrónica (II)
De cada señal podemos obtener la altura, anchura y área.

Intensidad

Tiempo

Altura Pulso Anchura Pulso Área Pulso

(H) (W) (A)
 Electrónica (III)
1 Células en fase G2/M (4n)

LASER

FL3-W
2 Células en fase G1 (2n)

LASER

FL3-A
 Electrónica (IV)

Estas señales eléctricas son amplificadas y digitalizadas

mediante los ADCs (Analog to Digital Converters).

A cada señal de fluorescencia generada por cada evento se le

asigna un canal de intensidad de fluorescencia, en función
de la señal detectada por los PMTs, en un histograma de 1 o 2
parámetros.

Cada evento está correlacionado de manera individual con

todos los parámetros analizados (FSC, SSC, y
fluorescencias).
 Electrónica (V)
Células
apoptóticas
Células grandes o
agregados
SSC

Célules
vivas
Eje Y

Eje X FSC
Células
muertas,
debris
 Electrónica (VI)
• Histograma uniparamétrico.

Control
Negativas CD244
Positivas
Número de células
Cell count

1 2 3 4 6 7 150 160 170 .. 190

Canal de fluorescencia

MIF CD244
Intensidad de fluorescencia
(MIF, Mean Intensity Fluorescence)
 Electrónica (VII)
• Histograma biparamétrico.
Población Población doble
positiva positiva
para PE
PE FL

Población
negativa

FITC FL Población positiva

para FITC
Electrónica (VII)
 Electrónica (VIII)

Escala
lineal

Escala
logarítmica
 Componentes de un citómetro de
flujo
Fluídica • Flujo laminar (sistema presurizado).
• Cámaro de flujo (enfoque hidrodinámico).

Óptica • LASER .
• Luz dispersada y fluorescencia.
• Sistema de filtros para la recolección de la señal.
Electrónica • Amplificación mediante PMTs.
• Conversión a valores digitales.
Informática • Análisis en un sistema informático.
 Análisis de datos
El citómetro nos da datos de la muestra que adquirimos:

• Formato Estándar (FCS 2.0, FCS 3.0).

• Archivo de Texto.
• Información de cada célula.
• Necesidad de compartir y comparar datos entre diferentes laboratorios y equipos.
 Software (I)

• Distinguimos 3 tipos de archivos:

o Documento o Protocolo o Plantilla: es exclusivo del software. Nos

permite visualizar los datos y escoger la información que deseamos
guardar.

o Instrument Settings: es un archivo de la configuración de los

detectores. Nos permite guardar las condiciones de adquisición para
poder adquirir muestras en las mismas condiciones.

o Data: archivo FCS. Contiene la información sobre la muestra y es

estándar. Eso nos permite analizar estos datos con otros softwares
distintos al de adquisición.
 Software (II)

• Las diferentes formas de representar los datos en el software son, en

general:

o Gráficos de puntos biparamétricos:

Dispersión Densidad Contorno

 Software (III)

Gráficos monoparamétricos: Gráficos especiales:

 Software (IV)
¿Cómo estudiamos la población que nos interesa?
• Utilizamos Regiones y “Gates”. Eso nos permite estudiar poblaciones
concretas.
 Esquema de un citómetro-
Separador
D
B
F SSC

Detectores
H
(PMTs)

Laser 488nm E A
FSC C Datos
Laser 633nm Filtros

Placas
deflectoras
+ + - Análisis
- Filtros

Detectores
(PMTs)

Muestra
 Aplicaciones de la citometría de flujo
· Inmunofenotipaje · Análisis de marcadores de superfície

· Análisis de proteínas
· Proliferación celular
intracelulars

· Ciclo celular (ploidías) · Comprobación eficiencia de

transfección, análisis de proteinas
· Apoptosis fluorescentes.

· Estudio de microorganismos
· Esayos funcionales
(potencial de membrana · Fosforilación de proteínas
mitocondrial, extrusión
sondas fluorescentes, · Sorting de poblaciones puras
metabolismo oxidativo…) con características específicas de
interés.
 Aspectos a tener en cuenta en el planteamiento
de un experimento de citometría de flujo

• Qué fluorocromos podemos medir?

• Qué fluorocromos queremos medir?
• Cuántos queremos medir
simultáneamente?
• Cómo interaccionan entre ellos?
 Aspectos a tener en cuenta en el planteamiento
de un experimento de citometría de flujo
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-
Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html
http://www.bdbiosciences.com/us/s/spectrumviewer
 Aspectos a considerar

• El equipo da valores absolutos.....pero no sabe si una

muestra presenta fluorescencia o no. Es necesario
referenciarla a un control.
• Aumentar la velocidad de paso de la muestra (aumentando
el diferencial de presiones) dificulta la resolución de las
poblaciones.
• El software nos permite ver los datos de una forma
estadística. Nos muestra los datos de manera que los
podamos interpretar.
• Antes de diseñar un experimento preguntad al personal de
la UAT.
 UAT – Plataforma de Citómica
En la UAT, disponemos de 2 citómetros FacsCalibur de BD. Los
citómetros disponen de 2 LASERS.
• LASER Azul que emite luz a 488nm de longitud de onda.
• LASER Rojo que emite luz a 633nm.
Detección de 4 fluorescencias simultáneamente. 3 en el LASER
Azul y 1 en el LASER Rojo.
 UAT – Plataforma de Citómica
Disponemos de 1 citómetro Fortessa de BD. Equipado con 4 LASERes.

• LASER Azul que emite luz a 488nm de longitud de onda.

• LASER Rojo que emite luz a 633nm de longitud de onda.
• LASER Violeta que emite luz a 405nm de longitud de onda.
• LASER Amarillo-verde que emite luz a 561nm de longitud de onda.

Detección de 16 fluorescencias simultáneamente. 2 en el azul, 5 en el

Amarillo-verde, 3 en el Rojo y 6 en el Violeta.
 UCTS – Plataforma de Citómica

• También disponemos de 1 separador celular que disponen

de 4 LASERES (488 nm, 633 nm , 405 nm , 561 nm) y
13 detectores de fluorescencia.
 Prácticas

 Se realizarán unas prácticas para aprender a

usar el citómetro en sus aspectos más básicos:
 Encender el citómetro
 Crear un documento de trabajo
 Pasar muestras
 Compensar
 Obtener datos
 Apagar el citómetro
 Análisis de datos básico FCSExpress
 UAT – Plataforma de Citómica

Responsable UAT:
Dra Rosa Prieto email: [email protected]
Responsable Plataforma de Citómica:
Dra Irene Sales email: [email protected]
Email plataforma: [email protected]
Telf: 934894179 (ext.4179)
Multicolor Flow Cytometry
Alberto Crespo Guardo, PhD.
Application Specialist
BD Biosciences
Master of Immunology
March 25th, 2019
 Agenda

• Normas básicas para el diseño de paneles (60 min)

• Ejercicio práctico: diseño de un panel (45 min)

• Uso del la herramienta GPS (Guided Panel Solution) (15 min)

© 2017 BD. BD, the BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company.

2
Previous considerations
e.g. Defining T- and B-cell populations
Singlets Lymphocytes B-cells

CD27
FSC

CD3
SSC CD19 IgD
Marker CD3+ Lymphocytes CD4 T-cells
CD45RA

CD127
CD3

CD8
CD4 + IgD
CD19
CD25
CD4 CD25
CD127
CD8 T-cells Th cells Tregs
CCR7
CD27
CCR7

CCR7

CCR7
CD8

Menganito et al., 2019

CD45RA CD45RA CD45RA
Previous considerations
e.g. Defining T- and B-cell populations
Menganito et al., 2019
Fluorochrome Marker Marker Fluorochrome
BD Horizon™ V450 CD45RA CCR7 BD Horizon™ V450
BD Horizon™ V500 CD3 CD4 + IgD BD Horizon™ V500
FITC CD4 + IgD CD3 FITC
PerCP-Cy™5.5 CD19 CD8 ???
PE-Cy™5 CD25 CD25 PE-Cy™5
PE-Cy™7 CD127 CD27 PE-Cy™7
Alexa Fluor® 647 CCR7 CD19 ???
Alexa Fluor® 700 CD27 CD127 Alexa Fluor® 700
APC-H7 CD8 CD45RA APC-H7

Scenario 1:
Scenario 2:
Have you checked
You will save
your instrument
abs but… have
and its
you checked
configuration?
how it works?
Elements of multicolor flow cytometry

Considerations in designing panels

Biology Instrument Fluorochrome

Antigen density & Set-up and Brightness and
Co-expression Sensitivity Spillover
 The power of flow cytometry: enables
single-cell protein expression analysis & quantitation

Cell Lysate
from
Total Cells
Protein 1 Average
Heterogeneous
cells vs
Protein 2
Single Cells

Undifferentiated Differentiated
Protein 1
1% 57%

Protein 1
Protein 2 Protein 2
 Leucocyte antigen expression
• Primary CD4
Well characterized, easily classified as
positive or negative, typically define broad
subsets or lineages
– Examples: CD3, CD4

• Secondary CD45RA

Well characterized, typically expressed at

a higher density, often over a continuum
– Examples: CD28, CD45RA, CD45RO

• Tertiary CD95
Expressed at low levels, variable upon
activation, unknown, critical
– Examples: CD95, CD25, CD69

Mahnke YD, Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 2007;27:469-485.
How to know the expression levels of
your cells?

• Previous lab work

• Scientific literature
• Testing
• Asking to BD: “Our scientific support can help
you!” ([email protected] or
[email protected])
Defining the human antigen proteome
• Assess the density of surface antigens of all known CD markers on
normal blood cells
• Create an antigen density and expression resource for use in
multicolor panel design
Elements of multicolor flow cytometry

Considerations in designing panels

Biology Instrument Fluorochrome

Antigen density & Set-up and Brightness and
Co-expression Sensitivity Spillover
Resolution vs background & spread

• Resolution: The degree to which a flow cytometer can distinguish

dimly stained cells from unstained cells.

“Negative” Dim Bright

Negative population has low

background; populations well
resolved. The ability
to resolve
populations is a
Negative population has high function
background; populations not resolved. of both
background
and spread of
Negative population has low the negative
background but high rSD (spread); population.
populations not resolved.
Fluorescence spillover

rSD

PE-Cy7
rSD
Fluorochromes spill over into other
detectors; for example, PerCP-Cy5.5
spills into the PE-Cy7 detector. PerCP-Cy5.5

This fluorescence spillover contributes to:

This “background” is subtracted in the
• Increased background (MFI)
process called compensation.
• Spread (measured as rSD)

Negative Positive
MFI rSD MFI rSD
No
12 29 3,098 291
comp
Comp 4 29 3 289
 Spread affects the panel resolution

• CD4 PE causes spread in PerCP-Cy5.5 channel

 Assessing resolution using CD4, CD19
and CD127
• CD4, CD19 and CD127 are receptors known
to be expressed at high (45,000 receptors),
medium (10,000 receptors) and low (2,500
receptors) density, respectively, on normal
human lymphocytes
• Blood cells are stained with antibody
•
conjugated with different fluorochromes
compatible with the instrument
configuration
 Resolution: CD4 (high)
BUV395 BUV496 BUV737 BV421 BV510 BV605

BV650 BV711 BV786 FITC BB515 PerCP-Cy5.5

PE PE-CF594 PE-Cy7 APC APC-R700 APC-H7

 Resolution: CD19 (medium)
BUV395 BUV496 BUV737 BV421 BV510 BV605

BV650 BV711 BV786 FITC BB515 PerCP-Cy5.5

PE PE-CF594 PE-Cy7 APC APC-R700 APC-H7

 Resolution: CD127 (low)
BUV395 BUV737 BV421 BV510

BV650 BV711 BV786 FITC BB515 PerCP-Cy5.5

PE (YG) PE-CF594 (YG) PE-Cy7 (YG) APC APC-R700 APC-H7

Elements of multicolor flow cytometry

Considerations in designing panels

Biology Instrument Fluorochrome

Antigen density & Set-up and Brightness and
Co-expression Sensitivity Spillover
 Evolution of fluorochromes
25

Number of colors
20
Sirigen
polymers

15
Qdots®

10 Tandems
(protein)

5 Phycobiliproteins

Organic
dyes
Year
0
1960 1980 2000 2020

• The development of new fluorescent dye choices,

plus development of monoclonal antibody reagents,
has driven major advances in flow cytometry.
CD Nomenclature 2015: Human Leukocyte Differentiation Antigen Workshops as a Driving Force in
Immunology. Engel P, Boumsell L, Balderas R, et al. J Immunol. 2015 Nov 15;195(10):4555-4563.
 Fluorochrome choices
Emission

Ultraviolet BUV395 BUV496 BUV563 BUV661 BUV737 BUV805

(355 nm)

BV480
Violet BV421
BV510 BV605 BV650 BV711 BV786
(405 nm) V450
V500
BB515 BB700
Blue PerCP
Laser

FITC PE PE-CF594 PE-Cy™5 PE-Cy™7

(488 nm) Alexa Fluor ®
PerCP-
488 Cy5.5

Yellow/Green
(561 nm)
PE PE-CF594 PE-Cy5 PE-Cy5.5 PE-Cy7

Red
APC APC-R700 APC-H7
Alexa Fluor® Alexa Fluor®
(640 nm)
647 700 APC-Cy7

Choice of fluorochromes depends on the available instrument configuration

and the total number of markers being used in an experiment.
 Fluorochromes reveal biology
PE PE-CF594 BV421 Alexa Fluor® 647
CD3

PerCP-Cy™5.5 Alexa Fluor® 700 V450 FITC

CD197/CCR7

• The proper choice of fluorochrome helps us understand

more about the biology of the experiment
• Bright dyes are important when looking at dim antigens
What about using the “vintage”
fluorochromes?

BUV395 CD3

PacBlue CD14

AmCyan CD19

BV786 CD27

FITC CD45Ra

PerCP-Cy5.5 CD4
What about using the “vintage”
fluorochromes?

BUV395 CD3 BUV395

PacBlue CD14 BV421

AmCyan CD19 BV510
BV786 CD27 BV786

FITC CD45Ra BB515

PerCP-Cy5.5 CD4 PerCP-Cy5.5

New BD Horizon Brilliant™ dyes

• Seven fluorochromes excited by the violet laser

– Base polymers: BV421, BV510 and BV480new
– Tandems: BV605, BV650, BV711 and BV786

• Six fluorochromes excited by the 355-nm UV laser

– Base polymer: BUV395
– Tandems: BUV496, BUV563, BUV661, BUV737, BUV805

• Two fluorochromes excited by the blue laser

– BB515 brighter alternative to FITC
– BB700 brighter alternative to PerCP-Cy5.5

• … and more
Fluorochrome characterization
• Fluorochromes have intrinsic properties
relevant to panel design
– Brightness
– Spillover

• The performance of a given fluorochrome is

also a function of the instrument
– Set-up
– Detector sensitivity
– Laser power
– Laser wavelength
– Detector Filter sets
Fluorochrome characterization: Brightness

• Blood cells are stained with anti-CD4

conjugated with fluorochromes compatible
with the instrument configuration

• Samples are acquired using optimized

Instrument Settings

• Stain index is calculated and fluorochromes

are ranked by brightness
Sensitivity measured by Stain Index
Stain Index = ( MFIPos – MFINeg ) / (2 x rSDNeg )

SI: 360

MFIpos- MFIneg
SD neg
Sensitivity measured by Stain Index
Stain Index = ( MFIPos – MFINeg ) / (2 x rSDNeg )

SI: 135
ha bajado

MFIpos- MFIneg
SD neg
Fluorochrome characterization: Brightness
Specific fluorochrome ranking
Stain Index

• Ranks each individual fluorochrome for a true understanding of

brightest to dimmest on a specific instrument
• This data can be paired with antigen density data for optimal
fluorochrome-marker selection
Fluorochrome characterization: Brightness
Antigen/fluorochrome combinations
Low Medium High

Fluorochrome

Very Bright Bright Moderate Dim

BD Horizon BUV661
Ultraviolet BD Horizon BUV737
BD Horizon BUV395
BD Horizon BUV805
(355 nm) BD Horizon BUV496
BD Horizon BUV563

BD Horizon BV421 BD Horizon BV480

Violet BD Horizon BV650 BD Horizon BV605 BD Horizon BV510
BD Horizon V450
(405 nm) BD Horizon V500
BD Horizon BV711 BD Horizon BV786

BD Horizon BB515 FITC

Blue PE
Laser

BD Horizon PE-CF594 Alexa Fluor® 488 PerCP

(488 nm) PE-Cy7
PE-Cy5 PerCP-Cy5.5

PE
Yellow/Green BD Horizon PE-CF594
(561 nm) PE-Cy5
PE-Cy7

APC Alexa Fluor® 700

Red Alexa Fluor® 647 APC-H7
(640 nm) BD Horizon APC-R700 APC-Cy7

Basic concept of panel design:

“for low expressed antigens use brightest available fluorochrome”.
Fluorochrome characterization: Spillover

• Fluorescence spillover is an important factor

in creating a panel design with good
resolution of populations of interest
•

• Incorrect or poor calculation of spillover

values (SOVs) negatively impacts the quality
of data obtained from an assay
What are some sources of spillover?

Adjacent
FITC and PE
detectors

Residual base
BV786 and BV421
fluorescence

Similar
emission spectra BUV737 and BV711
(cross-laser)
Fluorochrome characterization:
Spread analysis

• Blood cells are stained with anti-CD4

conjugated with fluorochromes compatible
with the instrument configuration
• Samples are acquired using optimized
instrument settings
• For each fluorochrome, an nxn analysis is
performed to visually assess the spread
introduced into each detector
CD4s by BB515

UV

RED

V
CD4s by BB515

UV

RED

V
CD4s by BB515

UV

RED

V
 Do I have to know this?

• RIM (Resolution impact matrix)

– The loss of resolution in different cytometer configurations can be measured
– It depends on optical filters in the cytometer (optical configuration)
The panel design process

MARKER A MARKER B

Are they
A+ B+ co-expressed? A+ B+
NO YES
No problem with
spillover/spread
Relative
Assign fluorochromes based
upon antigen density. A>>B Expression B>>A

Reiterate
Your Panel Choose
Reagents

For B use a For A use a dim fluorochrome

bright Test Your Panel that causes minimal loss of
fluorochrome resolution of the A+B+
population

Do you
Understand
- Why? NO
get good
resolution YES
SUCCESS
?
Other factors to take into account in
Panel design…
• We will apply the principles of panel design
to achieve optimal resolution of key
memory T-cell populations:

– Design panels on multiple instruments with

varying capabilities
Exclude unwanted cells

Choices for Choices for

dead-cell exclusion lineage exclusion

Dead cells
Lineage cells
Cells of interest
Viability Staining Improves Results

• Gating out dead cells leads to more accurate

statistics
Lineage exclusion by light scatter

SSC-A

APC
SSC-A FSC-A CD4 FITC

APC
FSC-A CD4 FITC

• In peripheral blood, different cell lineages can

be easily discriminated based on light scatter.
Lineage Exclusion by Light Scatter is not
Sufficient for Rare Population Detection

SSC-A
SSC-A

FSC-A c-kit Sca-1 FSC-A

• In samples such as mouse bone marrow, detection

of rare stem cells is confounded by the
overwhelming presence of lineage cells
• The use of lineage markers is needed to clearly
detect rare populations of interest.
Experimental goal
• Use best panel design practices to optimize
panels for identification of different T-cell subsets
Panel design: Know the biology

Marker Ag Density Class TN TSCM TCM TEM

CD95 Low Tertiary - + ++ +

CD183/CXCR3 Low Tertiary + + ++ +
CD197/CCR7 Low Primary + + + -
CD27 Medium Primary + + + -
CD45RO Low-to-Hi Secondary - - ++ ++
CD45RA Low-to-Hi Secondary +++ +++ + +
Lin/LD Med-to-Hi Primary +++ +++ +++ +++
CD3 High Primary +++ +++ +++ +++
CD8 High Primary +++ +++ +++ +++
Different systems configurations…

• Laser sources

• Filters
2-Laser system: Blue/Violet configuration
2-Laser system:
Instrument characterization

* SI –based on CD4 staining profile

X-20 2-Laser configuration
BV421
BV510

Stain Index
BV605
405 nm
BV650
BV711
BV786
FITC
PE
488 nm PE-CF594
PerCP-Cy5.5
PE-Cy7

4
8
 Spread Analysis: PerCP-Cy5.5

~380 ~480 ~530 ~570 ~610 ~660 ~720 ~780

Laser
BV421 BV510 BV605 BV650 BV711 BV786

Violet

FITC PE PE-CF594 PerCP-Cy5.5 PE-Cy7

Blue

CD4 PerCP-Cy5.5

• PerCP-Cy5.5 is a dim fluorochrome with

significant impact on other fluorochromes
(adjacent and cross-laser)
Spread Analysis:
Fluorochromes impacting PerCP-Cy5.5

CD4 PE-CF594

CD4 BV711
CD4 PE

PerCP-Cy5.5

• PerCP-Cy5.5 is a dim fluorochrome with significant impact

on other fluorochromes (adjacent and cross-laser)
• PerCP-Cy5.5 is also impacted by other fluorochromes
• The viability dye 7-AAD is detected in the same channel
• PerCP-Cy5.5 is a good choice for a dump channel
 Spread Analysis: BV421

~380 ~480 ~530 ~570 ~610 ~660 ~720 ~780

Laser
BV421 BV510 BV605 BV650 BV711 BV786
Violet

FITC PE PE-CF594 PerCP-Cy5.5 PE-Cy7

Blue

CD4 BV421

• BV421 is a bright fluorochrome with

minimal impact on other fluorochromes
Spread Analysis:
Fluorochromes impacting BV421

• BV421 is a bright fluorochrome with minimal impact on other

fluorochromes
• BV421 is minimally impacted by other fluorochromes
• BV421 is a good choice for critical markers expressed at low levels
(CD183/CXCR3, CD95)
 2-Laser system panel design

ANTIGEN ASSIGNMENT
Marker Ag Density Fluorochrome Laser
CD95 Low PE
CD183/CXCR3 Low BV605
CD197/CCR7 Low BV786
CD27 Medium BV421
CD45RO Low-to-High PE-CF594
CD45RA Low-to-High PE-Cy7
*Lin/LD Med-to-High FITC
CD3 High PerCP-Cy5.5
CD8 High
BV510

* Lineage markers – CD4, CD19, CD14

2-Laser system panel design
 2-Laser panel

TEM
Tem TCM
Tem TSCM Tscm
Lin/LD PerCP-Cy5.5

CD45RO PE-Cy7
CD8 FITC

CD95 PE
TN
Tn

CD3 BV510 CD3 BV510 CD197 PE-CF594 CD183 BV421

CD45RA BV605

CD27 BV786
Panel review: Maintained resolution
Single Stain

CXCR3 CD3 CD8 CD95 CD4/CD19/CD14

BV421 BV510 FITC PE PerCP-Cy5.5

Panel
Panel review: Loss of resolution
Single Stain

CCR7 CD45RO CD45RA CD27

PE-CF594 PE-Cy7 BV605 BV786

Panel
2-Laser configuration panel review
Marker Ag Density Fluorochrome Resolved Impacted
CD95 Low PE √
CD183/CXCR3 Low BV421 √
CD197/CCR7 Low PE-CF594 X
CD27 Medium BV786 X
CD45RO Low-to-Hi PE-Cy7 X
CD45RA Low-to-Hi BV605 X
Lin/LD Med-to-Hi PerCP-Cy5.5 √
CD3 High BV510 √
CD8 High FITC √

• PE and BV421 allowed for good resolution of TSCM

• BV510 and PE-CF594 impact the resolution of BV605
• BV605 is impacting the resolution of BV786
5-Laser system: B/V/R/YG/UV configuration
5-Laser system:
Instrument characterization
X-20 5-Laser Configuration
BUV395 * SI –based on CD4 staining profile
Very Bright
BUV496
355 nm
BUV661

Stain Index
BUV737
Bright
BV421
BV510 Moderate
BV605
405 nm Dim
BV650
BV711
BV786
FITC
488 nm
PerCP-Cy5.5
PE
561 nm PE-CF594
PE-Cy7
APC
640 nm APC-R700
6
APC-H7
0
5-Laser configuration: Panel design
5-Laser
3-Laser System

Markers Ag Density Fluorochrome

CD95 Low PE
PE-YG (-B)
CD183/CXCR3 Low BV421
CD197/CCR7 Low AF647
CD27 Medium BV786
BUV737 (BV786)
CD45RO Low-to-Hi PE-Cy7
PE-Cy7-YG (-B)
CD45RA Low-to-Hi FITC
BB515 (FITC)
Lin/LD Med-to-Hi PerCP-Cy5.5
CD3 High BV510
CD8 High APC-H7
BUV395 (APC-H7)
 5-Laser panel

TEM TCM TSCM

Lin/LD PerCP-Cy5.5

CD45RO PE-Cy7
CD8 BUV395

CD95 PE
TN

CD3 BV510 CD3 BV510 CD197 AF647 CD183 BV421

CD45RA BB515

CD27 BUV737
 Panel review: Maintained resolution
Single Stain

CD45RA CD95 CD45RO CD197 CD8

BB515 PE PE-Cy7 AF647 BUV395

Pan
el

63
Panel
 Panel review: Maintained resolution
Single Stain

CD27 CD183 CD3 CD4/19/14

BUV737 BV421 BV510 PerCP-Cy5.5

64
Panel
5-Laser configuration panel review
Marker Ag Density Fluorochrome Resolved Impacted
CD95 Low PE √
CD183/CXCR3 Low BV421 √
CD197/CCR7 Low AF647 √
CD27 Medium BUV737 √
CD45RO Low-to-Hi PE-Cy7 √
CD45RA Low-to-Hi BB515 √
Lin/LD Med-to-Hi PerCP-Cy5.5 √
CD3 High BV510 √
CD8 High BUV395 √
 Designing a panel

Departamento de aplicaciones

Barcelona 2019

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6
6
 Our aim: design (correctly) a simple panel

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6
7
 A. Cytometer configuration

• Cytometer: FACSCantoII 3L 8C
Workshop citometría multicolor

Blue laser
• FITC/BB515
• PE
• PerCP-Cy5.5
• PE-Cy7
Red laser
•APC
•APC-H7

Violet laser
•BV421
•BV510

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 B. Fluorochrome brightness
Workshop citometría multicolor

Fluorochome Brightness
BV421 High
405 nm
BV510 Dim
FITC Dim
PE High
488 nm
PerCP-Cy5.5 Dim
PE-Cy7 High
APC High
640 nm
APC-H7 Dim

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 C. Markers: their expression levels & coexpression
• Hierarchy and population of interest • Expression levels:
Workshop citometría multicolor

Leucocytes CD45+

Ag
Marker
density
Granulocytes CD16+ Lymphocytes
CD3 High

CD4 High
T cells CD3+
Activated CD25 Low
neutrophils
CD11b +/- CD11b Low
TH cells CD4+
CD16 Medium

activated TH CD45 High

cells CD25
+/-

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 D. Spread/coexpression issues (Resolution Impact Matrix)
Workshop citometría multicolor

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 Matching rules

Ag Fluorochome Brightness
Workshop citometría multicolor

Marker
density
BV421 High
CD3 High
BV510 Dim

CD4 High FITC Dim

CD25 Low PE High

1) Ag. Density <-> Flurochrome brightness PerCP-Cy5.5 Dim

CD11b Low 2) Coexpression in populations of interest
PE-Cy7 High
CD16 Medium
APC High
CD45 High
APC-H7 Dim

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 Matching rules

Ag Fluorochome Brightness
Workshop citometría multicolor

Marker
density
BV421 High
CD45 High PE High

CD3 High APC High

PE-Cy7 High
CD4 High
PerCP-Cy5.5 Moderate
CD16 Medium
FITC Moderate
CD25 Low
BV510 Moderate
CD11b Low APC-H7 Dim

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 Designing a panel

Soluciones panel
Workshop citometría multicolor

A B C

CD45 FITC PerCP-Cy5.5 FITC

CD3 PerCP-Cy5.5 FITC PerCP-Cy5.5

CD4 BV510 BV510 BV510

CD16 APC APC PE-Cy7

CD25 PE PE PE

CD11b BV421 BV421 BV421

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 GPS

Departamento de aplicaciones

Barcelona 2019

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7
5
http://www.bdbiosciences.com/eu/applications/research/multicolor-flow/m/745795/resourcestools

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

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 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

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Some useful tools

 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

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 https://www.bdbiosciences.com/us/tools/s/gps

Some useful tools

Summary
• Multicolor flow cytometry has become more
accessible with advances in system capability and
fluorochrome availability
• When designing a panel it is important to have:
– Information about cell biology
– Information about available flow cytometers
• Familiarity with excitation and detection optics to understand
what fluorochromes are usable
– Information about spectral characteristics of usable
fluorochromes
• Fluorochrome resolution ranking
• Impact of fixation method on fluorochrome brightness
Thank you!