Dra. Ana María Enríquez M.

HISTOTECNIA
Los métodos para la obtención de preparaciones histológicas ocupadas en los estudios de
microscopia óptica, se engloban en la Técnica Histológica. La Técnica Histológica o
Histotecnia abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar
los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con imágenes de estructuras
contrastadas, para su estudio bajo microscopia óptica o electrónica.

Para empezar con la técnica histológica se debe obtener una MUESTRA DEL TEJIDO a
estudiar y existen 2 formas:
 Necropsia: Examen u obtención de tejido de un organismo muerto.
 Biopsia:(del griego bios = vida y oasis = visión) Examen u obtención de tejido de un
organismo vivo. Puede ser incisional, excisional, por sacabocado, por punción y
absorción, por raspado, por trepanación.

FIJACIÓN:
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias
finalidades:
1. Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in
vivo.
2. Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.
3. Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos.
4. Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.
Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la
Autolisis y llevarían a la DEGENERACIÓN POST MORTEM.
La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las
proteínas.
Los agentes más usados para Microscopia de Luz son:
Formaldehído al 5%, Formol al 10% o Formalina (Solución de Formaldehído especial)
Glutaraldehído al 2.5%, Tetróxido de Osmio, Líquido de Helly y Fijador de Bowie
Cloruro de Mercurio y Ácido Pícrico
Para Microscopia Electrónica se usan como fijadores:
Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído, Tetróxido de Osmio y Permanganato de Potasio.

Regla de Oro para la Fijación

 La mejor fijación es cuando ha pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la
fijación, cerca de 12 horas.
 Tamaño de la Muestra que debe ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual se va a
utilizar.

DESHIDRATACIÓN
Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata.
Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual
de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol
Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solución de 60%, 70%, 80%,
90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua.
Esto se hace porque si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría. Tiempo 6 a 24 horas.

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ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible
tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos
se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada es
el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de
Xilol, el Xilol solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se
torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción.
También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.
Tiempo de 1 a 6 horas.

NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse
también se extraen las grasas y los lípidos de la célula, por lo que se utilizan colorantes de
Sudan.

INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN
A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al
microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de
consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina.
El objeto de la inclusión es:
 Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.
 Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.

La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado

líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general
se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C,
colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura
a 60º C.
Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por
ellos son ahora ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina
fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a
temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido
incluido, a este bloque se le denomina Taco.

Los medios de inclusión para Microscopia Electrónica comúnmente utilizados son resinas
polimerizadas.

SECCIÓN O CORTE
El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir
el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor
entre 3 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento
o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos con
la Técnica de Congelación de Tejidos. Un tejido congelado, es los suficientemente duro
para ser cortado.
Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquido para tener una congelación rápida.
Luego se corta con un aparato especial denominado MICROTOMO DE CONGELACIÓN,
existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de congelación llamado
CRIOSTATO. La ventaja de esta técnica es que los cortes que se obtienen son muy rápidos,
se puede utilizar en el diagnóstico de material patológico, tomado en intervenciones
quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación.

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Para Microscopia Electrónica se requieren cortes más delgados (denominados ultra fino)
de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado medio. Para esto se
utiliza un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O DIAMANTE. Una vez preparados, se
montan sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.

MONTAJE Y TINCIÓN
Los cortes todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos
se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña
cantidad de Albúmina, la cual actúa como adhesivo.
La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra
se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico
hasta llegar a una solución 100% de agua.

Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:

 Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula.
 Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz
extracelular.
 Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos.

FUNDAMENTOS QUÍMICOS DE LA COLORACIÓN

Los COLORANTES BÁSICOS es una molécula de anilina que tiene una o más cargas
positivas en su porción coloreadas y su fórmula general se representa: ANILINA+ Cl-.
reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los componentes texturales, que son los
grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de los
glucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La reacción de estos
grupos varía según el pH.

La Hematoxilina no es un colorante básico en sentido estricto. Se la utiliza con un Mordiente

(Intermediario), entre el componente textural y la anilina, y es debido a este que la
coloración con hematoxilina se asemeja a la tinción que produce un colorante básico. La
unión en el complejo TEJIDO – MORDIENTE – HEMATOXILINA, no consiste en un simple
enlace, y cuando la Hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido, sino que
permanece firmemente adherida. A causa de esto, la Hematoxilina se presta para aquellos
procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la Eosina u otros colorantes ácidos.
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con
Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta BASOFILIA. Estos componentes
son:
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 La Heterocromatina y los Nucléolos del Núcleo por los grupos Fosfato ionizados.
 Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ionizados.
 Matriz del Cartílago por grupos Sulfato ionizados.

Un COLORANTE ÁCIDO lleva una carga negativa en la porción coloreada de la molécula

y su fórmula general se representa: Na+ ANILINA-
Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son
ACIDÓFILOS y que presentan ACIDOFILIA. Son Acidofilas:
 La mayor parte del citoplasma no especializado.
 Filamentos Citoplasmáticos.
 Fibras extracelulares.

METACROMASIA
Es el fenómeno por el cual un colorante (por ejemplo Azul de Toluidina o la tionina) cambia
de color tras reaccionar con un componente textural.
Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES, la molécula del
colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorción son diferentes de las
propiedades de las moléculas individuales. Se interpreta que la metacromasia refleja gran
cantidad de cargas aniónicas muy cercanas unas a otras en el tejido, una situación
prevalerte en la sustancia fundamental del cartílago y en los gránulos de los mastocitos, el
Azul de Toluidina tiñe a estos de color púrpura.
Los componentes titulares que pueden colorearse meta cromáticamente, denominados
Cromotropos, son principalmente los glucosaminoglucanos sulfatados y las
nucleoproteínas.

LOS ERRORES EN LA HISTOTECNIA

En la manipulación de los procedimientos anteriores causan alteraciones en los tejidos que
reciben el nombre de artefactos, estos pueden ser:
 La deshidratación rápida en altas concentraciones de alcohol o el excesivo calor de
la parafina producen retracciones, esto es separación de los tejidos que en vida
eran vecinos.
 La cuchilla del micrótomo mal afilada presenta muescas microscópicas que al cortar
los tejidos producen líneas de destrucción llamadas mellas o estrías.
 Cuando el baño de flotación no tiene la temperatura adecuada, los cortes no se
extienden completamente, causando dobleces anormales en el tejido llamados
arrugas o pliegues.

[Link]/watch?v=56ypQVoZB_Q video para recapitular

Recuerde estudiar la tabla Tinciones de uso habitual y sus características (en la

última página del libro de texto)

BIBLIOGRAFÍA
Leslie, G. (2015). Histologia, Texto y Atlas. Mexico: Mc Graw.
Ross, P. (2015). Histologia Texto y Atlas Color. Mexico: Panamericana.
Sobbota, H. (2013). Atlas en color de Anatomia Microscopica. Mexico: Panamericana.