MICROBIOTA

Introducción

La microbiota es el conjunto de microorganismos (bacterias, hongos, arqueas, virus y

parásitos) que reside en nuestro cuerpo, que a su vez pueden diferenciarse en comensales,
mutualistas y patógenos. El término microbioma hace referencia a todo el hábitat, incluidos
los microorganismos, sus genes y las condiciones ambientales, pero en la práctica ambos
términos se usan indistintamente, confundiendo el sufijo bioma (comunidad) con el
de oma (conjunto) . En cada una de las diferentes localizaciones de nuestro organismo
1

podemos encontrar ecosistemas microbianos complejos. El más complejo, diverso y

numeroso es el asociado al aparato digestivo, particularmente en el ciego, donde la
densidad de microorganismos es la mayor que hay en nuestro organismo. Estas
comunidades tienen un comportamiento simbiótico y mutualista con las células eucariotas
humanas, son imprescindibles para el correcto funcionamiento de nuestro organismo,
mantienen un importante diálogo con el sistema inmune y tienen funciones homeostáticas
que condicionan nuestra salud . Numerosas evidencias científicas han implicado al
2

microbioma intestinal y su potencial metabólico en diversos estados patológicos en los

últimos años, originando nuevas estrategias terapéuticas para controlar y regular este
ecosistema . Entre estos nuevos enfoques se encuentra la transferencia de microbiota fecal,
3

con una popularidad creciente dado su éxito en el tratamiento de la diarrea recurrente

causada por Clostridium difficile .
4

El conocimiento de nuestro microbioma se ha visto considerablemente ampliado tras la

utilización de las técnicas moleculares de secuenciación masiva, especialmente las de
segunda generación, también conocidas como next generation sequencing. Para determinar
la composición de la microbiota siempre se han utilizado cultivos microbiológicos, pero
hoy en día se sabe que la mayor parte de los microorganismos de este ecosistema no se
pueden cultivar con los medios tradicionales, siendo únicamente posible su detección tras la
secuenciación de ADN como huella genética. La utilización de técnicas moleculares ha
permitido identificar y asignar taxonómicamente a la mayoría de los microorganismos sin
necesidad de cultivarlos . Este avance, así como otras técnicas microbiológicas que se
5

detallarán en el presente artículo, han supuesto una verdadera revolución en el

conocimiento de la microbiota y de su implicación en los estados de salud y enfermedad del
ser humano.

Consideraciones clínicas

Desde el nacimiento existe una relación simbiótica entre la microbiota y nuestras células
que evoluciona en el tiempo, adaptándose a los cambios . Por su enorme capacidad
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metabólica, se ha considerado a la microbiota como un «órgano» imprescindible para la

vida y con influencia en la salud y la enfermedad . Su composición presenta
7

particularidades y características propias de cada individuo, pudiendo variar en función de

la base genética, la dieta y la interacción con el medio ambiente.

El estudio de este ecosistema es un campo de rápido avance científico, aceptando

universalmente que para alcanzar un estado de salud adecuado es necesario tener también
una microbiota «sana». Nuestra microbiota experimenta cambios como consecuencia de la
influencia de múltiples factores, de un modo similar a los que experimenta cualquier órgano
de nuestro cuerpo desde la ontogenia a la muerte. Continuamente estamos expuestos a
factores que pueden influir, aunque una de sus características es su gran capacidad de
resiliencia (capacidad de adaptación frente a un agente perturbador o una situación adversa,
8

con posterior recuperación del estado inicial cuando cesa la alteración), recuperando
inmediatamente su estado natural, que se denomina con el término «eubiosis». El nivel de
estos cambios viene definido no solo por la naturaleza, la fuerza y la duración de la
alteración, sino también por la composición y la estabilidad de cada microbiota, asumiendo
que cada una es única para cada persona. En algunas ocasiones, la naturaleza de la
alteración es tan fuerte que condiciona alteraciones en su composición o en su
funcionamiento, alcanzando un estado de disbiosis. La disbiosis puede producirse en
cuestión de días, particularmente tras la ingesta de antibióticos, pero también puede ser
consecuencia de otras acciones a más largo plazo, fundamentalmente relacionadas con la
dieta.

En una persona adulta, el tracto gastrointestinal puede albergar entre 500 y 1.000 especies
de microorganismos, siendo las bacterias de los filos Bacteroidetes (≈25%)
y Firmicutes (≈60%) los mayoritarios. En menor proporción se
detectan Proteobacteria, Verrucomicrobia, Fusobacteria, Cyanobacteria,
Actinobacteria y Spirochaetes, las arqueas, los hongos, los protozoos, los virus y otros
microorganismos. También es importante mantener las proporciones equilibradas, y por
ello se ha establecido la ratio Firmicutes/Bacteroides como un parámetro para evaluar el
equilibrio de la microbiota intestinal y su funcionalidad. En los obesos esta ratio está muy
alterada por el aumento de los Firmicutes. El aumento de Firmicutes también se ha descrito
en ancianos de forma fisiológica como consecuencia de la edad.

Las principales funciones de la microbiota intestinal son prevenir la colonización por otros
microorganismos patógenos, ayudar a digerir los alimentos, producir vitaminas B y K que
el organismo humano no es capaz de sintetizar y, finalmente, y no menos importante,
estimular al sistema inmune. Tras el nacimiento, las células del sistema inmune carecen de
estímulos, reconociendo a todos los antígenos de su alrededor como parte del organismo y
bloqueando la respuesta inflamatoria contra ellos. Es por ello que los primeros contactos de
la microbiota con las líneas celulares inmunológicas sin diferenciar son muy importantes, y
van a ayudar a definir lo que es lo «propio» de lo «extraño». Este sistema y la microbiota
intestinal mantienen un diálogo continuo con carácter mutualista, pero si esta situación se
desequilibra puede iniciarse un proceso patológico. Esta parece ser la base de ciertas
enfermedades autoinmunes donde los antígenos de la microbiota intestinal representan un
estímulo suficientemente grande como para desencadenar una respuesta inflamatoria. En
otras enfermedades, como el síndrome metabólico y la obesidad, también se atribuye a la
microbiota intestinal el origen del estímulo que origina una respuesta inflamatoria basal
continuada.

Recientemente se ha descrito la existencia del eje cerebro-intestino, que conecta el sistema

nervioso central con la microbiota intestinal a través del nervio vago, el sistema
parasimpático, los metabolitos bacterianos, que pueden tener acciones como
neurotransmisores, y el sistema endocrino asociado al tracto digestivo . Así pues, además
9,10

de las enfermedades que clásicamente se han relacionado con alteraciones en la microbiota,

como la obesidad, la diabetes tipo 2, las enfermedades inflamatorias del intestino y las
alergias, últimamente también se han relacionado otras enfermedades del sistema nervioso
central, como el autismo, la ansiedad, la depresión y la dependencia alcohólica.

Actualmente se acepta que para alcanzar un estado de salud integral es necesario que
nuestra microbiota, particularmente la asociada al tracto gastrointestinal, también esté sana.
Los principales indicadores de salud de la microbiota son su riqueza (cantidad de
microorganismos) y su biodiversidad (cantidad de especies). Ambos parámetros se evalúan
con los índices de biodiversidad tipo alfa, como el de Shannon (refleja la heterogeneidad de
una comunidad con base en el número de especies presentes y su abundancia relativa), y el
índice de Chao (abundancia y representación de cada especie en todas las muestras).

Se han publicado numerosas asociaciones entre estados patológicos y alteraciones de la

microbiota, bien por presencia o aumento de determinados géneros, bien justamente por lo
contrario, ausencia o disminución de su concentración. Para evaluar y comparar la
microbiota de un paciente con la de un sujeto sano se emplean métodos computacionales de
ordenación, como el método de agrupamiento (clustering), o de reducción de las
dimensiones de las matrices de distancias que definen el conjunto de las muestras de cada
estudio. También se puede realizar un análisis de componentes principales, que permite
añadir otras variables clínicas.

Transferencia de materia fecal

Por el momento la única indicación para la transferencia fecal es la recidiva de la diarrea
por C. difficile, donde lo que se busca es restaurar de una forma ecológica la diversidad
bacteriana y la disbiosis causada por la diarrea y el patógeno. Las primeras guías
recomendaban realizar la transferencia en la tercera recidiva; sin embargo, en una reciente
revisión se recomienda su realización tras el segundo episodio de diarrea. En los casos en
los que la transferencia no obtenga resultados inmediatos, se puede realizar una segunda
transferencia en las mismas condiciones, y en el caso de que vuelva a fallar se puede volver
a realizar, pero utilizando otro donante .
11

Existen otras enfermedades donde la transferencia de materia fecal tiene un gran potencial
terapéutico: la enfermedad inflamatoria intestinal, la obesidad, el síndrome metabólico, las
enfermedades autoinmunes, las alergias, el síndrome de fatiga crónica y algunas
enfermedades neuropsiquiátricas. Para todas estas enfermedades se han publicado estudios
con transferencia de materia fecal, aunque los resultados no han tenido tanto éxito como en
la diarrea por C. difficile. De todas ellas, la colitis ulcerosa es la que mejores resultados
clínicos tiene, aunque parece que el éxito es dependiente del donante para cada paciente.

Los efectos secundarios de este procedimiento suelen ser escasos y poco relevantes.
Recientemente se ha realizado una revisión de 50 publicaciones relacionadas con la
transferencia fecal donde se pone de manifiesto que un gran número de pacientes
presentaron efectos adversos . Muchos de estos efectos secundarios están asociados a la vía
12

de administración de la infusión, siendo la colonoscopia la vía más segura. Se han descrito

casos de muerte por neumonía por aspiración, casi siempre ligados a la administración por
tubo nasogástrico. Sin embargo, todos los estudios señalan que, por el momento, no se
conocen los efectos adversos de la transferencia de heces a largo plazo. La ausencia de
enfermedades transmisibles en el donante es un requerimiento imprescindible, y las guías
internacionales recogen las afecciones que hay que descartar antes de aceptar a un donante.
Básicamente, el estudio que se hace al donante es semejante al que se realiza en cualquier
trasplante de órganos. Otra de las posibles aplicaciones de la transferencia de materia fecal
es la descontaminación intestinal de pacientes colonizados por bacterias multirresistentes a
los antibióticos. Por el momento se ha descrito la erradicación de enterococos resistentes a
vancomicina, estafilococos resistentes a meticilina y Klebsiella spp. productora de
carbapenemasa .13,14

Elección de la muestra

Como se ha descrito anteriormente, cada zona de nuestro organismo alberga su particular

microbiota y, por lo tanto, la muestra dependerá de la zona a estudiar. La gran mayoría de
los estudios se centran en la microbiota intestinal, ya que es la más numerosa y la que más
implicación tiene en nuestro estado de salud. Para el estudio de esta comunidad la muestra
más utilizada son las heces por su sencilla obtención no invasiva. Las desventajas que
tienen las heces son que no representan la totalidad de la microbiota adherida al epitelio
intestinal y que las bacterias de los tramos intestinales más superiores pueden estar
totalmente degradadas, impidiendo su correcta detección. En algunas afecciones, como la
enfermedad inflamatoria intestinal, se pueden aprovechar las biopsias obtenidas durante las
endoscopias rutinarias. La biopsia tiene la ventaja de ser una muestra más real, cuya
obtención y conservación están más estandarizadas, aunque también tiene como
inconvenientes su carácter invasivo, que únicamente recoge la microbiota de un punto
concreto, y que los enemas de preparación del paciente para la colonoscopia pueden
modificar su composición. Por todo ello, la muestra que más se utiliza son las heces en
lugar de la biopsia. Otra opción es utilizar exudados rectales, que reproducen perfiles de
microbiota similares a los encontrados en heces. Esta muestra se obtiene de forma sencilla
y se puede conservar inmediatamente al realizarse la toma en el propio centro. Además,
esta muestra se utiliza actualmente en todos los hospitales para el estudio de los pacientes
portadores de bacterias multirresistentes a los antibióticos con buenos resultados, aunque no
está asegurada la total representación de la microbiota.

Recogida, conservación y transporte

En el caso de que la muestra sean heces, las recomendaciones son recogerlas igual que para
un coprocultivo y congelarlas inmediatamente a −80°C, aunque también son aceptables
temperaturas superiores (hasta −20°C). La congelación previene posibles cambios en las
comunidades microbianas hasta que se pueda realizar la extracción de ácidos nucleicos. La
rapidez en la congelación es especialmente importante en el caso de que lo que se vaya a
extraer sea ARN, porque se degrada fácilmente a temperatura ambiente. Las torundas
rectales se pueden conservar hasta 2h a temperatura ambiente en un tampón estabilizador
sin impacto en la composición de la microbiota.

En el caso de que la muestra elegida sean las heces, el procedimiento más habitual es que
los pacientes las recojan en su domicilio, las conserven refrigeradas (4°C) o congeladas
(−20°C) y las entreguen lo antes posible en el centro donde se van a procesar. Pueden
existir factores que modifiquen los resultados finales, como la contaminación durante la
recogida, el tiempo hasta que se congelan, la congelación a temperaturas no muy bajas o la
descongelación durante el transporte al laboratorio. Cuando la muestra permanece a
temperatura ambiente se puede alterar la composición de su microbiota, por lo que se
recomienda su congelación inmediata. Otra posibilidad que se ha estudiado con buenos
resultados es congelar la muestra en los 15min siguientes a la defecación y conservarla
hasta 3 días en el congelador del domicilio.

Dependiendo de cada centro, según el tipo de muestra y del tiempo que se vayan a
conservar hasta su procesamiento, será necesario elegir el método más adecuado de acuerdo
con diferentes criterios, que incluyen el coste, la disponibilidad, la dificultad de uso, el
tiempo requerido para su manejo y si es compatible con otros métodos diagnósticos que se
vayan a utilizar en esa misma muestra .
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Procesamiento de la muestra: extracción de ácidos

nucleicos
Dentro de una misma muestra pueden existir diferentes microambientes con variaciones en
la composición de su microbiota, y por ello es muy importante realizar una buena
homogeneización mecánica antes de comenzar el proceso de la extracción. También es muy
importante disolver completamente la alícuota que se vaya a procesar de la muestra,
habitualmente 0,5g de heces en 5ml de agua, mediante agitación en vórtex o con la
utilización de bolitas de vidrio.

Sin duda, el paso más crítico de todo el proceso es la extracción y purificación de los ácidos
nucleicos, habitualmente ADN, ya que se necesita conseguir una buena cantidad y calidad
sin arrastrar sustancias que puedan inhibir las subsiguientes reacciones de PCR. Para la
extracción existen diferentes protocolos comerciales y manuales con los que, en general, se
obtienen buenos resultados.

Método de secuenciación

Con el avance tecnológico en secuenciación masiva se han desarrollado nuevos métodos

que pueden secuenciar directamente el ADN fragmentado o amplificado sin necesidad de
clonar. Estos métodos de secuenciación se conocen como métodos de segunda generación y
se agrupan en la definición de next generation sequencing. Los métodos de segunda
generación tienen muchas ventajas, entre ellas un menor coste, una reducción del tiempo de
preparación de las librerías y del proceso de secuenciación, una aceptable calidad de los
datos y, sobre todo, la generación de una gran cantidad de secuencias.

La secuenciación masiva con métodos de segunda generación requiere un paso previo de

amplificación por PCR que puede inducir a error, sobre todo por sobreestimar las
poblaciones mayoritarias. Aun así, estas técnicas representan, en la actualidad, el estándar
para el estudio de las comunidades microbianas, particularmente la microbiota humana.
Entre los métodos de secuenciación de segunda generación se encuentran aquellos basados
en la tecnología 454 de la empresa Roche, que fue pionera y que ya está fuera del mercado.
Actualmente las tecnologías más habituales disponibles son Solexa, comercializada por
Illumina, e Ion Torrent, comercializada por Thermo Fisher.

Para poder comparar los resultados de diferentes trabajos, es importante conocer las
diferentes metodologías y sus sesgos. El proceso de PCR presenta limitaciones, ya que
siempre se amplifica más lo más abundante, y se desprecian las poblaciones minoritarias.
Es importante también elegir bien los cebadores que se van a utilizar. Los más utilizados
amplifican la región V3-V4 del gen ADNr 16S, y fueron elegidos con base en su
«universalidad» para la mayoría de las especies bacterianas, aunque recientemente se ha
descrito que algunas especies de bifidobacterias y bacterias lácticas no se amplifican con
estos cebadores por fallos en la hibridación.

En el estudio de la microbiota basado en la taxonomía del gen del ARNr 16S se cuantifica
la abundancia relativa de cada filo, familia o género. Sin embargo, este método presenta un
inconveniente importante, ya que este gen tiene diferente número de copias en cada género
o especie. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis tiene una única copia del
gen, Helicobacter pylori tiene 2 copias, Staphylococcus tiene 7 copias y,
finalmente, Clostridium beijerinckii tiene 14 copias.

A pesar de los posibles sesgos y limitaciones técnicas que existen en la secuenciación

masiva, estas aproximaciones moleculares son herramientas muy poderosas, que suelen ser
reproducibles y permiten determinar cambios estructurales en las comunidades
microbianas. Por todo ello, la secuenciación masiva de segunda generación es considerada
como la mejor opción para estudiar el microbioma humano.

La tercera generación de secuenciadores ya está también en el mercado con varios equipos

en desarrollo. Los grandes avances que aportan son la secuenciación directa sin paso previo
de amplificación por PCR y la longitud de las secuencias obtenidas, que puede llegar hasta
varias kilobases. Sin embargo, una de sus desventajas es que tienen que mejorar la calidad
de las secuencias que se obtienen. Entre estos métodos de tercera generación se encuentra
el de Pacific Biosciences (PacBio), con el nuevo Sequel System, y el MinION, de Oxford
Nanopore.

Estrategias para la caracterización de la microbiota

 1)

Metataxonomía: es la estrategia más utilizada para caracterizar la composición y la

cantidad relativa de las comunidades microbianas, y su evolución en función del
tiempo o de otras variables clínicas. A partir de una muestra de heces a la que se
extrae el ADN total, se amplifica el gen ADNr 16S con cebadores universales y
después se secuencian masivamente los amplicones. A cada secuencia se le asigna
el grupo taxonómico mediante búsquedas en las bases de datos públicas
como Ribosomal Database Project, y después se analizan los resultados con
herramientas bioinformáticas, primero para validar la calidad (identidad≥98%) y
longitud (≥200pb) de las secuencias. El orden habitual de análisis bioinformático
incluye: a) control de calidad de las secuencias; b) eliminación de secuencias
quiméricas; c) agrupamiento de las secuencias por características de similitud y
solapamiento (clustering); d) asignación taxonómica, y e) análisis estadístico para
determinar las diferencias significativas .
16

En general, el proceso completo de secuenciación masiva suele quedar a cargo de

los servicios de secuenciación, debido a la alta especialización técnica necesaria y a
la limitación de la disponibilidad de los aparatos que se requieren para esta
metodología. En estas unidades se ofertan los conocimientos y las habilidades
necesarios para llevar a cabo la construcción de las librerías y la secuenciación de
acuerdo con los estándares de cada tecnología elegida. A pesar de que el
procesamiento final de los datos suele correr a cargo de un experto en
bioinformática, siempre es necesario atribuir un sentido biológico y microbiológico
a los resultados .
17

 2)
 Metataxonomía de la fracción activa. Los estudios de metataxonomía permiten
conocer la composición de la microbiota sin diferenciar entre las bacterias vivas y
las muertas, latentes o inactivas. La información funcional de las bacterias también
es importante, ya que puede incidir directa o indirectamente en nuestra salud. Para
poder identificar a las bacterias activas es necesario extraer el ARN de la muestra,
transformarlo en ADNc mediante retrotranscripción y, finalmente, secuenciarlo. De
esta forma solo se identifican las bacterias que se están dividiendo. Las técnicas y
tecnologías para el estudio son las mismas que en el caso de la metataxonomía,
salvo que en este caso el material de partida es la molécula de ARNr 16S.

 3)

Metagenómica. Este abordaje está basado en la secuenciación masiva de ADN o

ARN (o ADNc) para estudiar cómo las alteraciones en la composición microbiana
influyen en el contenido de genes y la expresión de los mismos. Este método,
desarrollado en los años 1980 y 1990, es conocido como shot-gun y permite leer las
secuencias de fragmentos de ADN o ARN sin amplificación previa. Es un método
que requiere una mayor computación de los datos y eso suele encarecer el proceso.
El conjunto de todos estos fragmentos se considera representativo del conjunto de
los genomas bacterianos presentes en la microbiota original. La secuenciación de
metagenomas permite obviar el importante sesgo introducido por el proceso de
PCR, ya que los fragmentos obtenidos se seleccionan al azar sobre el total de los
genomas presentes en la muestra original .
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 4)

Metabolómica. Esta estrategia aborda la identificación y caracterización de los

metabolitos desde un punto de vista funcional . La determinación cualitativa y
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cuantitativa de los metabolitos se considera como uno de los mejores marcadores de

la actividad microbiana, ya que son el producto final de una reacción metabólica,
independientemente de qué microorganismos o qué número de enzimas participan
 en ella. El análisis metabólico de una muestra como son las heces se complica
mucho ya que no solo contiene los productos metabólicos de los microorganismos y
de las células epiteliales, sino que también recibe un flujo constante de sustancias
con la ingesta de alimentos. Desde el punto de vista de la química analítica, para el
análisis de metabolomas se requieren 2 tipos de herramientas: la resonancia
magnética nuclear y la espectrometría de masas. Además, independientemente de
las técnicas, hay 2 tipos de enfoque en metabolómica: dirigido y no dirigido, según
se conozca o no la naturaleza del metabolito que se quiere identificar y/o
cuantificar.

Los metabolitos bacterianos más estudiados en las heces son los ácidos grasos de cadena
corta (AGCC), originados en la fermentación bacteriana de los hidratos de carbono
complejos de la dieta (fibra y almidón). Los principales AGCC que se detectan en las heces
son el acético, el propiónico y el butírico (>90% de todos los AGCC), pero también hay
otros ramificados, el ácido isobutírico y el ácido isovalérico, que son minoritarios
(representan en torno al 5% del total) y derivan principalmente del metabolismo de
proteínas y aminoácidos, habiendo sido menos estudiados en general que los mayoritarios.

La mayor parte de los AGCC producidos en el colon se absorben en la mucosa colónica

mediante difusión y transportadores específicos. Mientras que el epitelio del colon consume
casi por completo el butírico, el cual constituye la principal fuente de energía para los
colonocitos, el acético y el propiónico pasan a la circulación portal y se utilizan como
precursores en el hígado o en los tejidos periféricos para la gluconeogénesis hepática y la
lipogénesis. Los AGCC tienen una gran importancia en la fisiología y nutrición del tracto
gastrointestinal, presentando propiedades antiinflamatorias y anticancerígenas. Así, el
butírico se ha relacionado con la reversión de células neoplásicas, pudiendo participar en la
prevención de procesos cancerígenos.

Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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