Tema: identificación de genes de resistencia antimicrobianos a partir de bacteriófagos
aislados de puntos de descargar residual al Río Machángara.
Metodología
Área de estudio y zonas de muestreo.
(Reinoso, 2015)
La zona de estudio comprende desde ¨tres cascadas¨ al Sur de Quito en la zona del
Atacazo con coordenadas UTM (X:774939, Y:9970201) hasta 3km aguas abajo de la
confluencia con el Río San Pedro, Nor-Oriente de Quito con coordenadas UTM (X: 792
555, Y:999864). El muestreo se realizará a lo largo de los ¿?km (área de estudio).
3
Se han seleccionado 3 puntos críticos de descarga de aguas residuales en el río
Machángara ([Link] Recreo; [Link] French; [Link]án) (GESAMBCONSULT – EVREN, 2011).
2 puntos extremos ([Link] Sur: Sector ¨tres cascadas¨; E2 Zona Este: confluencia Río
Machángara y Río San Pedro). También, 2 puntos aleatorios (1 y 5). De esta manera,
serán 7 los puntos de muestreo, con los datos obtenidos se determinará la presencia o
ausencia de bacteriófagos que concentren genes de resistencia antimicrobianos en su
fagoma.
Temporalidad y periodicidad del muestreo de efluentes residuales.
(Reinoso, 2015)
La recolección de muestras de agua estará sujeta a muestreos puntuales (por
duplicado), en un período de 3 meses. Tomando en cuenta el nivel de precipitación
anual de Quito (1200 mm). En primer lugar, se ha seleccionado el mes de Abril, que
corresponden al período donde se registra la mayor precipitación mensual; Y, los
meses de Mayo y Junio puesto que según el registro de precipitación mensual decrece
considerablemente, siendo estos últimos relevantes debido a que el proceso de
autodepuración en el Río Machángara disminuye en época de estiaje, gran parte del
caudal estará formado únicamente por aguas residuales (Reinoso, 2015).
Se realizarán un total de 9 campañas de muestreo como lo describe la tabla No. 1.
Durante los meses de Abril, Mayo y Junio. Las muestras serán recolectadas cercanas el
medio día (12:00-15:00) hora a la que se presenta la mayor carga orgánica en las
descargas.
Tabla No. 1 Cronograma de muestreo.
MES
Abril Mayo Junio
Campaña C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3
Fecha 5 12 25 10 20 21 1 15 2
Sur
Zona Centro
Este
C1 C2 C3
5 15 30
Recolección de la muestra en Campo
En el punto de muestreo, el operador recolectará 750 ml de agua residual, en
recipientes de vidrio (1000 ml), previamente esterilizados autoclavándolos a 121 ° C
durante 15 minutos. Las muestras se mantendrán a 4º C en un una caja térmica de
tecnopor, hasta la llegada al Instituto de Microbiología de la Universidad San Francisco
de Quito (IM-USFQ) (Borja et al., 2020)
Adicionalmente, para el análisis de parámetros in situ (pH, T ° C, conductividad, OD),
se tomarán 750 ml de muestra de agua en una botella de Teflón de 1 litro limpia con
ácido, previamente lavada con HCl al 10% y luego enjuagada con agua destilada.
M017 MÉLANY RUIZ O CLAUDIA SERRANO DEL INSTITUTO BIOSFEFERA
Preparación de la muestra.
Ya en el laboratorios, las fases de la muestra de agua residual se separaron
inmediatamente mediante un filtro de jeringa Millex®-HVDF de baja unión a proteínas
Millex®-HV de 0,45 μm (EMD Millipore) que se lavó con 500 μl de tampón SM-plus, 40
ml del filtrado será colocado en tubos Falcon (50ml) en condiciones asépticas.
Purificación parcial de Bacteriófagos.
El siguiente procedimiento fue adaptado del estudio realizado por (Muniesa et al.,
2004); (Brown-Jaque et al., 2018);(Kleiner et al., 2015), con modificaciones. A partir de
los filtrados se obtendrá 10 ml y nuevamente se filtrará a través de filtros de jeringa,
membranas de baja unión a proteínas de poliéster sulfona (0,22 µm) (Millex-GP
Millipore, Bedford, MA) para excluir bacterias y otras partículas presentes en las aguas
residuales y recuperar virus, incluidos bacteriófagos. El líquido filtrado se tratará con
DNAsa (100 U/ml; Sigma-Aldrich, Madrid, España) durante 1 h a 37 °C. La DNAse se
inactivará térmicamente a 75 °C durante 5 minutos.
Almacenamiento de suspensión de fagos (Runa et al., 2021).
Las muestras de agarre o las suspensiones de fagos recuperadas deben procesarse lo
antes posible o almacenarse a 4 °C para minimizar el deterioro de la viabilidad del fago
(Clokie y Kropinski, 2009). Los fagos se pueden suspender en el tampón de trabajo o en
cloroformo al 1% (v/v) para mejorar la estabilidad de la muestra (Mohiuddin y
Schellhorn, 2015; Fan et al., 2019). Sin embargo, el cloroformo puede dañar los lípidos
dentro de la cápside y causar la inactivación de algunos fagos y debe evitarse cuando
se desconoce el tipo de fagos o se deben estudiar comunidades virales enteras (Clokie
y Kropinski, 2009). Las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante períodos cortos
de tiempo sin pérdida significativa del número de fagos y la actividad, a -20 °C para el
almacenamiento a corto/medio plazo, con posible adición de agentes conservantes, y
criopreservarse a -80 °C para almacenamiento a largo plazo con 50% (p/v) de glicerol o
5% (v/v) DMSO. Sin embargo, los ciclos de congelación y congelación-descongelación
pueden disminuir tanto la concentración de fagos como la actividad e introducir sesgos
en análisis o experimentos posteriores (Suttle et al., 1991; Thurber et al., 2009).
Análisis de contaminación de ácidos nucleicos.
Para descartar la presencia de ADN no empaquetado, se tomará una alícuota de la
muestra después del tratamiento con DNasa y antes de su desencapsidación,
utilizando esta muestra como control de contaminación, se estableció la ausencia de
ADNr 16S libre, así como la ausencia de los ARG estudiados por PCR cuantitativa
(qPCR), lo que confirma la eliminación total del ADN no encapsidado (Brown-Jaque et
al., 2018).
Proceso tomado de (Galazzo et al., 2020).
El recuento de la carga bacteriana total por qPCR se logró mediante la amplificación de
los genes de ARNr 16S (par de imprimación 16S-341_F y 16S-805_R;
CCTACGGGNGGCWGCAG y GACTACHVGGGTATCTAATCC, respectivamente) utilizando
un Sistema de detección de PCR El programa de amplificación de PCR consistió en una
desnaturalización inicial establecida a 95 °C durante 3 minutos. seguida de 35 ciclos de
tres pasos a 95 °C durante 15 s y a 55 °C durante 20 s y 72 °C durante 30 s. En cada
carrera, se incluyeron controles de plantilla negativos (ADN reemplazado por agua
libre de nucleasas en qPCR), controles de aislamiento negativos (heces reemplazados
por agua libre de nucleasa durante la extracción de ADN) y controles positivos
(construcción de plásmido recombinante cuantificado que contiene la secuencia
objetivo). Se verificaron las curvas de fusión de cada muestra para confirmar la
amplificación del producto correcto.
Extracción de Ácido nucleico del bacteriófago.
Para todas las muestras, se extraerán ácidos nucleicos totales utilizando el siguiente
protocolo (Kleiner et al., 2015). Se agregará 50 μg/ml de proteinasa-K y 0.5% de sulfato
de dodecil de sodio (SDS) a cada muestra e incubados a 56 °C durante 1 hora. Las
muestras se mezclarán con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamyl y se
extraerán vigorosamente agitando durante 10 segundos. Las muestras se centrifugarán
a 16.000 × g durante 2 minutos. La fase acuosa se transfiráa un tubo de microfugio
limpio y se extraerá con un volumen igual de cloroformo. Las muestras se
centrifugararán a 16.000 × g durante 2 minutos y se repetirá la extracción de
cloroformo. La fase acuosa se transferirá a un tubo de microfugio limpio y los ácidos
nucleicos se precipitarán mediante la adición de acetato de sodio de 0,3 M (pH, 7,0) y
2,5 volúmenes de isopropanol. Las muestras se incubarán a -20 °C durante 2 horas y
luego se centrifugarán a 16.000 × g durante 30 minutos. El ácido nucleico precipitado
se lavará una vez con 700 μl de etanol al 70% y se centrifugará a 16.000 × g durante 10
minutos. El sobrenadante será decantado y se permitirá que los gránulos se secaran a
temperatura ambiente durante 10 minutos. El ácido nucleico se resuspenderá en el
tampón EB (10 mM Tris · HCl, pH 8.5) y se purificará aún más utilizando el Kit de
Limpieza de Reacción MinElute® (Qiagen, Valencia, CA). La concentración de ácido
nucleico se cuantificará por Nanodrop (Thermofisher).
Amplificación por qPCR de ARG´s (Brown-Jaque et al., 2018).
Los ensayos de qPCR en tiempo real para blaTEM, grupo blaCTX-M-1, grupo blaCTX-M-
9, mecA, armA, qnrA, qnrS y sul1 se realizarán como se describe anteriormente [9],
[12], [14], [18], [19],[22], [23]. El ensayo qPCR del gen blaOXA-48 (Tabla 2) fue
diseñado utilizando Primer Express® Software v.3.0 (Applied Biosystems). El gen se
amplificará utilizando cebadores específicos (Tabla 2) de la secuencia de blaOXA-48
albergada en el aislado clínico de K. pneumoniae HSP172. El blaOXA-48 amplificado fue
secuenciado y clonado en un pGEM®-T Easy Vector. La construcción se confirmó por
secuenciación y se utilizó para generar las curvas estándar [9]. El ensayo qPCR para
blaOXA-48 mostró una eficiencia del 99,8% y un límite de cuantificación de 18,2 copias
de genes/μL (ciclo umbral de 32,4), similar a los otros genes.
Las imprimaciones y las sondas de hidrólisis TaqManTM (Tabla 2) se utilizaron en
condiciones estándar en un sistema de PCR en tiempo real StepOneTM (Applied
Biosystems) [9]. Para detectar más a fondo la inhibición de la PCR, se dispararon
diluciones de las concentraciones conocidas de copia génica del estándar mecA con
ADN aislado de las muestras y los resultados se compararon con la concentración
esperada. No se detectó ninguna inhibición de la PCR por las muestras. Todas las
muestras se ejecutaron por duplicado.
Bibliografía
Borja, P. et al. (2020). Determination of the Microbial and Chemical Loads in Rivers
from the Quito Capital Province of Ecuador (Pichincha)—A Preliminary Analysis of
Microbial and Chemical Quality of the Main Rivers. Int. J. Environ. Res. Public
Health, 17, 5048; doi:10.3390/ijerph17145048.
Brown-Jaque, M., Calero-Cáceres, W., Espinal, P., Rodríguez-Navarro, J., Miró, E.,
González-López, J. J., Cornejo, T., Hurtado, J. C., Navarro, F., & Muniesa, M.
(2018). Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human faeces
and induced from clinical bacterial isolates. International Journal of Antimicrobial
Agents, 51(3), 434–442. [Link]
Galazzo, G., van Best, N., Benedikter, B. J., Janssen, K., Bervoets, L., Driessen, C.,
Oomen, M., Lucchesi, M., van Eijck, P. H., Becker, H. E. F., Hornef, M. W.,
Savelkoul, P. H., Stassen, F. R. M., Wolffs, P. F., & Penders, J. (2020). How to Count
Our Microbes? The Effect of Different Quantitative Microbiome Profiling
Approaches. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 10.
[Link]
GESAMBCONSULT – EVREN. (2011). Estudio de impacto ambiental de la primera línea
del Metro de Quito. Quito, Ecuador. Versión disponible en línea en:
[Link]
56262_75.pdf (Fecha de consulta: 4 de nov.-21)
Kleiner, M., Hooper, L. V, & Duerkop, B. A. (2015). Evaluation of methods to purify
virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC
Genomics, 16(1), 7. [Link]
Muniesa, M., García, A., Miró, E., Mirelis, B., Prats, G., Jofre, J., & Navarro, F. (2004).
Bacteriophages and Diffusion of β-lactamase Genes. Emerging Infectious Diseases,
10(6), 1134–1137. [Link]
Reinoso, I. (2015). Evaluación ambiental del Río Machángara. Tesis de grado: Escuela
Politécnica Nacional. Quito, Ecuador. Versión disponible en línea en:
[Link] (Fecha de consulta: 4 de nov.-
21)
Runa, V., Wenk, J., Bengtsson, S., Jones, B. V., & Lanham, A. B. (2021). Bacteriophages
in Biological Wastewater Treatment Systems: Occurrence, Characterization, and
Function. Frontiers in Microbiology, 12.
[Link]
