UNIVERSIDAD NACIONAL

JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO:
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRACTICA N°04:
“RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA”

PRESENTADO POR: GRUPO N°1

Apeña Domínguez, Jhojan

Asencios Alanya, Edith

Barrera venturo, Lilia

Estrada Suarez, Neylin

Gerónimo Cárdenas, Milca

López Acosta, Aleja

López Guevara Sayuri😊

DOCENTE:
Ing. Edson Max Caro Degollar

HUACHO – 2023
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 04

1. TÍTULO: RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA

2. INTRODUCCIÓN:

El recuento de microorganismos en placa es un método microbiológico que se utiliza para

determinar el número de microorganismos presentes en una muestra. Este método se basa en
la siembra de la muestra en un medio de cultivo sólido, donde los microorganismos crecen y
forman colonias. El número de colonias se cuenta y se utiliza para calcular el número total de
microorganismos en la muestra. Este método es uno de los más utilizados en microbiología,
ya que es sencillo, preciso y reproducible.

3. COMPETENCIAS:
 Aplica técnicas de homogenización y dilución de muestras para ser analizadas
microbiológicamente.
 Emplea técnicas de siembra de microorganismos en diferentes tipos de medios de
cultivo.
 Realiza cuantificación de microorganismos mediante las técnicas de recuento en placa.

4. FUNDAMENTO TEÓRICO.

Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) de células

microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos
se pueden mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células en cámara de
Neubauer.

La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer

diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés.
Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o
en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en consecuencia, el
número de colonias que se observarán a simple vista será igual al número de bacterias
viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por
la dilución. Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproximada
del número total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que
no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los
microorganismos. También pueden presentarse problemas relacionados con falta de
homogeneidad de las diluciones y en la inoculación de las muestras, por lo que se pueden
obtener bajos valores si es que las células no se separan bien y valores elevados si las
tomas de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado por gravedad
los microorganismos.

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

En microbiología las diluciones seriadas corresponden a un método empleado de manera

rutinaria con el fin de aislar células microbianas viables desde muestras sólidas o líquidas y
cuantificar su cantidad. Las células viables son aquellas con la capacidad de dividirse y
formar descendencia y, en la mayoría de los casos es el tipo de células que interesa. A
través del método de diluciones seriales una célula viable se puede aislar e identificar como
una colonia o Unidad Formadora de Colonia – UFC.

Las diluciones seriales se realizan cuando el tamaño de las poblaciones microbianas en una
muestra es demasiado alto, y sembrarlas en un medio sólido puede conducir a la no
formación de colonias o fusión de estas haciendo difícil el aislamiento y recuento. Para
obtener un número apropiado de células que puedan formar colonias aisladas en placa
(entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias UFC) se requiere de la dilución de la
muestra y, como rara vez se conoce con antelación el número de células viables,
normalmente se hace más de una dilución, siendo usual realizar diluciones decimales. Para
hacer una dilución decimal de 10-1 se mezclan 1mL en 9 mL de diluyente. Si se necesita
una dilución 10-2, se pueden mezclar 0.1mL con 9.9 mL o de modo seriado haciendo dos
diluciones de tipo 10-1 así sucesivamente si se sospecha que la muestra esta densamente
poblada. Si se parte de muestras sólidas o líquidas densas (suelos, alimentos, etc), para
asegurar una muestra representativa, la primera dilución se realiza mezclando 10 g o 10
mL de muestra en 90 mL del diluyente.

Otros factores de relevancia en el método de diluciones seriales están relacionados con la

homogenización de la muestra, el diluyente seleccionado y, la identificación de las
muestras y cultivos. Generalmente, la liberación de las células desde las muestras al fluido
posiblemente requiera de dispositivos de trituración y mezcla para lograr una buena
homogenización. Como diluyente de uso general está el agua peptonada al 0.1%, aunque se
puede trabajar con solución salina fisiológica con 0.1% de peptona. La identificación de la
muestra se refiere a la forma como se debe rotular para no confundirla o perderla, el rotulo
debe incluir: nombre y tipo de producto, fecha de recolección, cantidad, empaque, fecha de
producción y de vencimiento, así como fecha de análisis y características organolépticas
(color, olor, sabor, aspecto); los cultivos por su parte deben indicar el número de dilución,
tipo de medio, nombre del analista y fecha.

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Figura 1. Método de las diluciones seriadas.

Métodos de siembra
Para la siembra de las diluciones seriales existen diferentes métodos, no obstante, los
extendidos y usados son: el método de extensión en placa y el método de vertido en placa.

a) Método de extensión o siembra en superficie:

Un volumen que no suele ser superior a 0.1 mL, se extiende en la superficie de una
placa con medio sólido, utilizando un asa estéril de extensión (asa digralsky). Es
importante que la superficie del medio esté seca de modo que el líquido de la muestra se
absorba y las células queden fijas. La placa se incuba a una temperatura adecuada hasta
que aparecen las colonias.

b) Método de vertido en placa o profundidad:

Se pipetea un volumen conocido (normalmente 1mL) de muestra en una caja Petri
estéril sobre la que se añade el medio con agar fundido. Se realiza una mezcla con
movimientos suaves de la placa sobre la superficie de la mesa antes de dejar solidificar.
En este método se debe tener precaución con la temperatura del agar fundido, la cual
debe mantenerse entre 45°C - 50°C, temperaturas superiores podrían matar las células.
En la placa las colonias se forman por toda la caja y no solamente en la superficie.

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Figura 2. Métodos de siembra.

El número de colonias que se obtiene en la determinación de células microbianas

viables no solo depende del tamaño del inoculo, también de lo adecuado que sea el
medio de cultivo, de las condiciones y duración de la incubación. Si se usa un cultivo
mixto, por ejemplo, no todas las células depositadas en la placa desarrollarán colonias a
la misma velocidad, y si se emplea un corto tiempo de incubación se obtendrán menos
colonias de las posibles.

Medios de cultivo

Existen diversos grupos de microorganismos cuyo aislamiento resulta relevante para el

análisis de determinadas muestras. Así, por ejemplo, cuando se desea analizar un alimento,
los microorganismos mesófilos (microorganismos que crecen entre 15 – 45°C), mohos y
levaduras (hongos), y coliformes se convierten en los grupos más importantes a evaluar ya
que su presencia y cantidad determina la inocuidad de dicho alimento. Para la estimación
de estos microorganismos se eligen medios de cultivo específicos que favorecen su
crecimiento:
 Agar nutritivo o plate count: son medios generales usados para el cultivo de
microorganismos mesófilos.
 Agar PDA o Sabouraud: favorecen el aislamiento de mohos y levaduras.
 Agar VRB: estos medios son usados para determinar la presencia de coliformes. El
medio chromocult es además un medio diferencial en el cual se podrán identificar
diferentes tipos de coliformes.

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5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparar los medios de cultivos y todo el material, de modo que al momento de comenzar
con las diluciones todo este estéril y listo para ser usado.

5.1. SELECCIÓN DE LA MUESTRA

Esta práctica se desarrollará en grupo. Cada grupo deberá seleccionar una muestra
solida o líquida desde la cual desee evaluar la presencia, aislar y cuantificar
microorganismos; se puede seleccionar un alimento (líquido o sólido, preferiblemente
alimentos que se comercialicen en la calle), una muestra de suelo, muestras de agua,
etc. Si la muestra es sólida como mínimo deberá llevar 15 g o 15 mL si es líquida.

5.2. PREPARACIÓN DE HOMOGENIZADOS Y DILUCIONES

 Medir 10 mL de la muestra líquida (con ayuda de una pipeta graduada o

macropipeta).
 Diluir la muestra en 90 mL de solución salina peptonada, dejar en agitación por 5
minutos.
 Dejar reposar 10, 15 o 30 minutos para permitir la liberación de los
microorganismos a la solución diluyente. (Dilución 1:10 (10-1)).
 De la dilución 1:10 (10-1) tomar 1 ml (usar micropipeta y punta estéril) y
depositarlo en tubo que contenga 9 ml de diluyente para obtener la dilución 1:100
(10-2).
 De la dilución 1:100 (10-2) tomar 1 ml y depositarlo en tubo que contiene 9 ml de
diluyente para obtener la dilución 1:1000 (10-3).
 De la dilución 1:1000 (10-3) tomar 1 ml y depositarlo en tubo que contiene 9 ml de
diluyente para obtener la dilución 1:10000 (10-4).
 De la dilución 1:10000 (10-4) tomar 1 ml y depositarlo en tubo que contiene 9 ml de
diluyente para obtener la dilución 1:100000 (10-5).
 Para el análisis microbiológico de alimentos se deben utilizar 3 diluciones como
mínimo.
 Luego de preparar las diluciones no deben pasar más de 20 min antes de estar
sembradas.

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5.3. SIEMBRA EN PROFUNDIDAD (MESÓFILOS)

 Rotular las cajas con el nombre del equipo de trabajo, medio de cultivo fecha y
dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la base de una
de las cajas de Petri estéril previamente marcadas.
 Inmediatamente verter en cada caja de 12 a 15 ml de agar nutritivo o plate count
fundido a 45ºC y mezclar el inóculo con el agar imprimiendo movimientos de
vaivén a la placa sobre el mesón: 5 veces en sentido horizontal, 5 veces en sentido
vertical, 5 veces en el sentido de las manecillas del reloj, 5 veces en el sentido
contrario a las manecillas del reloj y 5 veces haciendo un ángulo recto. NOTA: El
medio de cultivo debe ser translúcido debido a que las unidades formadoras de
colonias quedarán en la superficie, en el medio y en el fondo de la caja.
 Lo ideal es que por cada dilución se siembren al menos dos cajas Petri, para este
ejercicio solo se inoculará una.
 Incubar a 30°C por 72 horas.
 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones donde
hayan crecido entre 30 UFC y 300 UFC. NOTA: Cuando el número de bacterias
viables es inferior a 1 el número promedio se toma como 1.
 Obtener la concentración de bacterias en la solución de acuerdo con la siguiente
formula:

𝐶𝐵 = 𝑍 ∗ 𝑅

Donde:
- CB = Concentración de bacterias (UFC/mL o g)
- Z = valor promedio de UFC en dos cajas de Petri (solo en caso de haber
sembrado dos cajas Petri por dilución)
- R = Factor de dilución o inverso de la dilución donde se pudo realizar el
conteo (101, 102, 103, etc)

5.4. SIEMBRA EN SUPERFICIE (MOHOS Y LEVADURAS)

 Rotular las cajas con el nombre del grupo de trabajo, medio de cultivo fecha y
dilución.
 Tomar con pipeta estéril alícuotas de 0.1 ml de cada una de las diluciones
(empezando de la más diluida a la más concentrada) y depositarlo en la superficie
de una de las cajas de petri con el medio de cultivo y previamente marcadas.
 Inmediatamente extender el inóculo con asa de Dryglaski sobre toda la superficie.
 Incubar a temperatura ambiente por 3, 4 y 5 días (cada día se debe evaluar
crecimiento).

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

 Después de la incubación contar el número de colonias en las diluciones donde

hayan crecido entre 15 UFC y 150 UFC. NOTA: Cuando el número de hongos
viables es inferior a 1 el número promedio se toma como 1.
 Obtener la concentración de bacterias en la solución de acuerdo con la siguiente
formula:

1
C𝐵 = 𝑍 ∗ 𝑅 ∗
0 ,1

Donde:
- CB = Concentración de bacterias (UFC/mL o g)
- Z = valor promedio de UFC en dos cajas de Petri (solo en caso de haber
sembrado dos cajas Petri por dilución)
- R = Factor de dilución o inverso de la dilución donde se pudo realizar el
conteo (101, 102, 103, etc)

5.5. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

Después de los diferentes periodos de incubación, realice un conteo en cada una de las
cajas con ayuda de un contador de colonias (ver en procedimiento indicaciones sobre
número de colonias posible de ser contadas y cálculos). Observar y consignar en una
tabla los resultados encontrados en el crecimiento microbiano.

6. MATERIALES Y EQUIPOS:

a) Equipos

- 1 Autoclave de 50 L.
- 1 Horno de 25 L
- 1 Incubadora

b) Materiales
- 7 tubos de ensayo 13x100 con torunda
- 7 tubos de ensayo 18x150 con torunda
- 7 placas Petri (estéril)
- 7 pipetas de 10 mL (estéril)
- 1 Mechero
- 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con torunda.
- 1 Aplicadores de madera.
- 1 Pinzas de disección punta roma.
- 1 asa de Dryglaski
- 1 paquete de 25 bolsas reclosables transparentes (medidas 20 x 17 cm a más)

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c) Sustancias y reactivos
- Agar Plate Count (PCA)

- Agar VRB
- Agar Dextrosa Sabouraud
- Algodón
- 1 L Alcohol 96°
- 1 L agua estéril para inyección

d) Materiales de protección e higiene personal

- 1 Jabón liquido
- Guantes descartables.
- Guardapolvo
- Cofia

7. RESULTADOS

PLACAS PETRI -1

−1
10

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PLACAS PETRI -2

−2
10

PLACAS PETRI -3

−3
10
PLACAS PETRI -4

−4
10

PLACAS PETRI -5

−5
10

PLACAS PETRI TIEMPO de Placas con medio conteo de colonias

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realización del de cultivo en las diluciones

método utilizados
PLACAS PETRI -1 Incontables UFC
−1
72hr 10 (Unidades
Formadoras de
Colonias)
PLACAS PETRI -2 incontables UFC
−2
72hr 10 (Unidades
Formadoras de
Colonias)
−3
PLACAS PETRI -3 72hr 10 270 UFC (Unidades
Formadoras de
Colonias)
PLACAS PETRI -4 72hr 209 UFC (Unidades
−4
10 Formadoras de
Colonias)
PLACAS PETRI -5 72hr 170 UFC (Unidades
−5
10 Formadoras de
Colonias)

Los resultados obtenidos de las disoluciones sucesivas nos permitieron poder visualizar las
colonias contenidas en la leche cruda de vaca y que cantidad de microorganismos contenía en
las muestras realizadas 10−1 10−2 10−3 10−4 10−5.

Donde tuvimos como resultado que la muestra 10−1 ; 10−2 son incontables ya que la presencia
que poseen llegan a ser de gran variedad donde no se puede determinar la cantidad exacta y
aproximada que podrían tener en sus placas.

La muestra 10−3 ; 10−4 y 10−5 si llegan a tener una cantidad notable y se puede hacer el conteo
de la muestra, por otro lado, la muestra 10−5 tuvo una menor carga microbiana por motivos
que cada disolución hubo una menor concentración de la muestra liquida (leche entera).

8. CONCLUSIONES:

Con base en los resultados de la determinación microbiana en la leche entera, se encontró una
población microbiana esto demuestra que la leche es un entorno rico en nutrientes para el
crecimiento de bacterias, pero también esto puede afectar la calidad y seguridad del producto
en este caso la leche.
Observamos que se mostro un número significativo de colonias microbianas en las muestras
de la leche entera.
Por la diversidad de colonias bacterianas observadas en las placas puede indicar la presencia
de diferentes tipos de microorganismos en la leche entera. Estos pueden incluir
bacterias beneficiosas, como las bacterias del ácido láctico utilizadas en la fermentación de
productos lácteos, así como también patógenos potenciales o bacterias perjudiciales.

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

Si se observa una gran cantidad de microorganismos, esto puede indicar la necesidad de

mejorar los métodos de limpieza, enfriamiento y pasteurización en la producción de leche y
productos lácteos.

9. DISCUSIONES:

En un estudio realizado en Colombia, los autores exponen que existen diferencias en los
recuentos de bacterias aerobios obtenidos en diferentes estaciones climáticas. En época de
lluvia, de acuerdo con los autores, hay mayor exposición del ganado al estiércol y la tierra,
por lo que los recuentos de aerobios mesófilos aumentan (Moreno Vásquez et al., 2007).

Por otra parte, con la investigación realizada por Godic-Torkar y Golc-Tejer (2008), durante
la época de lluvia las condiciones de temperatura y concentración de oxígeno disuelto
cambian en la leche, favoreciendo el crecimiento de la microbiota psicotrofa y psicrófila
aerobia, que en algunos casos llega a representar entre el 10 al 50 % de la microbiota total de
los recuentos de aerobios mesófilos

Las bacterias mesófilas son consideradas como indicadores de higiene, sin embargo, su
presencia en la leche es inevitable ya que la mayoría de estos géneros están presentes en la
ubre del animal, las manos de los ordeñadores, las superficies del equipo, en el agua y en el
aire. Por lo tanto, los altos recuentos de mesófilos están directamente influenciados por las
condiciones en las que la leche se somete después del ordeño, sobre todo la temperatura de
almacenamiento (Giacometti et al., 2012)

10. INTERROGANTES ADICIONALES

a. Mediante un esquema indique como obtener una placa o caja de Petri con una dilución
10-7 mediante:
- Siembra en profundidad
- Siembra en superficie

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 ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

11. BIBLIOGRAFÍA.
Moreno Vásquez, F. C., (2007). Análisis microbiológico y su relación con la calidad
higiénica y sanitaria de la leche producida en la región del Alto de Chicamocha
(departamento de Boyacá). Revista de Medicina Veterinaria, 14, 61-83.
https://ciencia.lasalle.edu.co/cgi/viewcontent.cgi?article=1105&context=mv

Giacometti, F., Serraino, A., Finazzi, G., Daminelli, P., Losio, M. N., Bonilauri, P.,
Arrigoni, N., Garigliani, A., Mattioli, R., Alonso, S., Piva, S., Florio, D., Riu, R., &
Zanoni, R. G. (2012). Foodborne pathogens in in-line milk filters and associated on-
farm risk factors in dairy farms authorized to produce and sell raw milk in northern
Italy. Journal of food protection, 75(7), 1263-1269. https://doi.org/10.4315/0362-
028X.JFP-12-028

Godic-Torkar, K., & Golc-Teger, S. (2008). The microbiological quality of raw milk
after introducing the two day´s milk collecting system. Acta Agriculturae
Slovenica,92(1), 61-74. https://www.dlib.si/details/URN:NBN:SI:doc-52RUOPN7

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

12. ANEXOS

13.

Figura 1.2 Figura 1.1

Figura 1.1 Rotulado de las placas

Figura 1.2 Rotulado los tubos

Figura 1.3 Con ayuda del mechero evitamos la cantidad de microorganismo Figura 1.4
Figura 1.3
Figura 1.4 Agitamos la leche

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 ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS UNJFSC

Figura 1.7
Figura 1.5 Figura 1.6

14.
15.
16.
Figura 1.8
17.

18.
19.
20.
21.
22.
23.

Figura 1.9 Figura 1.10

Figura 1.5 Insertamos la micro pipeta al matraz y sacamos la leche

Figura 1.6 Colocado en sus respectivos tubos con su rotulado

Figura 1.7 Placas Petri con la leche

Figura 1.8 Sacamos el agar de la autoclave

Figura 1.9 Enfriamiento del agar de manera manual con un poco de agua

Figura 1.10 vertemos el agar a las placas Petri

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Muestra de la placa 10−1 se observa Muestra de la placa 10−2 se de igual manera

demasiadas colonias que no se pueden se observa gran cantidad de colonias.
contar (incontables).

Muestra de la placa 10−4 observa colonias en Muestra de la placa 10−3 se observa menor
menor cantidad y tamaños variados cantidad de microorganismo

Muestra de la placa 10−5 se observa una cantidad

mucho menor de microorganismos cultivados de
diferentes tamaños es una característica de vertido
de placas.

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