Universidad Ricardo Palma

Facultad de Ciencias Biológicas

Guía de Práctica de Laboratorio de Microbiología Aplicada

DATOS GENERALES
Asignatura : Microbiología Aplicada
Código : CB0761
Créditos : 5
Naturaleza : Teórico - Práctico
Carácter : Obligatorio
Horas : Teoría 3, Laboratorio 4
Requisito : Microbiología General
Profesores : Dr. Tomás Agurto Sáenz
Mg. Juan Carlos Ramos Gorbeña

Nota: Presente Manual de Practicas de Laboratorio es la Guía de Practicas de las clases del curso.

Elaboracion, Diseño y Diagramación: Dr. Tomás Agurto Sáenz y Mg. Juan Carlos Ramos Gorbeña

Fotos de cultivo en agar de la caratula tomadas por Mg. Juan Carlos Ramos Gorbeña:
• Hongos ambientales
• Bacillus sp.
• Micrococcus sp.

T. Agurto – J.C. Ramos

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Guía de Práctica de Laboratorio de Microbiología Aplicada

Presentación

En la siguiente Guía de Practicas de Microbiología Aplicada, Ud. encontrara las técnicas que se deben
seguir para el reconocimiento de la muestra donde se halla el microorganismo, motivo del estudio,
la cual llevada al laboratorio es sometida a un procedimiento de aislamiento y cultivo hasta su
identificación.

Se eligen dos o cuatro especies tipo que representan a una Familia y Orden dentro de los
microorganismos motivos del curso, entre ellos se destacan a cuatro tipos de especies: patógenos
para el hombre, animales y vegetales, los útiles no patógenos que son utilizados en biotecnología y
los que reciclan materia orgánica para convertirlos en elementos útiles y favorables para los demás
seres vivos.

De acuerdo al programa teórico las prácticas abarcan el estudio de especies que pertenecen a
categorías diferentes, Clases u Ordenes, así tenemos:
Bacterias
Espiroquetas
Actinomicetos
Hongos

En un solo ensayo no es posible aprender las técnicas de estudio, esta debe ser constante y una
práctica se correlaciona con los demás.
Los conocimientos y las técnicas de estudio de la morfología, cultivos y bioquímica del curso de
Microbiología General son utilizados para la ubicación, aislamiento e identificación de todos los
microorganismos.

Los Autores

T. Agurto – J.C. Ramos

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Reglamento de Prácticas Laboratorio

1. Las Prácticas de Laboratorio son obligatorias e irrecuperables.

2. Cada alumno asistirá dentro del grupo en el cual se ha matriculado, sin posibilidad de cambio
a otro grupo, puesto que cada grupo dispone de material en relación con el número de
alumnos en él comprendidos.

3. Las Prácticas de Laboratorio iniciarán a la hora indicada segun lo establecido en la Guía de

Matricula entregada por la Oficina de Registros y Matricula de la Facultad.

4. Es obligatorio el uso de mandil blanco de laboratorio y ésta debe estar debidamente

abotonada.

5. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.

6. La mesa de trabajo debe estar siempre limpia y ordenada. Antes de comenzar cada Práctica
de Laboratorio es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más
habituales para esto son la lejía 0,5% y el alcohol (etanol 70°).

7. El material del cual dispone en el laboratorio debe ser tratado con máximo cuidado y
responsabilidad. Es costoso y va ser usado también por sus compañeros.

8. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama del mechero. Se

deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear
corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.

9. Durante la Práctica de Laboratorio está prohibido comer, beber, fumar, almacenar

alimentos, maquillarse y cambiarse lentes de contacto. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.

10. Libros, folders, chompas y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la
Práctica de Laboratorio deben estar apartados del lugar de la mesa de trabajo.

11. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán
descontaminados en la autoclave posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado
por el lavadero o a la basura común.

12. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.

13. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.

14. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se

comunicará inmediatamente al profesor responsable de la Práctica de Laboratorio.

15. Dejar todo en orden, del mismo modo en que Ud. lo encontró.

T. Agurto – J.C. Ramos

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La Bioseguridad Aplicada en el Laboratorio de Prácticas de Microbiologia

Los laboratorios microbiológicos constituyen medio ambientes de trabajo especiales, generalmente

únicos, que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas identificables para las personas
que se encuentren en o cerca de ellos.

Durante todo el transcurso de la historia de la microbiología, las infecciones se han contraído en el

laboratorio. Los informes publicados hacia fines del siglo pasado describieron casos de tifoidea,
cólera, muermo, brucelosis y tétano adquiridos en el laboratorio.

La bioseguridad es un conjunto de medidas probadamente eficaces para evitar la adquisición

accidental de infecciones con patógenos contenidos en las muestras, así como los riesgos
relacionados con la exposición a agentes químicos, físicos o mecánicos a los que está expuesto el
personal en los laboratorios.

Presentamos definiciones, requisitos generales y requisitos específicos que deben ser considerados
al momento de implementar y mantener la bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología, entre
los cuales se incluyen los tipos de microorganismos para el nivel de bioseguridad 1 para su
manipulación, normas para la protección del personal, condiciones para el manejo, transporte,
conservación y desecho de sustancias potencialmente dañinas al personal y a la comunidad.

Sólo si las personas que trabajan en los laboratorios conocen las normas de bioseguridad y las
aplican, pueden determinar su propia seguridad, la de sus compañeros y la de la colectividad. El
personal de laboratorio debe cumplir con las normas de bioseguridad y los directivos de la
institución deben cumplir con brindar las facilidades para que estas normas sean aplicadas. La
creación de un Comité de Bioseguridad es imprescindible.

Niveles de Bioseguridad

Se describen cuatro niveles de bioseguridad, que constan de combinaciones de prácticas y técnicas

de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones de laboratorio. Cada combinación es
específicamente apropiada para las operaciones llevadas a cabo, las vías de transmisión
documentadas o sospechadas de los agentes infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio.

Nivel de Bioseguridad 1

Las prácticas, los equipos de seguridad, el diseño y la construcción de la instalación del Nivel de
Bioseguridad 1 son adecuados para laboratorios destinados a la educación o capacitación secundaria
o universitaria, y para otros laboratorios en los cuales se trabaja con cepas definidas y caracterizadas
de microorganismos viables que no se conocen como generadores sistemáticos de enfermedades en
humanos adultos sanos. El Bacillus subtilis, Naegleria gruberi, el virus de la hepatitis canina
infecciosa. Muchos agentes no comúnmente asociados con procesos de enfermedades en humanos
son, no obstante, patógenos oportunistas y pueden causar infección en individuos jóvenes, ancianos,
inmunodeficientes o inmunodeprimidos. Las cepas de vacunas que han sido sometidas a múltiples
pasajes in vivo no deben ser consideradas avirulentas por el simple de hecho de ser cepas de
vacunas.
El Nivel de Bioseguridad 1 representa un nivel básico de contención que se basa en prácticas
microbiológicas estándar sin ninguna barrera primaria o secundaria especialmente recomendada,
salvo una pileta para lavado de manos.

T. Agurto – J.C. Ramos

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Nivel de Bioseguridad 2

Las prácticas, los equipos, el diseño y la construcción de instalaciones del Nivel de Bioseguridad 2
son aplicables a laboratorios educativos, de diagnóstico, clínicos u otros laboratorios donde se
trabaja con un amplio espectro de agentes de riesgo moderado que se encuentran presentes en la
comunidad y que están asociados con enfermedad humana de variada gravedad. Con buenas
técnicas microbiológicas, estos agentes se pueden utilizar en forma segura en actividades realizadas
en una mesa de trabajo, siempre que el potencial de que se produzcan salpicaduras o aerosoles sea
bajo. El virus de la Hepatitis B, el HIV, Salmonella, y el Toxoplasma spp. son representativos de los
microorganismos asignados a este nivel de contención. El Nivel de Bioseguridad 2 es adecuado
cuando se trabaja con sangre derivada de humanos, fluidos corporales, tejidos o líneas de células
primarias humanas donde puede desconocerse la presencia de un agente infeccioso.

Se debe contar con barreras secundarias, tales como piletas para lavado de manos e instalaciones de
descontaminación de desechos a fin de reducir la contaminación potencial del medio ambiente.

Nivel de Bioseguridad 3
Las prácticas, equipos de seguridad y el diseño y la construcción de las instalaciones del Nivel de
Bioseguridad 3 pueden aplicarse a instalaciones clínicas, de producción, investigación, educación o
diagnóstico, donde se trabaja con agentes exóticos o indígenas con potencial de transmisión
respiratoria, y que pueden provocar una infección grave y potencialmente letal. La tuberculosis
Mycobacterium, el virus de la encefalitis de St. Louis, y el Coxiella burnetii son representativos de los
microorganismos asignados a este nivel. Los riesgos primarios del personal que trabaja con estos
agentes están asociados a la auto inoculación, ingestión y exposición a aerosoles infecciosos.

Nivel de Bioseguridad 4
Las prácticas, equipos de seguridad, y el diseño y la construcción de instalaciones del Nivel de
Bioseguridad 4 son aplicables al trabajo con agentes peligrosos o tóxicos que representan un alto
riesgo individual de enfermedades que ponen en peligro la vida, que pueden transmitirse a través de
aerosoles y para las cuales no existen vacunas o terapias disponibles. Los agentes con una relación
antigénica cercana o idéntica a los agentes de los Niveles de Bioseguridad 4 deben manejarse
conforme a las recomendaciones de este nivel. Cuando se han obtenido datos suficientes, el trabajo
con estos agentes puede continuarse a este nivel o a un nivel inferior. Los virus como Marburg o la
fiebre hemorrágica Congo-Crimeana se manipulan al Nivel de Bioseguridad 4.

El Nivel de Bioseguridad 1

Prácticas Microbiologicas Estandar para un Nivel de Bioseguridad 1

1. El acceso al laboratorio es limitado o restringido a criterio del director cuando se están

llevando a cabo experimentos o trabajos con cultivos y especimenes.
2. Las personas se lavan las manos luego de manipular materiales viables, luego de
quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio.
3. No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o
almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo. Las personas que usan
lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector
facial. Los alimentos se almacenan fuera del área de trabajo en gabinetes o
refrigeradores designados y utilizados con este único fin.

T. Agurto – J.C. Ramos

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4. Está prohibido pipetear con la boca; se utilizan dispositivos pipeteadores mecánicos.

5. Se instituyen políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes.
6. Todos los procedimientos se llevan a cabo con precaución a fin de minimizar la creación
de salpicaduras o aerosoles.
7. Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por día y luego de
todo derrame de material viable.
8. Todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados se descontaminan antes de
ser desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por
ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del
laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para
su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del
laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales y
federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento.
9. Se debe colocar una señal de advertencia de riesgo biológico en la entrada del
laboratorio cuando se encuentren presentes agentes infecciosos. La señal debe incluir el
nombre del agente o agentes en uso y el nombre y número de teléfono del investigador.
10. Se encuentra en vigencia un programa de control de roedores e insectos.

Prácticas Especiales para un Nivel de Bioseguridad 1: Ninguna.

Equipos de Seguridad para un Nivel de Bioseguridad 1 (Barreras Primarias)

1. En general, no se requieren dispositivos o equipos de contención o equipamientos

especiales, como gabinetes de seguridad biológica para las manipulaciones de agentes
asignados al Nivel de Bioseguridad 1.
2. Se recomienda el uso de ambos, delantales o uniformes de laboratorio a fin de evitar
que la ropa de calle se pueda contaminar o ensuciar.
3. Se deben usar guantes si existen lastimaduras en las manos o si la piel presenta alguna
erupción. Deben existir alternativas disponibles al uso de guantes de látex empolvados.
4. Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir
salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos.

Instalaciones del Laboratorio para un Nivel de Bioseguridad 1 (Barreras Secundarias)

1. Los laboratorios deben tener puertas para el control de acceso.

2. Cada laboratorio contiene una pileta para el lavado de manos.
3. El laboratorio ha sido diseñado para que su limpieza sea sencilla. Las alfombras no son
adecuadas para los laboratorios.
4. Las superficies de las mesas de trabajo son impermeables al agua y son resistentes al
calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados
para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos.
5. Los muebles de laboratorio deben tener la capacidad de soportar cargas y usos
previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser
accesibles para su limpieza.
6. Si el laboratorio tiene ventanas que se abren hacia el exterior, están provistas de
mosquiteros.

Fuente: BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS DE MICROBIOLOGÍA Y BIOMEDICINA – CDC/NIH

T. Agurto – J.C. Ramos

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CONTENIDO

Práctica N°01
Cocos Gram positivos (I)
Micrococcaceae: Micrococcus
Staphylococcus

Práctica N°07
Bacilos Gram negativos
Enterobacterias:
Práctica N°02 Escherichia coli – Citrobacter – Enterobacter –
Cocos Gram positivos (II) Klebsiella – Hafnia – Serratia - Edwardsiella
Streptococcaceae: Streptococcus Salmonella – Proteus – Shigella - Yersinia
Pediococcus Erwinia
Leuconostoc

Práctica N°08
Práctica N°03 Otros Gram negativos:
Cocos Gram negativos Vibrio
Neisseriaceae: Neisseria Pseudomonas

Práctica N°04 Práctica N°09

Bacilos Gram positivos aerobios Espiroquetales
Bacillus Treponema
Listeria Leptospira

Práctica N°10
Práctica N°05 Hongos: Levaduras
Bacilos Gram positivos anaeróbicos Mohos
Clostridium

Práctica N°06
Bacterias Acido Lácticas
Lactobacillus

T. Agurto – J.C. Ramos

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Práctica N° 00
Control de las condiciones
ambientales del laboratorio de microbiología y
prevención de la contaminación cruzada

1. OBJETIVO:
Mantener las condiciones ambientales adecuadas durante la ejecución de los ensayos
microbiológicos previniendo así la contaminación cruzada.

2. ALCANCE:
Ambientes y superficies del laboratorio, equipos de microbiología que en forma directa o indirecta
se relacionan con la metodología a ensayar.

3. RESPONSABILIDAD:
3.1 Del Jefe de División de Laboratorios:
• Autoriza la adquisición de materiales requeridos por el laboratorio para el cumplimiento
de este procedimiento.

3.2 Jefe de Aseguramiento de la Calidad:

• Escoge a los analistas responsables de la ejecución del control microbiológico de las
condiciones ambientales y prevención de la contaminación cruzada.
• Supervisar el cumplimiento de este capítulo y evalúa los registros exigidos.
• Determinar la conformidad de la evaluación o la mejora de los procesos.
• Para la adquisición de materiales, elevará un informe que será sometido a la aprobación
del JDL.

3.3 Del analista:

• Informa sobre la problemática existente, referida a la evaluación y prevención en los
ambientes del laboratorio.
• Reportará los resultados de dicha evaluación en los Registros correspondientes. Siendo el
responsable de mantener actualizado los registros.
• Informa cualquier eventualidad ocurrida.

3.4 Del Auxiliar del laboratorio:

• Limpieza y desinfección de todas las áreas del laboratorio.
• Descarte de material contaminado.

4. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO:

Para el mejor control de las condiciones ambientales se mantiene las puertas y ventanas del
laboratorio cerradas evitando contaminación externa. El Laboratorio cuenta con aire acondicionado
para el control de temperatura y humedad relativa de los ambientes.
Como prevención de la contaminación cruzada, las áreas del laboratorio se han separado
físicamente en:
Área de trabajo, área estéril, área de pesado, área de biología molecular y área de lavado. El acceso
es restringido en las salas de pesado, estéril y biología molecular; por ser lugares donde se procesan
muestras y se trabaja con material contaminado.

T. Agurto – J.C. Ramos

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4.1 Limpieza y Desinfección de las áreas del Laboratorio:

De acuerdo al programa de limpieza y desinfección

Responsable: Auxiliar del laboratorio (a su ausencia, cualquiera de los analistas del laboratorio de
microbiología estará en condiciones de realizar dichas funciones o podrá disponer que algún
personal de limpieza), para que bajo su supervisión realice dicha tarea.
Frecuencia: La que indica el Cuadro N°01. Programa de limpieza y desinfección.

Registro: Todas las acciones son registradas en el formato Control de limpieza del laboratorio de
microbiología.

Cuadro N 1. Programa de limpieza y desinfección

Área/ Objeto Actividad Procedimiento Frecuencia Responsable

Retirar el polvo y la suciedad con un

A primera hora del día
Limpieza y trapeador húmedo.
Pisos (antes de iniciar labores)
desinfección Desinfectar con un solución de Hipoclorito de Auxiliar
Diario
sodio a 500 ppm
Retirar el polvo con una franela húmeda, A primera hora del día y
Mesas sala de Limpieza y
desinfectar con Hipoclorito de sodio a 250 cada vez que se Auxiliar
trabajo desinfección
ppm encuentre sucia
Primera limpieza con una franela húmeda,
A primera hora del día y
Limpieza y luego desinfección con Hipoclorito de sodio a Auxiliar y
Mesa sala estéril cada vez que se
desinfección 250 PPM, la segunda limpieza entre siembra y analistas
encuentre sucia
siembra hacerla con alcohol al 70%.
Techos Limpieza Retirar el polvo con escobillón y trapo seco Mensual Auxiliar
Retirar el polvo con una franela húmeda, Mantenimiento
Mensual (cara externa),
Ventanas Limpieza secar con papel toalla.
Semanal (Cara interna)
Auxiliar
Se limpiará interna y externamente con una
Equipos Limpieza (interna y
franela húmeda. Diaria/semanal
(incubadoras) y externa) y Auxiliar
Desinfectar internamente con trapo y alcohol
(estufas) desinfección
al 70%.
Se limpiará externamente con una franela
húmeda.
Limpieza y lavado Diaria/semanal.
Autoclaves Internamente se raspará con escobilla, Auxiliar
interno
quitando todo el sarro, enjuagarlo bien con
agua destilada.
Lámparas de luz Trapo humedecido en alcohol al 70%
Limpieza Semanal Mantenimiento
ultravioleta
Restregar con una escobilla, lavar con sol.
Bidones agua Limpieza y
detergente, desinfectar con hipoclorito de Semanal Auxiliar
destilada desinfección
sodio a 50 PPM
Estantes de Limpiar con trapo húmedo
Limpieza Mensual Auxiliar
reactivos
Frascos de Limpiar con trapo seco
reactivos, Limpieza Semestral Auxiliar
desecadores
Felpudos Limpieza y Lavado Limpieza /Lavar con detergente Diaria / lavado Semanal Auxiliar

T. Agurto – J.C. Ramos

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4.2 Desinfección de las áreas del laboratorio:

Todas las áreas serán desinfectadas con alcohol de 70° y adicionalmente el área Estéril será irradiada
con lámparas UV.

Responsable: Analistas y auxiliar de laboratorio.

Además de lo antes descrito, los profesionales que ejecuten labores de ensayo en la sala estéril,
efectuarán las siguientes tareas:

• Antes y después de realizar un ensayo en este ambiente deberán desinfectar las superficies
de trabajo con alcohol de 70°.
• Si las labores realizadas en las salas de pesado y estéril hubieran sido intensas, procederán
adicionalmente a la práctica usual de desinfección de superficies a irradiar luz UV a dichas
salas durante un lapso no menor de 15 minutos para luego proseguir con los trabajos.

Consideraciones con el uso de la luz UV.

1. No estar presente cuando se irradia el ambiente.
2. Ventilar la zona irradiada antes de ingresar

4.3 Control microbiológico de los Ambientes y superficies:

Método: Exposición de placas con medios de cultivo y placas de contacto.
Responsable: Analista encargado
Frecuencia: mensual
Procedimiento:

Control de ambientes:
Para comprobar la eficiencia de las medidas adoptadas para la limpieza y desinfección de los
ambientes del laboratorio, áreas internas de las incubadoras y cabinas de bioseguridad ⃰, se
procederá exponiendo una placa con agar estándar (PC) y otra con agar para mohos (APD) durante
15’ de exposición por cada área de trabajo y equipos. Más de 15 colonias en placas es una indicación
de que la calidad microbiológica del aire no puede ser apta para la realización de análisis de
laboratorio. En tal caso, deberá suspenderse la actividad del laboratorio, desinfectarse todas las
superficies, y evaluar de nuevo la calidad microbiológica del aire antes de reanudar las operaciones
normales del laboratorio.
⃰ Para cabinas de bioseguridad la exposición de placas será en un lapso de 1 h con el flujo encendido.

Placas con APC incubando a 35°C hasta por 48 horas.

Placas con APD o Agar Sabouraud de 22°C a 25°C de 5 a 7 días.

Control de superficies:
El control microbiológico de superficie nos proporciona información sobre la cantidad de
microorganismos presentes sobre una superficie, la cual puede ser las mesas de trabajo de cada
área. Esta evaluación generalmente se hace utilizando: Placas de contacto (Petrifilm)
Para tomar la muestra se abre la placa previamente hidratada y se presiona sobre la superficie a
ensayar sin deslizarla. Se tapa la placa y se incuba bajo las condiciones adecuadas. Se cuenta el
número de colonias y se calcula el número de UFC/ área de la placa.

Como alternativa al método de placas de Petrifilm se usará el método del Hisopo (torunda) descrita
en la “Guía Técnica para el Análisis Microbiológico de Superficies en contacto con Alimentos y
Bebidas” RM N° 461-2007/MINSA. El reporte será en UFC/cm2.

T. Agurto – J.C. Ramos

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NOTA: Es necesario desinfectar la superficie evaluada luego de tomar la muestra, ya que podrían
quedar restos del medio de cultivo que favorecen el crecimiento de los microorganismos.

Registro:
Tanto para el control microbiológico de ambientes como de superficies se coloca el n° de lote del
medio utilizado en el Registro: Control Microbiológico de Ambientes y superficies.

Acción correctiva:
Si no se está cumpliendo con el criterio establecido, el PEL de Microbiología analizará las causas que
originaron dicho problema según el procedimiento: Control de trabajo de ensayo no conforme para
tomar inmediatamente medidas correctivas que pueden incluir:
1. Mayor frecuencia en la limpieza y desinfección,
2. Incremento de la concentración del detergente y desinfectante, su cambio o aplicación de
medidas que aseguren la esterilidad.

4.4 Control Ambiental de Temperatura y Humedad:

Para el control adecuado de las condiciones ambientales, el laboratorio cuenta con
termohigrómetros para el monitoreo de la temperatura y humedad relativa de las áreas del
laboratorio de microbiología. Los datos del monitoreo son reportados en el formato respectivo.
Frecuencia: Diaria
Responsable: Analista encargado
Registro: Formato de Control Ambiental de temperaturas CODIGO

Los criterios establecidos para Temperatura y Humedad del Laboratorio son:

Temperatura entre 18 a 27°C y Humedad Relativa entre: 40 a 80%.

4.5 Control de la Eficiencia Bacterial de la Luz Ultravioleta2:

Procedimiento:
1. Sembrar por duplicado un inoculo conteniendo entre 200 y 300 colonias de E. coli y St.
aureus en la superficie de las placas de Agar Plate Count y extenderlo con la espátula de
Drigalsky.
2. Un par de placas de cultivo de E. coli y otras de St. aureus son expuestas bajo incidencia de la
lámpara de luz UV ubicada en cada área requerida por un tiempo de 2 minutos. Estas placas
se incuban a 35°C por 48 horas.
3. Un par de placas de cultivo de E. coli y St. aureus que no se exponen a la luz UV son
directamente incubadas.
4. Luego del tiempo de incubación proceder al recuento de placas.
5. Se deberá reemplazar el bulbo si el conteo no se reduce al 99%.
Responsabilidad: Analista encargado
Frecuencia: Cada 4 meses
Registro: Eficacia Bactericida de la Luz Ultravioleta

Nota: la exposición de las placas será debajo de cada una de las lámparas del área respectiva,
excepto en las cabinas de bioseguridad, en donde están ubicadas en la cabina propiamente dicha.

4.6 Control de Esterilidad de las Autoclaves:

Responsabilidad: Analista encargado
Frecuencia: Mensual

T. Agurto – J.C. Ramos

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1. Colocar en la autoclave un bioindicador de esterilidad (espora de Geobacillus

stearothermophylus) dentro de un vaso de precipitado, para evitar contaminación en caso
de ruptura; ubicándolo en lugares donde las condiciones de esterilización sean
desfavorables (espacio inferior y/o medio de la autoclave).
2. Autoclavar a la temperatura de 121ºC+/-1ºC, es decir a la temperatura de trabajo.
3. Incubar a la temperatura y tiempo que indicada por el fabricante. Como control, incubar un
bioindicador sin esterilizar.
4. Observar los cambios producidos en el bioindicador: a) Si no existe crecimiento o cambio de
color, queda demostrada una esterilización suficiente. b) La existencia de crecimiento o
cambio de color indica una esterilización insuficiente.
5. Reportar los resultados en el Registro: Control de esterilidad de autoclaves.

4.7 Descontaminación y Descarte de material contaminado:

Responsabilidad: Auxiliar de laboratorio, Analista encargado

Frecuencia: Permanente

Descontaminación del material:

Todo material de trabajo del laboratorio (medios de cultivo con microorganismos o aquellas
muestras que hayan tenido contacto con cepas) inmediatamente después de ser utilizado en los
ensayos deberá ser descontaminado antes de su limpieza o descarte.

Procedimiento
• Por esterilización en autoclave (de material contaminado), por 30 minutos a temperatura de
121°C +/- 2°C para materiales resistentes al calor que estuviera en contacto con los
microorganismos en cultivo.
• Por inmersión en una solución desinfectante para materiales de pequeños y resistentes a la
corrosión (por ejemplo: pipetas).

Descarte de material:
Si el material descontaminado fuera sólido, se descartará en la basura colocándose en bolsas de
plástico, en caso de ser líquido se descartará vertiéndolo en el desagüe.

4.8 Eliminación de Muestras:

Responsabilidad: Auxiliar de laboratorio
Frecuencia: Cada día

El Laboratorio de microbiología no contempla la recepción o ingreso de contramuestras.

• Para el descarte o eliminación de muestras líquidas: Si la muestra está fuera de los

parámetros de las normas vigentes de DIGESA para agua potable, se procederá a
someter a tratamiento térmico (autoclave) antes de su eliminación a la red de
desagüe.

T. Agurto – J.C. Ramos

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Preparación de los desinfectantes:

Responsable: auxiliar /analista

De la solución de hipoclorito de sodio concentrada al 10%

Concentración Volumen a preparar Cantidad de hipoclorito a

utilizar
50 PPM 1 LITRO 0.5 mL
250PPM 2 LITRO 5 mL
500 PPM 1 LITROS 5 mL

Al preparar las soluciones tener en cuenta:

• Medir la cantidad de la solución concentrada de hipoclorito y completar con agua
destilada el volumen final que se ha decidido preparar.
• Colocar la solución en frasco que no deje pasar la luz, tapar bien el frasco
• Utilizar sólo el día de su preparación.
• No mezclar el hipoclorito de sodio con ningún detergente, ya que pierde su poder de
estabilidad.

Fuentes:
1. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 2012. 9020B
Intralaboratory Quality control Guidelines. 9-4;9-5.
2. ISO 7218: 2007 (E) Microbiologics of food and animal feeding stuffs-General requirements
and guidance for microbiological examinations.
3. Manuales para el Control de Calidad de los Alimentos 12. La Garantía de la Calidad en el
Laboratorio Microbiológico de Control de los Alimentos. Estudio FAO: Alimentación y
Nutrición.

T. Agurto – J.C. Ramos

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Práctica N° 01
Cocos Gram Positivos

Introducción:
Son bacterias gram positivas, de forma esférica (coco) que se pueden encontrar agrupadas desde
dos unidades denominadas diplococos (Streptococcus pneumoniae), de cuatro unidades
denominadas tétradas (Gafkia tetragena), de ocho unidades denominadas sarcinas (Sarcina), son
también frecuente las cadenas de tres o mas unidades de cocos denominadas estreptococos
(Streptococcus termophilus) y los que forman agrupaciones irregulares como racimo de uvas
denominadas estafilococos (Staphylococcus aureus).
Entre los géneros existen bacterias aeróbicas, anaeróbicas facultativas o anaeróbicas estrictas, otra
característica que presentan es su capacidad para la licuefacción de la gelatina y su motilidad es
poco común.

La familia Micrococcaceae se encuentra constituida por los siguientes géneros: Micrococcus,

Planococcus, Stomatococcus y Staphylococcus, bacterias que habitan en ambientes húmedos y
nutritivos, algunas especies en la piel y mucosas de los animales, la gran mayoría son no patógenos,
desarrollan fácilmente en medios de cultivos sin colorantes e inhibidores.

Las bacterias del género Micrococcus son estrictamente aeróbicas, catalasa positiva, forman colonias
húmedas, cremosas, de borde circular, convexas, de coloración blanquecinas, la mayoría mide de 3 a
5 mm de diámetro, usualmente pigmentadas de color amarillo y rojo.
La diferencia de los géneros se basa en su morfología (células y colonias), metabolismo, presencia de
toxinas y enzimas patogénicas.

Los Micrococcus habitan frecuentemente en substratos orgánicos, con excepción de Staphylococcus

los demás géneros son saprofitos. Micrococcus incluye las siguientes especies M. luteus, M. lylae, M.
varians, M. roseus, M. agilis, M. kristinae, M. nishinomiyaensis, M. sedentarius y M. halobius. Los
que se diferencias por su producción de pigmento y metabolismo al desarrollar colonias y
especialmente por antígenos con estructura química de su peptidoglicano o MUREINA.

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Objetivos:
❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos específicos de Micrococcus,
Staphylococcus, Leuconostoc.

❖ Interpretar las pruebas bioquímicas o metabólicas de los géneros Micrococcus,

Staphylococcus, Leuconostoc.

Material y Procedimiento

Material
Material biológico:
• La muestra es generalmente alimento elaborado con leche o derivado y huevo. Las muestras
a partir de los animales pueden ser hisopados o raspados de piel, mucosas, pus u otra área
corporal donde se sospeche la presencia de bacterias.

Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlermeyer 500 mL.
• Probeta 100 mL.
• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

Medios de cultivo y otros:

• Medio de transporte
• Agar nutritivo
• Agar sangre
• Agar chapman
• Agar manitol salado
• Agar Baird Parker
• Caldo nutritivo
• Caldo BHI
• Caldo glucosado con rojo de fenol
• Discos de Polimixina B 300U
• Discos de Furazolidona 100µg
• Discos de Novobiocina 5 µg
• Glicerol
• Purpura de Bromocresol
• Eritromicina

Otros materiales:
• Asa de siembra
• Utensilios estériles (cuchillo, tijera, pinza, espátula)
• Papel de manteca u otro
• Pabilo
• Plumón indeleble
• Papel kraft

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Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Balanza
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismos presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra de alimento debe estar elaborado en base a leche o derivados
preferiblemente, se procede a tomar la muestra en un recipiente esterilizado o bolsa
plástica de primer uso, una cantidad aproximada de 100 g. y se procede a llevarla
inmediatamente al laboratorio o colocarla en una caja de frio donde puede
permanecer más tiempo (2-4 horas).

• Piel o mucosa obtenida mediante un raspado o hisopado. La torunda se esteriliza en

un sobre hecho de papel kraft y se mantiene ahí hasta la toma de la muestra.
Durante la toma de la muestra se procede a coger una torunda o hisopo para
pasarlo sobre la superficie de la piel o mucosa, colocar luego en un tubo que
contiene el medio de transporte.

2. Enriquecimiento:
• La muestra, si es alimento se pesa 10 g o 1 g y se coloca en 90 mL 0 9 mL de caldo
nutritivo, BHI o tripticasa soya durante algunas horas para su recuperación,
adaptación y desarrollo.

3. Cultivos:
• Luego de la recuperación se procede a la siembra en los medios de cultivos sólidos
indicados para el aislamiento respectivo de las colonias.
• Preparación del medio para la producción de acidos a partir del gliceron en
presencia de Eritromicina. Al agar base enriquecido se le añade el purpura de
Bromocresol, glicerol 1% y 0,4 µg/mL de eritromicina. Servir en placas Petri.

4. Estudio morfológico de las colonias.

5. Coloración Gram.

6. Pruebas bioquímicas.

7. Cepario.

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Staphylococcus aureus
Son cocos Gram positivos agrupados de forma irregular como un “racimo de uvas” cuando son
cultivados en un medio de cultivo sólido, miden aproximadamente entre 0,5 a 1,5 µm de diámetro,
carecen de movilidad, son aerobios facultativos, catalasa positivos, no forman esporas y capaces de
desarrollar en un medio de cultivo con alta concentración de sal (10%).
Habitan normalmente a nivel de la piel y de mucosas del hombre y de los animales (mamíferos y
aves).
Las formas patógenas infectan la piel, las mucosas, las heridas, las vías respiratorias generalmente es
por eso su fácil acceso a los alimentos y cuando llegan a ellos proliferan rápidamente produciendo
varias toxinas (Enterotoxinas) que produce una irritación a nivel de la mucosa intestinal produciendo
una enterocolitis acuosa que puede durar entre 1 a 3 días.
Existen 27 especies y 7 subespecies en el género, 14 especies y 2 subespecies se encuentran en el
hombre.

Staphylococcus Coagulasa Positivos

Especies Hospedador Proceso clínico
Vacuno Mastitis, impétigo de la ubre
Ovino Mastitis, Dermatitis
Cabras Mastitis, Dermatitis
Cerdos Botriomicosis mamaria
Impétigo de las mamas
S. aureusa
Caballos Botriomicosis cordón espermático
Mastistis
Perros, gatos Procesos supurativos similar a los
causados por S. intermedius
Aves Artritis y septicemia en pavos
Onfalitis en pollos
Perros Pioderma, endometritis, cistitis, otitis
externa y otros procesos supurativos
S. intermedius Gatos Procesos piógenos
Vacunos Mastitis (raras)
Cerdos Epidermitis exudativa. Artritis
S. hyicusb
Vacuno Mastitis (rara)
S. aureus subsp. anaerobius Ovino Linfoadenitis
S. delphini Delfines Lesiones cutáneas supurativas
S. schleiferi subsp. coagulansc Perros Otitis externa
a S. aureus puede producir septicemia neonatal e infecciones de heridas en muchas especies
b Un 25-50% de las cepas de S. hyicus son coagulasa positivas
c Descrito por Igimi et al. (1990)
Tomado de Microbiología y Enfermedades Infecciosas Veterinarias. Ed. Acribia

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Staphylococcus Coagulasa Negativos

Especies Hospedador
Cabras: fosas nasales
S. arlettae
Aves: piel
S. capitis Vacuno: leche
S. caprae Cabras: piel
S. caseolyticus Vacuno: leche – derivados
S. chromogenes Vacuno: Leche
Cerdos, Aves: piel
S. cohnii Vacuno: Lechea
S. epidermidis Vacuno: Lechea
Perros:, caballos: infección heridas
S. equorum Caballos: piel
S. felisb Gatos: otitis externa, infección cutánea
S. gallinarum Aves: infecciones cutáneas

S. haemolyticus Vacuno: Lechea

S. hominis Vacuno: Lechea
Cerdos, Ovinos, Cabras: infecciones
S. lentus
cutáneas
S. saprophyticus Gatos: piel
S. sciuri Gatos, otros animales. Infección cutánea
Vacuno: Lechea
s. simulans
Perros, gatos, cerdos: piel
S. vitulinus Vacuno, ovino, cerdos. piel
S. warneri Vacuno: Lechea
Vacuno, ovino: Lechea
S. xylosus
Gatos, aves, cerdos, caballos: piel
a Ocasionalmente aislados de casos de mastitis subclínicas o clínicas.

Tomado de Microbiología y Enfermedades Infecciosas Veterinarias. Ed. Acribia

Fase Factores de virulencia Infecciones asociadas

Adherencia bacteriana Factores de agregación (clumping factor), proteína de Endocarditis, infecciones

unión a fibrinógeno, fibronectina y sialoproteina ósea. asociadas a prótesis y
catéteres intravasculares,
osteomielitis, artritis.
Presencia bacteriana Formación de biocapas (polisacáridos de adhesión Infecciones cutáneas invasivas,
intracelular), variantes de colonias pequeñas y persistencia neumonía necrotizante,
intracelular. abscesos.
Evasión de los Capsula polisacárido, proteína A, proteína inhibidora de la Infecciones cutáneas invasivas,
mecanismos de quimiotaxis (CHIP), proteína de adherencia extracelular neumonía, necrotizante,
defensa del huésped (Eap), citotoxinas (leucocidina de Panton Valentine y alfa- abscesos.
toxina).
Penetración e invasión Proteasas, lipasas, nucleasas, hialuronidasas, fosfolipasa C Destrucción tisular e
tisular y elastasas. infecciones metastasicas.
Shock séptico y Enterotoxinas, toxinas del síndrome del shock toxico 1, Toxiinfecciones alimentarias,
cuadros toxicos toxina exfoliativas A y B, alfa-toxina, peptidoglicanos y síndrome del shocl toxico,
acidos teicoicos. síndrome de la piel escaldada,
impétigo y sepsis.
Tomado de Infecciones Producidas por Staphylococcus aureus. Ed ICG Marge

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS
❖ Prueba de la Catalasa
La Catalasa es una enzima homoproteica, encargada de descomponer el peróxido de
hidrogeno (H2O2) en elementos menores como agua y oxígeno. Está presente en la mayoría
de bacterias aerobias estrictas, facultativas y anaerobias facultativas. El peróxido de
hidrógenos se forma como uno de los productos finales de la oxidación del metabolismo
aerobio de los carbohidratos su acumulación es toxica para la bacteria. Por ello la catalasa
convierte el peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno, según la siguiente reacción:

❖
La prueba de la catalasa se realiza en lámina o tubo, se utiliza para diferenciar a los géneros
Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Micrococcus (+), así como también a Bacillus (+) de
Clostridium (-).

Procedimiento:
Colocar sobre un portaobjetos una colonia bacteriana y agregar unas gotas de H202 al 3 %.
Observar el desprendimiento de burbujas (catalasa +).
Consideraciones: No utilizar colonias provenientes de Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).

❖ Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es una enzima producida por Staphylococcus aureus, es secretada al exterior y
actúa con algunos de los constituyentes del suero formando un coagulo o trombo de fibrina.
La prueba de la coagulasa se utiliza para diferencias a Staphylococcus aureus de otros
especies de estafilococos.
Existen dos formas de determinar la presencia de la coagulasa:
❖ Coagulasa ligada (procedimiento en portaobjetos): conocida como factor de aglutinación,
se encuentra unida a la pared celular de la bacteria y no en los filtrados del cultivo. La
coagulasa ligada o Factor de agregación es la responsable de la absorción del fibrinógeno y
lo altera de tal manera que permite su precipitación sobre los estafilococos y genera la
agregación de estos, lo que puede visualizarse con la aglutinación rápida de las células
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bacterianas. El factor de agregación convierte el fibrinógeno en fibrina, sin la intervención de

otros factores propios del plasma.

❖ Coagulasa libre ((procedimiento en tubo de ensayo): es una sustancia similar a la trombina

presente en el filtrado de los cultivos bacterianos, permite detectar tanto a la coagulasa
ligada como a la libre. La coagulasa libre reacciona con el factor de reacción de la coagulasa
(similar a la Trombina) para formar el complejo coagulasa-factor de la reacción de la
coagulasa, este complejo actúa de manera indirecta para convertir el fibrinógeno en fibrina.
La diferencia principal es que el factor de reacción de la coagulasa no requiere de iones de
calcio.

❖ Prueba de la DNAsa
El ácido desoxirribonucleico (DNA) se encuentra altamente polimerizado y es el sustrato
para que la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa) pueda hidrolizarlo. Esta prueba permite
diferenciar a las bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa de aquellas que
carecen. La presencia de la enzima se puede determinar añadiendo ácido clorhídrico 1N
sobre el cultivo bacteriano. El ácido desoxirribonucleico presentara transparencia, mientras
el ácido desoxirribonucleico polimerizado, precipitara y tornara el medio de cultivo opaco.

Procedimiento:
Se inocula o siembra el microorganismo en línea densa sobre agar DNAsa y después de 18 a
24 horas de incubación, revelar con HCl al 1N, que precipita el DNA nativo del medio.

Interpretación:
El área sembrada estará rodeada por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado
o hidrolizado, el cual se considera una prueba (+).

❖ Sensibilidad a Novobiocina
Fundamento:
Varias especies del género Staphylococcus son resistentes a la Novobiocina (disco de 5 µg.)
dentro de las cuales se encuentra S. Saprophyticus y sensibles como S. aureus y Micrococcus.

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Procedimiento:
Se siembra una placa de agar sangre o agar Mueller Hinton como si se fuera a realizar un
antibiograma. Se utiliza un hisopo embebido en una suspensión de la bacteria a evaluar.
Luego se aplica el disco de Novobiocina y se incuba a 35°C por 18 horas.

Interpretación:
Un halo de inhibición de crecimiento menor o igual a 16 mm corresponde a S.
saprophyticus. Un halo de inhibición mayor de 16 mm corresponde a otros estafilococos
coagulasa negativos

❖ Fermentación de Manitol
Fundamento
Es un medio selectivo ideal para el aislamiento de Staphylococcus, presenta alta
concentración de cloruro de sodio que inhibe el desarrollo de bacterias no halófilas y el
manitol o D-manita es desdoblado o fermentado lo cual produce la generación de ácido
ocasionando el viraje del indicador rojo de fenol a amarillo, permitiendo un mejor
diagnóstico de las especies patógenas de estafilococos que pueden fermentar este azúcar.

Procedimiento:
Se siembra una placa de agar manitol salado. Se utiliza un hisopo embebido en una
suspensión de la bacteria a evaluar. Luego se incuba a 35°C por 24 horas.

Resultados
Las colonias de Staphylococcus aparecen circulares cremosas de 3 a 5mm de diámetro, de
color blanco amarillentas, alrededor de cada colonia desarrollada sobre el medio de cultivo
el color vira al transparente amarillento por el metabolismo del manitol, puede haber
colonias rojizas pero sin desdoblamiento del manitol, el rojo de fenol mantiene su color
rojizo a pH 7.4. Las colonias amarillentas son consideradas como Staphylococcus para lo cual
debe hacerse una coloración Gram y otras pruebas bioquímicas especialmente el de plasmo
coagulasa.
S. aureus: manitol (+)
S. epidermides: manitol (-)

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Práctica N° 02
Streptococcaceae

Introducción:
Son cocos agrupados de dos o mas cocos formado cadenas, Gram positivos, la mayoría son
anaerobios facultativos, aunque existen anaerobias estrictas y otros que necesitan requerimientos
de CO2 (capnofílicas), sus requerimientos nutricionales son exigentes, los medios de cultivo deben de
llevar sangre y suero para facilitar su crecimiento y desarrollo, son capaces de fermentar los
carbohidratos produciendo acido láctico y son catalasa negativos.

Algunos forman parte de la flora normal del hombre y otras se relacionan con enfermedades
humanas. Las formas no patógenas desarrollan en los alimentos, las denominadas patógenas
habitan a nivel de la piel y las mucosas, las vías respiratorias y genital principalmente en los
mamíferos.

De acuerdo a su habitad y metabolismo de los carbohidratos presentan la siguiente clasificación:

1. Homofermentativos Producción de ácido láctico D, catalasa

negativa. (Streptococcus)
2. Homofermentativos Producción de ácido láctico inactivo,
catalasa variable. (Pediococcus)
3. Heterofermentativos Producción de ácido láctico L, ácido
acético, etanol, CO2, catalasa negativa.
(Leuconostoc)

Género: Streptococcus
Son células esféricas u ovoides, miden entre 0,5 a 2 µm de diámetro, carecen de motilidad, no
forman esporas y catalasa negativos. Se encuentran constituidos por especies patógenas para el
hombre y animales que afectan a nivel de la piel y las mucosas, algunas especies afectan las válvulas
cardiacas, existen dos especies que producen enterocolitis y también existen dos especies utilizadas
en la industria alimentaria.

El género Streptococcus (Hardie, 1986; Mundt, 1986) se encuentra constituido por 30 especies que
se van agrupar en 6 grupos:
• Estreptococos piógenos
• Estreptococos orales
• Estreptococos anaeróbicos
• Estreptococos lácticos
• Otros Estreptococos
• Enterococos

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Recientemente con el desarrollo y utilización de técnicas bioquímicas y moleculares sofisticadas

como por ejemplo la determinación de la composición de la guanina y citocina del ADN (mol %G+C),
hibridación química de los ácidos nucleicos (ADN:ADN y ADN:ARN) han originado cambios en la
taxonomía de las bacterias lácticas lo que se ve reflejado en la 9 na edición del “Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology” (Holt et.al 1994).

Refiriéndonos a la secuenciación de ARNr 16s y ha estudios de hibridación ADN:ARN (Garvier y

Farrow, 1981; Kilpper – Balz y Schleifer, 1981; Schleifer et.al, 1985) el género Streptococcus se ha
dividido en tres grupos filogenéticamente distintos:
• Streptococcus sensu estrictos
• Enterococcus
• Lactococcus

El género Streptococcus sensu estrictos comprende a la mayoría de Streptococcus incluidos en la

ultima edición de “Bergey’s Manual” (1986) en los grupos piógenos, orales y “otros” estreptococos,
así como a las diversas especies de identificación reciente y quedan excluidos del género los
Streptococcus anaeróbicos (Schleifer y Kilpper – Balz, 1987). De los Streptococcus la especie útil en la
industria de los alimentos es Streptococcus termophilus que junto a Lactobacillus delbrueckii
subespecie bulgaricus, se utilizan para la elaboración del yogurt y algunas variedades de queso.

El género Lactococcus (Schleifer et.al, 1985) alberga a los Streptococcus lácticos o del grupo N de
Lancefield (Jones, 1978), representada por Lactococcus lactis subespecie lactis, ahora Lactococcus
lactis (incluye a las especies anteriormente denominadas S. lactis subespecie lactis, S. lactis
subespecie diacetylactis y Lb. Xilosus) y Lactococcus lactis subespecie cremoris ahora Lactococcus
cremoris. Además, están presentes Lactococcus lactis subespecie hordniae (anteriormente Lb.
hordniae) ahora denominada Lactococcus hordniae; a Lactococcus raffinolactis (anteriormente S.
raffinolactis), Lactococcus garviae, Lactococcus plantarum y Lactococcus piscium de reciente
identificación (Williams et. Al, 1990).

El género Enterococcus se encuentra formado por los anteriormente denominados Streptococcus

fecalis o del grupo D de Lancefield (Jone, 1987) con excepción de Streptococcus bovis y
Streptococcus equinus junto a otras especies de reciente identificación.
Cabe señalar que los Streptococcus del grupo N de Lancefield, incluidas previamente en el genero
Lactococcus, has pasado a formar parte del género Vagococcus con la especie Vagococcus fluviales
como cepa tipo (Collins et. al 1989ª). Posteriormente algunos lactobacilos atípicos aislados del
salmón se han identificado como Vagococcus salmoninarum (Walbanks et.al, 1990).

Las enfermedades en el hombre ocasionado por este grupo de microorganismo han sido complicada
debido a ello se utiliza para su identificación lo menos cuatro esquemas diferentes como son:

• Presentación clínica (streptococcus piógenos, orales y entéricos)

• Serología (grupos de Lancefield A-H y K-V)
• Hemolisis (beta – hemolisis, alfa – hemolisis y delta – hemolisis)
• Propiedades bioquímicas (fisiológicas)

En 1933 Rebecca Lancefield identifico distintos tipos de antígenos para la identificación de las cepas
β-hemolíticas patógenas. La mayoría de las cepas ß-hemolíticas, y algunas α-hemolíticas y γ-
hemolíticas poseen antígenos específicos (carbohidratos) a nivel de su pared celular o
peptidoglicano. No todos los estreptococos poseen estos antígenos de la pared celular.

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Así tenemos a los siguientes grupos:

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Objetivos:
❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos selectivos de los microorganismos del
género Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus.

❖ Interpretar las pruebas bioquímicas o metabólicas de los géneros Streptococcus,

Enterococcus y Lactococcus.

Material y Procedimiento

Material

Material biológico:
• La muestra es generalmente alimento elaborado con leche o derivado y huevo. Las muestras
a partir de los animales pueden ser hisopados o raspados de piel.
Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlermeyer 500 mL.
• Probeta 100 mL.
• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos
Medios de cultivo y Reactivos
• Medio de transporte
• Agar nutritivo
• Agar sangre
• Agar MRS
• Agar Leche
• Agar Sangre con Azida
• Agar Mc Conkey

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• Caldo nutritivo
• Caldo BHI
• Cloruro de sodio
• Azul de metileno
Otros materiales:
• Asa de siembra
• Utensilios estériles (cuchillo, tijera, pinza, espátula)
• Papel de manteca u otro
• Pabilo
• Plumón indeleble
• Papel kraft
Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Licuadora
• Balanza
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismo presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra de alimento debe estar elaborado en base a leche o derivados
preferiblemente, se procede a tomar la muestra en un recipiente esterilizado o bolsa
plástica de primer uso, una cantidad aproximada de 100 g. y se procede a llevarla
inmediatamente al laboratorio o colocarla en una caja de frio donde puede
permanecer más tiempo (2-4 horas).

• Piel o mucosa obtenida mediante un raspado o hisopado. La torunda se esteriliza en

un sobre hecho de papel kraft y se mantiene ahí hasta la toma de la muestra.
Durante la toma de la muestra se procede a coger una torunda o hisopo para
pasarlo sobre la superficie de la piel o mucosa, colocar luego en un tubo que
contiene el medio de transporte.

2. Enriquecimiento:
• La muestra, si es alimento se pesa 10 g o 1 g y se coloca en 90 mL 0 9 mL de caldo
nutritivo, BHI o tripticasa soya durante algunas horas para su recuperación,
adaptación y desarrollo.
• En el caso del hisopado, el hisopo se coloca en el mismo caldo de enriquecimiento.
3. Cultivos:
• Luego de la recuperación se procede a la siembra en los medios de cultivos sólidos
indicados para el aislamiento respectivo de las colonias.

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Clasificación científica
Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Lactobacillales
Familia: Streptococcaceae
Género: Streptococcus

Especies
Streptococcus agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus salivarius
Streptococcus sanguinis
Streptococcus suis
Streptococcus thermophilus
Streptococcus viridans

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Práctica N° 03
Cocos Gram Negativos: Neisseriaceae

Introducción:
Las neiserias son microorganismos gramnegativos baciliformes o con forma de coco quese pueden
encontrar en pares o formando cadenas cortas. Los diplococos tienen forma de un ¨grano de café¨, o
encontrarse en pares con sus lados adyacentes aplanados. Todas las especies del genero Neisseria
suelen encontrarse en las mucosas de huéspedes de sangre caliente.
Las neiserias comprenden varias especies, la mayoría de las cuales son relativamente exigentes y
requieren de medios enriquecidos como el agar chocolate que le proporciona un medio de cultivo
rico en hierro. Todos los miembros son catalasa y oxidasa positivos, inmóviles, no forman esporas,
capnófilos y se desarrollan mejor en ambientes húmedos, producen ácidos a partir de los
carbohidrato estas importantes características permiten diferenciarlos de bacterias
morfológicamente similares, algunas especies producen pigmentos xantofilos y sus colonias pueden
aparecer de color amarillo o marrón.
Neisseria gonorrhoeae (gonococo) y Neisseria meningitidis (meningococo) son patógenas del
hombre y se encuentran de manera típica relacionados con los leucocitos polimorfonucleares o
dentro de los mismos.
Existen especies saprofitas como Neisseria catarrhalis, Neisseria sicca que a menudo se localizan en
las vías respiratorias, otras neiserias se encuentran en mayor prevalencia como Neisseria flava,
Neisseria flavescens que ocasionalmente son causantes de meningitidis o endocarditis.
Las neiserias habitan normalmente las vías respiratorias en el hombre, es decir se pueden obtener
muestras de la rinofaringe y bronquios, como también de los genitales, son agentes causantes de:

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Objetivos:

❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos selectivos de Neisseria.

❖ Interpretar las pruebas bioquímicas o metabólicas del género Neisseria

Material y Procedimiento

Material

Material biológico:
• La muestra es generalmente exudado faríngeo, secreciones corporales provenientes de la
uretra o vagina, liquido cefalorraquídeo y sangre.

Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlermeyer 500 mL.
• Probeta 100 mL.
• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

Medios de cultivo y Reactivos

• Medio de transporte
• Agar nutritivo
• Agar sangre
• Agar chocolate
• Rojo de fenol
• Caldo BHI

Otros materiales:
• Asa de siembra
• Hisopos
• Utensilios estériles (tijera, pinza, espátula)
• Papel de manteca u otro
• Pabilo
• Plumón indeleble
• Papel kraft

Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Balanza
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

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Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento del microorganismo presente en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra es generalmente exudado faríngeo, secreciones corporales provenientes
de la uretra o vagina, liquido cefalorraquídeo y sangre. Se obtiene mediante un
hisopado. La torunda se esteriliza en un sobre hecho de papel kraft y se mantiene
ahí hasta la toma de la muestra. Durante la toma de la muestra se procede a coger
una torunda o hisopo para pasarlo sobre la superficie de la piel o mucosa, colocar
luego en un tubo que contiene el medio de transporte. En caso de la sangre y LCR en
envases adecuados y estériles.

2. Cultivos:
• En un extremo del medio de cultivo en la placa petri se coloca la muestra con el asa
de siembra o con el hisopo mismo y se distribuye uniformemente por estrías sobre
el medio de cultivo. Se incuba a 37°C durante 24 horas para el desarrollo de las
colonias.

3. Estudio morfológico de las colonias

4. Coloración Gram

4. Pruebas bioquímicas

5. Cepario

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Clasificación científica

Reino: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Beta Proteobacteria
Orden: Neisseriales
Familia: Neisseriaceae
Género: Neisseria

Especies
N. gonorrhoeae
N. meningitidis
N. lactamica
N. cinerea
N. polysaccharea
N. sicca
N. subflava
bv. subflava
bv. flava
bv. perflava
N. mucosa
N. flavescens
N. kochii
N. elongata
subesp. elongata
subesp. glycolytica
Subesp. Nitroreducens
N. weaveri
N. canis
N. denitrificans
N. macacae
N. caviae
N. Ovis
N. cuniculi
N. iguanae

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Práctica N° 04
Bacilos Gram Positivos: Bacillus

Introducción:
El suelo es el habitad mas rico en microorganismos autotróficos y heterotróficos, dentro de los
heterotróficos destacan los Actinomicetales y Bacillaceae.
Los bacilos son cosmopolitas debido a que pueden formar esporas, esta característica los vuelve muy
resistentes a condiciones adversas y pueden mantenerse viables por muchos años. Los Bacillus y
Clostridium viven con facilidad en ambientes con pocos nutrientes y en alimentos se multiplican
rápidamente.

La mayoría de estas bacterias no son patógenas, son buenas productoras de ácidos, alcoholes,
enzimas y algunos antibióticos útiles para la industria.

Los representantes de la familia Bacillaceae se caracterizan por formar esporas y se encuentran

representados por dos géneros Bacillus y Clostridium, ambos se diferencian por su capacidad de
desarrollar en presencia o ausencia de oxigeno, Bacillus es aerobio y Clostridium es anaerobio.

En género Bacillus agrupa un número de especies patógenas y saprófitas, son bacterias aerobias,
Gram positivas, agrupadas en cadena o individuales, forman esporas, se encuentran distribuidas en
el suelo, agua, vegetales, etc.
A lo largo de la historia una especie patógena como Bacillus anthracis agente causante del ántrax o
carbunco en los animales (bovino y equino) y el hombre, es usado además como arma biológica
(bioterrorismo). Bacillus cereus agente causante de intoxicaciones alimentarias, produce dos tipos
de toxinas que desencadenan dos tipos de intoxicaciones alimentarias, la primera es una endotoxina
que se produce durante su desarrollo logarítmico en el alimento y es termolábil se destruye a 56°C
durante 30 minutos (“síndrome diarreico”) y la segunda toxina también se forma en el alimento,
pero es mucho mas termoresistente 126°C durante 90 minutos (“síndrome vomitivo”). Bacillus
thuringiensis patógeno de insectos. Bacillus subtilis habita en el ambiente, es proteolítico, productor
de antibióticos.

El género Clostridium son bacilos Gram positivos, anaerobios, esporulados, tienen la capacidad de
descomponer las proteínas, forman toxinas, son catalasa y peroxidasa negativos, habitan
generalmente el suelo, el intestino del hombre y los animales. Las especies representativas del
género son Clostidium botulinum agente causante del botulismo, Clostridium perfringens agente
causante de la gangrena gaseosa y Clostridium tetani agente causante del tétanos.

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Objetivos:

❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos selectivos del género Bacillus.

❖ Interpretar las características bioquímicas o metabólicas del género Bacillus.

Material y Procedimiento

Material

Material biológico:
• La muestra es generalmente alimento elaborado con leche o derivado, tierra, lana de
carnero y hisopados o raspados de piel, mucosas, pústulas u otra área corporal donde se
sospeche la presencia de bacterias.

Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlermeyer 500 mL.
• Probeta 100 mL.
• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

Medios de cultivo y Reactivos

• Medio de transporte
• Agar nutritivo
• Agar almidón
• Agar base para Bacillus cereus
• Caldo nutritivo
• Caldo glucosado con indicador de rojo de fenol
• Caldo glucosado
• Caldo nitrato (caldo nutritivo mas 0.1%nitrato o nitrito)
• Caldo BHI
• Gelatina
• Medio SIM
• Indol
• Caseína
• glucosa
• Manito, inulina, Glicerol, Arabinosa, Salicina
• Batería de coloración Gram

Otros materiales:
• Asa de siembra
• Utensilios estériles (cuchillo, tijera, pinza, espátula)
• Papel de manteca u otro
• Pabilo
• Plumón indeleble
• Papel kraf

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Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Licuadora
• Balanza
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismo presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra de alimento debe estar elaborado en base a leche o derivados
preferiblemente, también puede ser tierra o lana, se procede a tomar la muestra en
un recipiente esterilizado o bolsa plástica de primer uso, una cantidad aproximada
de 100 g. en caso de los alimentos se procede a llevarla inmediatamente al
laboratorio o colocarla en una caja de frio donde puede permanecer más tiempo (2-
4 horas).

• Piel o pústulas obtenida mediante un raspado o hisopado. La torunda se esteriliza en

un sobre hecho de papel kraft y se mantiene ahí hasta la toma de la muestra.
Durante la toma de la muestra se procede a coger una torunda o hisopo para
pasarlo sobre la superficie de la piel o pústulas, colocar luego en un tubo que
contiene el medio de transporte.

2. Enriquecimiento:
• La muestra, si es alimento se pesa 10 g o 1 g y se coloca en 90 mL 0 9 mL de caldo
nutritivo, BHI o tripticasa soya durante algunas horas para su recuperación,
adaptación y desarrollo.

• En el caso del hisopado o raspado, el hisopo se coloca en el mismo caldo de

enriquecimiento.

3. Cultivos:
Luego de la recuperación se procede a la siembra en los medios de cultivos sólidos indicados
para el aislamiento respectivo de las colonias.

4. Estudio morfológico de las colonias

5. Coloración Gram

6. Resiembras

7. Pruebas de Identificación bioquímica

8. Elaboración de esquemas para la identificación del género Bacillus (tipo de espora,

reacciones bioquímicas).

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Clasificación científica

Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Bacillales
Familia: Bacillaceae
Género: Bacillus

Especies
Acidófilas B. polymyxa
B. acidocaldarius
B. coagulans Productoras de antibióticos
B. polymyxa B. brevis
Alcalinófilas B. cereus
B. alkalophilus B. circulans
B. pasteurii B. laterosporus
B. licheniformis
Halófilas B. polymyxa
B. pantothenticus B. pumilus
B. pasteurii B. subtilis
Psicrotrofas
B. globisporus Patógenos de insectos
B. insolitus B. larvae
B. marinus B. lentimorbis
B. macquariensis B. popilliae
B. megaterium B. thuringiensis
B. polymyxa
Patógenos de vertebrados
Termófilas B. alvei
B. acidocaldarius B. anthracis
B. schlegelii B. cereus
B. stearothermophilus B. coagulans
B. laterosporus
Denitrificantes B. megaterium
B. azotoformans B. subtilis
B. cereus B. sphaericus
B. laterosporus B. circulans
B. licheniformis B. brevis
B. pasteurii B. licheniformis
B. stearothermophilus B. macerans
B. pumilus
Fijadoras de nitrógeno B. thuringiensis
B. macerans

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Práctica N° 05
Bacilos Gram Positivos: Clostridium

Introducción:
El género Clostridium son bacilos Gram positivos, anaerobios, esporulados, tienen la capacidad de
descomponer las proteínas, forman toxinas, son catalasa y peroxidasa negativos, habitan
generalmente el suelo, agua residual, el intestino del hombre y los animales. Las especies
representativas del género son Clostidium botulinum agente causante del botulismo, Clostridium
perfringens agente causante de la gangrena gaseosa y Clostridium tetani agente causante del
tétanos.
Además los Clostridium pueden causar infecciones a nivel de la piel y tejidos blandos, intoxicación
alimentaria y diarrea. La capacidad que tiene de producir enfermedad se atribuye a su capacidad de
resistir condiciones ambientales adversas formando esporas, rápido crecimiento en medios de
cultivos enriquecidos y sin oxigeno, la capacidad de sintetizar numerosas toxinas histolíticas,
enterotoxinas y neurotoxinas.

Cabe recalcar que esta especie es anaerobio estricto y las especies se separan al ámbito patogénico
y no patogénico, así tenemos:

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Objetivos:

❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos selectivos de microorganismos del género

Clostridium.

❖ Interpretación de las características bioquímicas o metabólicas del género Clostridium.

Material y Procedimiento

Material
Material biológico:
• La muestra es generalmente alimento rico en proteínas de procedencia dudosa, enlatados
dudosos, tierra, agua residual, lana de carnero y hisopados o raspados de piel, mucosas,
pústulas, tejido u otra área corporal donde se sospeche la presencia de bacterias.

Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlermeyer 500 mL.
• Probeta 100 mL.
• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

Medios de cultivo y Reactivos

• Medio de transporte • Esculina
• Agar anaeróbico Brewer • Lecitinasa
• Agar sangre • Lipasa
• Agar yema de huevo • Glucosa
• Agar nutritivo • Almidón
• Caldo nutritivo • Manitol
• Gelatina • Batería de coloración Gram
• Indol

Otros materiales:
• Asa de siembra
• Utensilios estériles (cuchillo, tijera, pinza, espátula)
• Papel de manteca u otro
• Pabilo
• Plumón indeleble
• Papel kraft

Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Licuadora
• Balanza
• pH-metro
• Otros aparatos propios del laboratorio
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Procedimiento

La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de

cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismos presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra de alimento debe ser rico en proteínas, carne por ejemplo de dudosa
procedencia, también puede ser tierra o lana, se procede a tomar la muestra en un
recipiente esterilizado o bolsa plástica de primer uso, una cantidad aproximada de
100 g. en caso de los alimentos se procede a llevarla inmediatamente al laboratorio
o colocarla en una caja de frio donde puede permanecer más tiempo (2-4 horas).

• Piel o pústulas, tejidos obtenida mediante un raspado o hisopado o biopsia. La

torunda se esteriliza en un sobre hecho de papel kraft y se mantiene ahí hasta la
toma de la muestra. Durante la toma de la muestra se procede a coger una torunda
o hisopo para pasarlo sobre la superficie de la piel o pústulas, colocar luego en un
tubo que contiene el medio de transporte.

2. Enriquecimiento:
• La muestra, si es alimento se pesa 10 g o 1 g y se coloca en 90 mL 0 9 mL de caldo
nutritivo, BHI o tripticasa soya durante algunas horas para su recuperación,
adaptación y desarrollo.

• En el caso del hisopado o raspado, el hisopo se coloca en el mismo caldo de

enriquecimiento.

3. Cultivos:
Luego de la recuperación se procede a la siembra en los medios de cultivos sólidos indicados
para el aislamiento respectivo de las colonias.

4. Estudio morfológico de las colonias

5. Coloración Gram

6. Resiembras

7. Pruebas de Identificación bioquímica

8. Toxinas

9. Elaboración de esquemas para la identificación del género Clostridium (tipo de espora,

reacciones bioquímicas).

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Clasificación científica
Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Clostridia
Orden: Clostridiales
Familia: Clostridiaceae
Género: Clostridium

Especies
Clostridium acetobutylicum
Clostridium aerotolerans
Clostridium botulinum
Clostridium butyricum
Clostridium colicanis
Clostridium difficile
Clostridium formicaceticum
Clostridium ljungdahlii
Clostridium laramie
Clostridium novyi
Clostridium perfringens
Clostridium piliforme
Clostridium sordellii
Clostridium sporogenes
Clostridium tetani
Clostridium tyrobutyricum

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Práctica N° 06
Bacterias Äcido Lácticas (BAL)

Introducción:
Las bacterias de las fermentaciones alimentarias son Gram positivas, presentan forma de cocos y/o
bastoncitos, son catalasa negativas (-), sintetizan su ATP de la fermentación láctica de los glúcidos, el
ácido láctico es el único producto final que producen (homofermentativos) y en otras ocasiones
pueden producir etanol, CO2 y acetato (heterofermentativos). Las bacterias lácticas son
generalmente aerotolerantes, existiendo anaerobias estrictas como las que se encuentran en el
intestino de los animales. Incluso en presencia de oxígeno no son capaces de llevar a cabo las
fosforilaciones oxidativas, lo que esta muy relacionado con su incapacidad para sintetizar citocromos
y enzimas del grupo hemo. Sin embargo, gracias a las flavoproteínas, oxidasas o peroxidasas, pueden
realizar limitadas oxidaciones no fosforilantes.

En 1920, Orla – Jensen, clasifico las bacterias lácticas en dos grupos según sus características
bioquímicas: Las homofermentativas y las heterofermentativas.
Las bacterias heterofermentativas no tienen fructuosa-difosfato-aldolasa y por lo tanto, degradan
los glúcidos por la vía denominada pentosas fosfatos o hexosas fosfatos.
La vía homofermentativa sintetizan dos moléculas de ATP por cada molécula de glucosa, mientras
que por la vía heterofermentativa solo se sintetiza una molécula de ATP.
Algunas especies de Lactobacillus también pueden obtener ATP por fermentación de la arginina.
Muchos Lactobacillus homofermentativos, además de producir ácido láctico también pueden
sintetizar formato, etanol y acetato en condiciones determinadas, debido a que el piruvato formado
se transforma en acetil CoA.

CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS

Las interacciones establecidas entre las bacterias lácticas y los alimentos llamaron la atención de los
científicos como de Louis Pasteur quien en 1857 demostró que los procesos fermentativos iban
acompañados invariablemente del desarrollo de microorganismos y que cada tipo de fermentación
estaba asociado a un tipo específico de microorganismo. Posteriormente, Lister, en 1873 aisló el
primer cultivo puro de un microorganismos al cual denomino Bacterium lactis. En 1884, Hueppe
describió por primera vez la microflora responsable de la acidificación y coagulación de la leche
denominándola “Milchsauerbacillus”, y Weigmamn en 1899 propuso el termino “Bacterium
acidilactici” para estos microorganismos.
A principios del siglo XX el empleo de lactobacilos en la alimentación humana cobro un enorme
interés, a raíz de la propuesta realizadas por Elie Metchnikoff del Instituto Louis Pasteur de Paris de
promover su utilización en la dieta como un agente bacterioprofiláctico y bacterioterapéutico (Bibel,
1988).

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El habitad natural de las bacterias lácticas son los vegetales, que por un proceso de adaptación han
ido colonizando otros sustratos que reúnen las condiciones necesarias para su desarrollo. Algunas
bacterias lácticas bien en asociación con los vegetales y desarrollan a expensas de los nutrientes
liberados tras la muerte y descomposición de los tejidos vegetales, también se encuentran en los
encurtidos, la col ácida, el pienso, los productos de panadería, la cerveza, el vino y los zumos de
frutas. Otro nicho ecológico es la leche a la que llegan a través del cuerpo de la vaca, el estiércol y los
vegetales, por eso que se encuentran íntimamente relacionados con diversos productos lácteos
fermentados. Otro grupo de bacterias lácticas se encuentra formando parte de la flora bacteriana
normal del cuerpo del animal y también en el tracto gastrointestinal y mucosas, por lo que se
encuentra asociado a la carne y productos cárnicos. Finalmente, algunas otras bacterias lácticas han
sido aisladas a partir del pescado, del estiércol y aguas residuales.

En la edición de Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology” (1986), las bacterias gram positivas, de
forma cocoide o bacilar, no esporuladas, anaerobias facultativas, catalasa negativa y productoras de
acido láctico tras la fermentación de la glucosa se clasificaron en los géneros: Lactobacillus,
Erysipelotrhrix, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Aerococcus y Gemella.

GÉNERO LACTOBACILLUS
El género Lactobacillus (Kandler y Weiss, 1986) incluían 45 especies dividida en tres grupos
dependiendo de la presencia o ausencia de la fructosa 1,6-difosfato aldolasa y fosfocetolasa,
enzimas claves del proceso homofermentativos y heterofermentativo de los carbohidratos
respectivamente.

Los Lactobacillus se caracterizan por ser células en forma de bastoncillos agrupadas en cadena,
presentan una exigencia de nutrientes en los factores de crecimiento, una acidificación de la leche
más lenta que en el caso de los estreptococos, pero generalmente más intensa gracias a una mejor
resistencia a los pHs ácidos (hasta pH 3.5) y a una producción más elevada de ácido láctico con un
máximo de 27 g/litro.

Las especies del género Lactobacillus se caracterizan por la heterogeneidad de la composición de su

ADN, el porcentaje (%) de su GC varia del 32 al 53% (Kandler y Weiss, 1986ª).

Este género clasificado originalmente por Orla – Jensen en 1919 en tres grupos:

1. Thermobacterium: homofermentativos y termófilos

2. Streptobacterium : homofermentativos y mesófilos
3. Betabacterium: heterofermentativo, ya sea mesófilo o termófilo

Los resultados de la taxonomía molecular, la determinación del tipo de PTG (peptidoglicano), las
propiedades de ciertas enzimas como la LDH (lactato deshidrogenasa), la determinación del isómero
del ácido láctico (Botazzi, 1988), el crecimiento del genoma y la hibridación ADN-ADN
(Sriranganathan et al., 1985), han permitido (Kandler y Weiss 1986b) dividir a los Lactobacillus en
tres grupos que cubre, bajo nuevas definiciones, los grupos de Orla – Jensen.

1. Grupo I: Lactobacillus homofermentativos obligatorios, que incluyen a las especies del grupo
Thermobacterium y otras especies nuevas descritas. Son incapaces de fermentar las pentosas y el
gluconato (Kandler y Weiss, 1986b).
Sus células son alargadas, rectas y a menudo en empalizada (Botazzi, 1988). Presenta dos conjuntos
de especies centrados principalmente en Lb. delbrueckii y Lb. acidophilus. Las subespecies de Lb.
delbrueckii poseen una homología de su ADN en más del 80% (Weiss et al., 1983). Lb. delbrueckii

T. Agurto – J.C. Ramos

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Subsp. Delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. Lactis, Lb. delbrueckii
subsp. Leichmanii. Estas bacterias producen hasta 18 g/litro de ácido láctico D (-).
Las especies de Lb. acidophilus es por el contrario muy heterogéneo, esta formado por tres
subgrupos caracterizados cada uno de ellos por las siguientes especies. Lb. acidophilus, Lb.
helveticus, Lb. gasseri. Lb. helveticus es considerada como una derivada de Lb. acidophilus por
adaptación al lactosuero ácido, se caracteriza por ser el productor más grande de ácido láctico DL
entre los Lactobacillus 27 g/litro (Kandler y Weiss, 1986b).

2. Grupo II: Lactobacillus homofermentativos facultativos, formado por el grupo

Streptobacterium y especies nuevas. La fermentación de las hexosas es homofermentativa, la de las
pentosas y el gluconato es heterofermentativa con producción de ácido láctico y acético (Kandler y
Weiss, 1986b).
Sus células son cortas, a menudo ordenadas en filamentos (Botazzi, 1988). Grupo muy heterogéneo
formado por tres conjuntos de especies centradas en Lb. plantarum, Lb. casei, y el grupo de Lb. sake
– Lb. curvatus – Lb. bavaricus. Se caracterizan por producir poco ácido láctico entre 3 a 13 g/litro de
la forma L (+) o DL según la especie. Lb. plantarum es una especie gigante formada por cepas de
homología variable con la cepa tipo.
El conjunto de Lb. casei contiene tres genotipos: la cepa tipo, un grupo de tres sub-especies Lb. casei
subsp. Casei, Lb. casei subsp. Pseudoplantarum y Lb. casei subsp. tolerans y el tercer grupo
constituido por Lb. casei subsp. rhamnosus.

3. Grupo III: Lactobacillus heterofermentativos obligatorios, se incluyen a los del grupo

Betabacterium. Como producto de la fermentación de las hexosas se obtiene ácido láctico, acético,
(o etanol) y CO2 en una relación 1:1:1; la de las pentosas, ácido láctico y acético (Kandler y Weiss,
1986b).
Sus células son cortas, rectas y separadas (Botazzi, 1988). Incluyen especies muy diversas que
poseen, a pesar de tener a veces un % de GC muy cercano, poca homología entre ellas, su
producción de ácido es débil, 5 g/litro, y el ácido láctico producido es de la forma DL.
Las especies más destacables son Lb. sóme, Lb. buchneri y Lb. reuteri; Lb. fermentum; Lb. brevis; Lb.
bifermentans, capaz de producir hidrógeno gracias a un formiato hidrogeno liasa.

GÉNERO ERYSIPELOTHRIX
El genero Erysipelothrix (Jones, 1986) era mono especifico

GÉNERO ESTREPTOCOCCUS
El genero Streptococcus (Hardie, 1986; Mundt, 1986) engloba a un total de 30 especies distribuidas
en 6 grupos: estreptococos piógenos, estreptococos orales, estreptococos anaeróbicos,
estreptococos lácticos, otros estreptococos y enterococos.

GÉNERO PEDIOCOCCUS y LEUCONOSTOC

El genero Pediococcus y Leuconostoc (Garvier, 1986) comprendías un total de 8 y 4 especies
respectivamente.

GÉNERO AEROCOCCUS
El genero Aerococcus (Evans, 1986) era mono específico.

GÉNERO GEMELLA
El genero Gemella (Reyn, 1986) era mono especifico.

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Pero con los últimos avances en el desarrollo y la utilización de técnicas bioquímicas y moleculares
como la determinación de la composición de las bases nitrogenadas adenina y guanina del ADN
(mol%GC), la hibridación química de los ácidos nucleicos (ADN:ADN – ADN:ARN) y su
secuenciación han producido cambios en la taxonomía de las bacterias lácticas, la mayoría de los
cuales aparecen en la 9na edición del “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology” (Holt et
al.,1994).

Refiriéndonos a la secuenciación de ARNr 16s y ha estudios de hibridación ADN:ARNr (Garvier y

Farrow, 1981; Kilpper – Balz y Schleifer, 1981; Schleifer et.al, 1985) el género Streptococcus se ha
dividido en tres grupos filogenéticamente distintos:

• Streptococcus sensu estrictos

• Enterococcus
• Lactococcus

El género Streptococcus sensu estrictos comprende a la mayoría de Streptococcus incluidos en la

ultima edición de “Bergey’s Manual” (1986) en los grupos piógenos, orales y “otros” estreptococos,
así como a las diversas especies de identificación reciente y quedan excluidos del género los
Streptococcus anaeróbicos (Schleifer y Kilpper – Balz, 1987). De los Streptococcus la especie útil en
la industria de los alimentos es Streptococcus termophilus que junto a Lactobacillus delbrueckii
subespecie bulgaricus, se utilizan para la elaboración del yogurt y algunas variedades de queso.

El género Lactococcus (Schleifer et.al, 1985) alberga a los Streptococcus lácticos o del grupo N de
Lancefield (Jones, 1978), representada por Lactococcus lactis subespecie lactis, ahora Lactococcus
lactis (incluye a las especies anteriormente denominadas S. lactis subespecie lactis, S. lactis
subespecie diacetylactis y Lb. Xilosus) y Lactococcus lactis subespecie cremoris ahora Lactococcus
cremoris. Además están presentes lactococcus lactis subespecie hordniae (anteriormente Lb.
hordniae) ahora denominada Lactococcus hordniae; a Lactococcus raffinolactis (anteriormente S.
raffinolactis), Lactococcus garviae, Lactococcus plantarum y Lactococcus piscium de reciente
identificación (Williams et. Al, 1990).

El género Enterococcus se encuentra formado por los anteriormente denominados Streptococcus

fecalis o del grupo D de Lancefield (Jone, 1987) con excepción de Streptococcus bovis y
Streptococcus equinus junto a otras especies de reciente identificación.
Cabe señalar que los Streptococcus del grupo N de Lancefield, incluidas previamente en el género
Lactococcus, has pasado a formar parte del género Vagococcus con la especie Vagococcus fluviales
como cepa tipo (Collins et. al 1989ª). Posteriormente algunos lactobacilos atípicos aislados del
salmón se han identificado como Vagococcus salmoninarum (Walbanks et.al, 1990).

Respecto al género Lactobacillus, las especies Lb. piscícola, Lb. divergens y Lb. carnis, anteriormente
clasificadas en el grupo III, han pasado a constituir el género Carnobacterium, que actualmente
comprende también las nuevas especies Carnobacterium gallinarum, C. mobile, C. funditum, C.
alterfunditum (Collins et al., 1987ª; Walbanks et al., 1990), Collins et al., 1991 sugiere el nombre C.
maltaromicus (antiguamente Lb. maltaromicus) como sinónimo de C. piscícola.

En relación al género Pediococcus, la especies P. urinaeequi se ha transferido al género Aerococcus

(A. urinaeequi) y la especie P. halophilus ha pasado a constituir el nuevo género denominado
Tetragenococcus (T. halophilus), de este modo el género Pediococcus queda finalmente constituido
por los siguientes géneros: P. acidilactici, P. pentosaceus, P. dammnosus, P. dextranicus, P.
inopinatus y P. parvulus.
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Finalmente, el género Leuconostoc esta constituido por 4 especies que se incluyen en la ultima
edición del “Bergey’s Manual of Systematic bacteriology” (1986) (Lc. mesenteroides, Lc.
lactis, Lc. paramesenteroide y Lc. oenos) y por 6 especies de reciente identificación: Lc. gelidum, Lc.
carnosus, Lc. amelobiosum, Lc. citreum, Lc. pseudomesenteroides y Lc. fallax (Martínez – Murcia et
al., 1991ª; Pot et al., 1994b).

Considerando como características finales de las bacterias lácticas su carácter Gram positivo, no
esporulados, microaerofilos o anaerobios facultativos, catalasa y oxidasa negativos y su capacidad de
producir acido láctico como producto final y mayoritario derivado de la fermentación de los azúcares
y su estrecha relación con los alimentos se consideran que el grupo de las bacterias lácticas esta
constituido por los siguientes géneros:
• Lactobacillus
• Carnobacterium
• Streptococcus
• Lactococcus
• Vagococcus
• Enterococcus
• Leuconostoc
• Pediococcus
• Tetragenococcus

Respecto al metabolismo de los carbohidratos las bacterias lácticas se agrupan en tres categorías
(Axelsson, 1993) que son:

• Homofermentativas obligadas
• Heterofermentativas obligadas
• Heterofermentativas facultativas

Las bacterias lácticas homofermentativas obligadas (Lactobacillus del grupo I) oxidan la glucosa y
otras hexosas hasta acido láctico a través de vía fermentativa Embden-Meyerhof-Parnas, mediante
la participación de la enzima denominada fructosa 1,6-difosfato aldolasa. Estas bacterias carecen de
las enzimas glucosa 6-fosfato deshidrogenada y 6-fosfogluconato deshidrogenasa debido a ello no
son capaces de fermentar las pentosas ni el gluconato.

Las bacterias lácticas heterofermentativas obligadas (Leuconostoc y Lactobacillus del grupo III)
degradan la glucosa y otras hexosas hasta acido láctico, dióxido de carbono, acido acético o etanol y
las pentosas hasta acido láctico y acido acético, a través de la ruta metabólica de las pentosas
fosfato con la participación de la enzima fosfocetolasa. Estas bacterias lácticas carecen de la enzima
fructosa 1,6-difosfato aldolasa.

El resto de las bacterias lácticas (Lactobacillus del grupo II, Carnobacterium, Lactococcus,
Vagococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus y Tetragenococcus) fermentan las hexosas
casi exclusivamente hasta ácido láctico por la vía Embden –Meyerhoff – Parnas (igual que las
bacterias lácticas homofermentativas obligadas), pero algunos microorganismos a pesar de no
presentar la enzima fosfocetolasa, en condiciones limitantes de carbohidratos y anaerobiosis
producen además acido fórmico, acido acético y etanol (Cogan et al., 1989). En lo que respecta la
utilización de las pentosas, la mayoría de estos microorganismos son capaces de fermentarla por la
acción de la fosfocetolasa inducible, produciendo cantidades equivalentes de acido láctico y acido
acético (Kandler, 1983).

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De otro lado las bacterias lácticas también pueden utilizar a los disacáridos como la lactosa y
sacarosa. Estos disacáridos ingresan a la célula mediante un sistema de permeasa dependiente del
ATP o del sistema fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato (Sistema PEP – PTS) y son
desdoblados hasta sus monosacáridos correspondientes los cuales son utilizados mediante el
proceso fermentativo para producir ácido láctico y otros metabolitos (Kandler, 1983).

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DIFERENCIAS ENTRE GÉNERO Y ESPECIE EN LAS BACTERIAS LÁCTICAS

Basándonos en la forma de las células bacterianas, las bacterias lácticas se dividen en:

• Bacilos: Lactobacilllus y Carnobacterium

• Cocos: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus
y tetragenococcus. Donde Pediococcus y tetragenococcus son tétradas.

El crecimiento a 10°C y 45°C es una característica importante para diferenciar algunas de las
bacterias lácticas de forma cocoide. Los Enterococcus crecen a 10°C y 45°C, los Lactococcus y los
Vagococcus crecen a 10°C pero no crecen a 45°C, y los Streptococcus no crecen a 10°C solo algunas
especies los hacen a 45°C.

Otra diferencia es su capacidad de desarrollar en presencia de cloruro de sodio 6,5%, esta

concentración permite diferenciar el genero Enterococcus de los géneros Lactococcus, Vagococcus y
Streptococcus (algunas especies de Streptococcus dan respuesta variable). El género
Tetragenococcus es halotolerante siendo capas de desarrollar en 18% de NaCl.

Una característica más de diferenciación es su tolerancia a los valores de pH entre 4,4 y 9,6. Los
Enterococcus son los únicos capaces de crecer a pH 4,4 y pH 9,6. Los Streptococcus no desarrollan en
ninguno de los dos rangos de pH. Los Lactococcus y Vagococcus no desarrollan a pH 9,6, solo algunas
especies los hacen a pH 4,4.

Otra característica que permite diferenciar a las bacterias lácticas es su capacidad fermentativa de
los carbohidratos, en condiciones estándar (concentración no limitada de carbohidrato y factores de
crecimiento y disponibilidad de oxígeno) las bacterias lácticas homofermentativas producen como
producto final del proceso fermentativo acido láctico y las bacterias lácticas heterofermentativas
producen como productos finales del proceso fermentativo cantidades equivalentes de acido láctico,
acido acético, etanol y dióxido de carbono (Sharpe, 1979), la detección del CO 2 a partir de la glucosa
es una prueba rápida para determinar el tipo de metabolismo fermentativo del azúcar.

Las especies del género Leuconostoc y algunos lactobacilos son heterofermentativos estrictos, las
demás bacterias lácticas son homofermentativas. Las bacterias lácticas se diferencian por el tipo de
acido láctico que sintetizan (D-acido láctico y L-acido láctico), lo que esta determinado por la
estereoespecificidad de las enzimas lactato deshidrogenasa NAD + dependientes, L-lactato
deshidrogenasa (L-LDH) y D-lactato deshidrogenasa (D-LDH) que llevan a cabo la reducción del
piruvato.

OTRAS PRUEBAS Y TÉCNICAS QUE PERMITE LA DIFERENCIACIÓN ENTRE LAS BACTERIAS LÁCTICAS.
1. Determinación de la fermentación de carbohidratos
2. Hidrólisis de la arginina
3. Prueba de VP (Voges-proskauer) o producción de acetoína
4. Tolerancia a la bilis
5. Tipo de hemolisis
6. Requerimiento de factores de crecimiento
7. Producción de exopolisacáridos
8. Características de desarrollo en agar leche
9. Pruebas moleculares

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EL ÁCIDO LÁCTICO
El ácido láctico fue descubierto en 1780 por Scheele como causante de la acidificación y
consiguiente cortado de la leche. No fue sino hasta mediados del siglo XIX que Louis Pauster
demostró que el ácido láctico es producido por microorganismos presentes en la leche. La
elaboración del ácido láctico en 1880 fue la primera producción de un ácido orgánico de origen
microbiano. (Crueger y Crueger, 1984).

El ácido láctico es el resultado final del metabolismo anaeróbico, principalmente de ciertas bacterias
denominadas bacterias lácticas (LAB). El ácido láctico es utilizado en una amplia variedad de
productos como alimentos fermentados y bebidas. Durante la vitinificación el ácido láctico aparece
de manera natural como el resultado de la fermentación maloláctica por lo que es usado para
ajustar los ácidos en vinos.

La fermentación del ácido láctico es sencilla. La etapa limitante y costosa en su producción es la

recuperación del caldo fermentado y su posterior purificación para poder cumplir con las estrictas
normas de calidad en los usos alimentarios. Así mismo, el alto poder corrosivo de las soluciones de
ácido láctico obliga al empleo de materiales especiales o acero inoxidable recubierto y por
consiguiente costoso.
El uso de compuestos acidificantes en la conservación y mejora de las propiedades organolépticas en
los alimentos es extensa. Estos ácidos genéricamente denominados ácidos orgánicos, son
intermediarios o productos finales de ciclos metabólicos básicos lo cual ocurre en una gran variedad
de organismos vivos. Tales compuestos incluyen a los ácidos: cítrico, málico, láctico, acético y
fumárico.

La incorporación de ácidos o sus sales en los alimentos cumple diversas funciones dentro de las
cuales cabe destacar el gran poder acidificante, la capacidad amortiguadora o reguladora del pH,
emulsificante, y sus efectos organolépticos. El principal uso es su capacidad de acidificación y control
del pH en el producto final; un pH bajo retarda y/o elimina el crecimiento de microorganismos
indeseables en los productos alimenticios. Asimismo reduce la necesidad de tratamientos térmicos
drásticos durante la esterilización por ejemplo de frutas y verduras enlatadas.

BIOQUÍMICA DEL ÁCIDO LACTICO

Todas las BAL son sacarolíticas y deficientes en malas rutas biosintéticas. En consecuencia presentan
requerimientos nutricionales complejos que obligan a restringirse a medios altamente ricos en
nutrientes como por ejemplo el tracto intestinal y la leche.
Estas bacterias son anaeróbicas pero esencialmente aerotolerantes. Existen tres rutas metabólicas
de degradación de carbohidratos hasta ácido láctico.

1. Ruta homofermentativa, es la que genera ácido láctico como único producto al final de la
degradación de los carbohidratos, con un rendimiento neto de dos moles de ácido láctico por una de
glucosa, y es por consiguiente, la de interés en la producción.

2. Ruta heterofermentativa, es la que genera la producción de etanol y CO2 en cantidades

equimolares al ácido láctico sintetizado.

3. Ruta del Bifidum (Bifidobacterium bifidum), produce 1,5 moles de acetato y una de ácido láctico
por cada mol de glucosa degradada.

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GLUCÓLISIS (FERMENTACIÓN)
La fermentación es una reacción de oxido-reducción interna equilibrada en la que algunos átomos
de la fuente de energía (donador de electrones) se reduce mientras otros se oxidan, y la energía se
produce por fosforilación del sustrato.
La glucólisis es una vía fermentativa también denominada Vía Embden-Meyerhof-Parnas. Esta se
divide en tres etapas principales las cuales son:

ETAPA I Y II: REACCIONES PRELIMINARES Y REACCIONES REDOX

Durante la etapa I, la glucosa es fosforilada por el ATP dando lugar a la formación de glucosa-6-
fosfato, que luego es convertida a una forma isomérica, la fructosa-6-fosfato, que mediante una
segunda fosforilación es convertida a fructosa-1,6-difosfato, que es un metabolito intermediario
clave en el proceso de la glucólisis. La enzima aldolasa cataliza la ruptura de la fructosa-1,6-difosfato
en dos moléculas de tres carbonos denominadas gliceraldehído-3-fosfato y su isómero
dihidroxiacetonafosfato. Durante esta etapa no ha ocurrido ninguna reacción redox, el consumo de
ATP tiene lugar sin la transferencia de electrones.
Recién en la segunda etapa se produce la primera reacción redox durante la conversión del
gliceraldehído-3-fosfato a ácido 1,3-difosfoglicérico, que ocurre dos veces por cada molécula de
gliceraldehído-3-fosfato, una enzima cuya coenzima es NAD+ acepta dos átomos de hidrógeno y el
NAD + se convierte en NADH; esta transformación es catalizada por una enzima denominada
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Simultáneamente, cada molécula de gliceraldehido-3-
fosfato es fosforilada por adición de una molécula de fosfato inorgánico. Esta reacción, en la que el
fosfato inorgánico se convierte en orgánico, prepara el escenario para la conversión de la energía
por fosforilación a nivel del sustrato, la formación del ATP es posible porque cada uno de los fosfatos
de la molécula de ácido 1,3-difosfoglicérico presenta un enlace de alta energía. La síntesis del ATP
tiene lugar cuando cada molécula de ácido 1,3-difosfoglicérico se convierte en ácido 1,3-
fosfoglicérico y cuando mas tarde en la vía, cada molécula de fosfoenolpiruvato se convierte en
piruvato.

ETAPA III: PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS DE FERMETACIÓN

Durante la formación de dos moléculas de ácido 1,3-difosfoglicérico, se reducen dos moléculas de
NAD+ a NADH. Sin embargo, las células contienen solo una pequeña cantidad de NAD +, y si todo se
convirtiera en NADH se detendría la oxidación de la glucosa. La oxidación continua del
gliceraldehído-3-fosfato solo puede proseguir si está presente una molécula de NAD + para aceptar
los electrones liberados. Este “bloqueo” se supera en la fermentación mediante la nueva oxidación
de NADH a NAD+, a través de reacciones que supone la reducción del piruvato a una extensa
variedad de productos de fermentación. En el caso de las levaduras, el piruvato se reduce a etanol y
se libera CO2. En las bacterias ácido lácticas (LAB) el piruvato de reduce a lactato.

Durante cualquier proceso que produzca energía, la oxidación debe acompañarse de una reducción
y debe haber un aceptor de electrones por cada electrón cedido. En este caso, la reducción del
NAD+ en un paso enzimático de la glucólisis se equilibra con su oxidación en el otro paso. Los
productos finales también deben estar en equilibrio redox con el sustrato inicial, la glucosa. Es así
que los productos finales que se generan etanol más CO2 o lactato más protones, estén en equilibrio
atómico y electrónico con la glucosa inicial.
La glucólisis consume dos moléculas de ATP durante las dos fosforilaciones de la glucosa y se
sintetizan cuatro moléculas de ATP, dos por cada molécula de ácido 1,3-difosfoglicérico convertida a
piruvato, por tanto, la ganancia neta del organismo es de dos moléculas de ATP por cada molécula
de glucosa fermentada.

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Objetivos:
❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos específicos de Lactobacillus, Lactococcus
y Enterococcus.

❖ Interpretar las características bioquímicas o metabólicas de Lactobacillus, Lactococcus y

Enterococcus.

Material y Procedimiento

Material
Material biológico:
• La muestra es generalmente alimento: leche, queso fresco, yogurt natural, encurtidos,
vegetales en descomposición, etc.

Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlermeyer 500 mL.
• Probeta 100 mL.
• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

Medios de cultivo y reactivos

• Agar nutritivo
• Agar sangre
• Agar leche
• Agar MRS Rogosa
• Caldo MRS Rogosa
• Caldo nutritivo
• Caldo glucosado 2%
• Cloruro de sodio
• Hidróxido de sodio
• Azul de metileno
• Bilis
• Glucosa

Otros materiales:
• Asa de siembra
• Utensilios estériles (cuchillo, tijera, pinza, espátula)
• Papel de manteca u otro
• Pabilo
• Plumón indeleble
• Papel kraft

Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Licuadora

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• Balanza
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

Procedimiento

La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de

cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismo presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra de alimento (leche, queso fresco, yogurt, vegetales en descomposición,
etc.) se procede a tomar la muestra en un recipiente esterilizado o bolsa plástica de
primer uso, una cantidad aproximada de 100 g. y se procede a llevarla
inmediatamente al laboratorio o colocarla en una caja de frio donde puede
permanecer más tiempo (2-4 horas).

2. Enriquecimiento y Homogenizado de la muestra:

• La muestra, si es alimento se pesa 10g o 1g y se coloca en 90mL 0 9mL de caldo
nutritivo, agua peptonada o caldo MRS Rogosa para su homogenizado y
recuperación de las células bacterianas.

3. Cultivos:
• Luego de la recuperación y homogenizado se procede a la siembra en los medios de
cultivos sólidos indicados para el aislamiento respectivo de las colonias.

4. Estudio morfológico de las colonias

5. Coloración Gram

6. Resiembra

7. Pruebas bioquímicas

8. Cepario

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Clasificación científica

Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Lactobacillales
Familia: Lactobacillaceae
Género: Lactobacillus

Especies
L. acidophilus
L. bulgaricus
L. casei
L. delbrueckii
L. fermentum
L. plantarum
L. reuteri

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Práctica N° 07
Enterobacteriaceae

Introducción:
Las enterobacterias son bacilos Gram negativos, no forman esporas, inmóviles o móviles con flagelos
peritrícos, anaerobios facultativos, tienen la capacidad de fermentar la glucosa hasta ácidos con o sin
producción de dióxido de carbono (CO2), reducen los nitratos a nitritos, son citocromo oxidasa
negativos y toleran la bilis y algunos colorantes.
Las enterobacterias viven en el tracto digestivo a nivel del intestino grueso de diversos animales
especialmente los mamíferos, muchas de ellas patógenas a nivel intestinal, potencialmente
patógenas si pasan a la vía urinaria y a nivel respiratorio como en el caso de Serratia y Klebsiella que
causan males respiratorios.

La presencia de Escherichia coli es un indicador de contaminación fecal

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Objetivos:

❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos específicos de las principales

enterobacterias causantes de enfermedades E. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter,
Enterobacter, Proteus, Serratia y Klebsiella.

❖ Interpretar las características bioquímicas o metabólicas de las principales enterobacterias

causantes de enfermedades E. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Enterobacter, Proteus,
Serratia y Klebsiella.

Material y Procedimiento

Material

Material biológico:
• La muestra es generalmente alimento de dudosa procedencia, diversos tipos de aguas,
orina, heces, esputo, etc.

Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlermeyer 500 mL.
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• Probeta 100 mL.

• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

Medios de cultivo y reactivos

• Agar nutritivo
• Agar Mc Conkey
• Agar Endo
• Agar XLD
• Agar Desoxicolato citrato
• Agar SS
• Agar EMB
• Agar Selenito Bismuto
• Agar Verde Brillante
• Caldo nutritivo
• Agar TSI
• Agar LIA
• Agar Citrato
• Medio SIM
• Agar Urea
• Caldo MR-VP
• Cloruro de sodio
• Glucosa
• Rojo de metilo
• Hidróxido de potasio
• Solución de Alfa-naftol

Otros materiales:
• Asa de siembra
• Utensilios estériles (cuchillo, tijera, pinza, espátula)
• Papel de manteca u otro
• Pabilo
• Plumón indeleble
• Papel kraft

Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Licuadora
• Balanza
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

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Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismos presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra de alimento (leche, queso fresco, comida preparada, agua etc.) se
procede a tomar la muestra en un recipiente esterilizado o bolsa plástica de primer
uso, una cantidad aproximada de 100 g. y se procede a llevarla inmediatamente al
laboratorio o colocarla en una caja de frio donde puede permanecer más tiempo (2-
4 horas).

• La muestra puede ser de diferentes partes del cuerpo del hombre: sangre, orina,
esputo, heces, liquido cefalorraquídeo, etc. estos son colectados de la siguiente
manera:

Muestra de Sangre:
Las muestras son colectadas ante de la terapia con antibióticos, la cantidad
adecuada es de 5 a 30mL en condiciones de esterilidad. La piel en la zona a realizar
la punción debe ser desinfectada con alcohol al 70% mas yodo al 2%, de igual modo
los dedos del colector. Se utiliza una aguja número 21 por 1”. Se realiza la punción
de manera precisa y se tira lentamente del embolo para aspirar la sangre. Se retira la
aguja y se coloca un pedazo de algodón en la zona de la punción. Obtenida la
muestra se procede de forma inmediata a colocarla en el medio de cultivo siempre
al lado del mechero. Si la muestra tiene que ser transportada se vierte su contenido
a un frasco estéril conteniendo polianetolsulfonatosodico (PSS) al 0.0025% o 0.05%
sustancia que actúa sobre el complemento y como antifagocitico.

Muestra orina:
Se lava la zona genital con jabón y se enjuaga con solución salina estéril, no secar, la
muestra es obtenida por micción voluntaria descartando la primera y la ultimas
porciones de orina se colecta en frasco de boca ancha estéril. Las muertas tienen
que ser procesadas de forma inmediata o ser refrigeradas a 4°C por 24 horas.

Muestra de heces:
Las muertas son colectadas en frasco de boca ancha descartables, una cantidad
aproximada de 1 a 5 gramos, en caso de niños o lactantes se procede a realizar un
hisopado, donde el hisopo es humedecido en una solución salina estéril y se procede
a realizar el frotis rectal.
Si la muestra tiene que transportarse se coloca el hisopado en un medio de
transporte (Medio Stuard).

Muestra de esputo:
La muestra se obtiene por expectoración voluntaria permitiendo que la muestra
proceda de la parte inferior de las vías respiratorias. Para la recolección se emplea
frasco de boca ancha estéril. Si es necesario trasportarlo ira en un medio de
transporte.

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2. Enriquecimiento y Homogenizado de la muestra (alimento):

• La muestra, si es alimento se pesa 10g o 25g y se coloca en 90mL o 225mL de caldo
nutritivo, agua peptonada para su homogenizado y recuperación de las células
bacterianas.

3. Cultivos:
• Luego de la recuperación y homogenizado se procede a la siembra en los medios de
cultivos sólidos indicados para el aislamiento respectivo de las colonias.

4. Estudio morfológico de las colonias

5. Coloración Gram

6. Resiembra

7. Pruebas bioquímicas

8. Cepario

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CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DEL DESARROLLO DE LAS COLONIAS EN LOS MEDIOS

DE CULTIVO SELECTIVOS

AGAR EOSINA - AZUL DE METILENO - LACTOSA (EMB) DE LEVINE

(Selective agar proposed by HOLT-HARRIS and TEAGUE (1916) for the detection and isolation of
pathogenic Enterobacteriaceae).
Fundamento
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos gramnegativos de la familia
Enterobacteriaceae. Este medio de cultivo combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de
Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras
especies de bacilos gramnegativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa
y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de
metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias grampositivas.
La lactosa y la sacarosa contenidas en este medio permiten distinguir entre las Salmonella y las
Shigella negativos a la lactosa y sacarosa de los organismos coliformes positivos a la lactosa y
negativos a la lactosa, que acompañan a la flora (por ejemplo Proteus vulgaris, Citrobacter,
Aeromonas hydrophila). El crecimiento de microorganismos indeseables de acompañamiento,
particularmente las bacterias Grampositivas, se inhiben en gran parte por los colorantes presentes
en el medio.

Lectura Y Resultados

Bacterias Característica de la colonia

Salmonella, Shigella Transparentes, ámbar rosado

Escherichia coli Brillo verdoso, metálico en luz reflejada, centro azul-negro en

luz transmitida
Enterobacter, Klebsiella y Las colonias son más grandes que las de E. coli, mucoide,
otras centro gris-marrón en la luz transmitida

AGAR HEKTOEN ENTÉRICO

Fundamento
Las colonias positivas a la lactosa tienen un color claramente diferente de las colonias de lactosa
negativa debido a la presencia de los dos indicadores azul de bromotimol y fucsina ácida. Esta
diferencia de color también se observa en las colonias, que sólo pueden fermentar lentamente la
lactosa debido a la presencia de sacarosa y salicina. Estos compuestos reactivos pueden fermentarse
con mayor facilidad, por lo que se evitan los resultados patogénicos falsos positivos. La combinación
de tiosulfato como compuesto reactivo con una sal de hierro como indicador hace que las colonias
positivas para H2S se vuelvan de color negro. La mezcla de sales biliares suprime el crecimiento de la
mayoría de los microorganismos acompañantes.
HOBEN et al. (1973) recomendó la adición de 10-20 μg de novobiocina/mL al medio para mejorar su
selectividad, es decir, para inhibir las colonias de Citrobacter y Proteus que se asemejan a las de
Salmonella (centro negro).

Lectura y Resultados

Bacterias Característica de la colonia

Shigella, Providencia verdes, húmedas, planas, transparentes

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Salmonella, Proteus verde-azuladas, c/s centro negro

Pseudomonas verde-azuladas, planas, borde irregular

Coliformes salmón, halo de precipitación

AGAR MacCONKEY
(Selective agar for the isolation of Salmonella, Shigella and coliform bacteria from faeces, urine,
foodstuffs, waste wáter etc. according to MacCONKEY (1950).
Fundamento
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos gramnegativos de fácil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no lactosa en muestras clínicas,
de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano,
la lactosa es el carbohidrato fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los
agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora grampositiva.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del
color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales
biliares. Las bacterias no fermentadoras de lactosa producen colonias incoloras.

Lectura y Resultados

Bacterias Característica de la colonia

Salmonella, Shigella, Proteus incoloras, medio amarillo
otras

Escherichia coli rojas, halo turbio

Enterobacter, Klebsiella grandes, rosadas a rojo, mucosas

Enterococcus, Staphylococcus Colonias muy pequeñas, opacas, aisladas.

y otros

AGAR SALMONELLA - SHIGELLA (SS)

For the isolation of salmonellae and shigellae from faeces, foodstuffs and other materials.
Fundamento
Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de Salmonella y de algunas
especies de Shigella a partir de muestras de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se
sospeche su presencia. La selectividad, está dada por las sales biliares, el verde brillante, y el citrato
de sodio que inhibe el desarrollo de bacterias grampositivas, de la mayoría de los coliformes y el
desarrollo invasor del Proteus. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación
de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de
lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo neutro el indicador de pH,
obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros
microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen
colonias transparentes.

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La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la
formación de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente
la muestra en caldo Selenito.

Lectura y Resultados

Bacterias Característica de la colonia

Shigella y algunas especies de Incoloras y transparentes
Salmonella

Proteus y otras Salmonellas Transparentes con centro negro

Escherichia coli rosadas a rojo

Enterobacter aerogenes Colonias mas grandes que E. coli, rosadas a crema, opacas,
mucosas.

AGAR BPL
(Brilliant-green Phenol-red Lactose Agar acc. to KAUFFMANN)
Selective agar proposed by KAUFFMANN (1935) for the identification and isolation of Salmonella
with the exception of S. typhi in faeces, urine, meat, milk and other materials.
Fundamento
Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella, excepto S. typhi y
S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No
se recomienda para el aislamiento de Shigella.
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente orgánica de
nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los carbohidratos fermentables, el rojo
fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la
fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante
actúa como agente selectivo inhibiendo el desarrollo de las bacterias Gram positivas.

Lectura y Resultados:
Las colonias de Salmonella se observan de color rosa, rojizo o blanquecino dependiendo del tiempo
de incubación con halo rojo alrededor. Toda la placa vira al color rojo.
Las colonias de E. Coli y otros coliformes se observan verde amarillentas con halo del mismo color y
todo el medio se torna siempre verde transparente

Bacterias Característica de la colonia

Salmonella a veces Proteus y rosa pálido, transparentes
Citrobacter
E. coli, Enterobacter Verde-amarillo
Klebsiella, opacas, halo verde-amarillo
Bacterias lactosa positiva

AGAR XLD (Agar Xilosa – lisina – Desoxicolato)

Fundamento
Medio de cultivo selectivo para el aislamiento de Enterobacterias principalmente Salmonella y
Shigella a partir de muestras biológicas o productos alimenticios.

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El Sodio Desoxicolato inhibe el crecimiento de la flora acompañante Gram positiva. La mayoría de las
Enterobacteriáceas patógenas, a excepción de la Shigella, fermentan la D-Xilosa. El ácido producto
de la fermentación de la D-Xilosa, de la lactosa o de sacarosa produce un viraje a amarillo del Rojo
de Fenol presente en el medio de cultivo. Los microorganismos que descarboxilan la lisina, como
Salmonella, se reconocen por presentar colonias de color rojo-anaranjadas debido al aumento del
pH que han provocado en el medio y el consecuente viraje del Rojo de Fenol a amarillo. Además por
la presencia de sodio tiosulfato y citrato de hierro amoniacal las bacterias productoras de hidrógeno
sulfurado dan colonias ennegrecidas siempre y cuando el pH del medio se mantenga elevado.

Lectura y Resultados
Las colonias de color rojo es típico de los géneros Shigella, Providencia y Salmonella hidróxido
sulfurado (SH2) positivo. Las colonias que tienen la capacidad metabólica de fermentar por lo menos
dos azúcares serán de color amarillo, es típico de los géneros Escherichia, Citrobacter, Serratia,
Proteus, Enterobacter y Klebsiella. Además formarán un precipitado de color negro típico los
siguientes géneros: Salmonella SH2 positivo, Arizona, Proteus, Citrobacter y Edwardsiella.

Bacterias Característica de la colonia

E. coli, Enterobacter amarilla, opacas, con precipitado
Aeromonas amarilla, opacas, con precipitado
Klebsiella amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado
Citrobacter amarilla, opacas, centro negro
Serratia, Hafnia amarilla, opacas
P. vulgaris, P. mirabilis amarilla, translúcidas, centro negro
Salmonella igual color del medio, centro negro
Shigella, Providencia igual color del medio, translúcidas
S. typhi amarilla, ligeramente opacas

AGAR VIOLETA ROJO NEUTRO Y BILIS CON LACTOSA

Fundamento
Medio de cultivo selectivo para la investigación presuntiva y recuento de coliformes en alimentos y
productos lácteos.
En este medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios
para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora
Gram positiva, la lactosa es el carbohidrato fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH.
Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y producen un viraje del
indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se observan como colonias de color rojo
púrpura, de 1 a 2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.

Lectura y Resultados
Las Enterobacterias fermentadoras de lactosa son colonias de color rojo de 1 a 2 mm de diámetro
con halo de precipitación rojizo. Las Enterobacterias no fermentadoras de lactosa son colonias
incoloras. Los Enterococcus son colonias rosadas puntiformes (como punta de alfiler).

AGAR ENDO
Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo para el aislamiento de E. Coli fecal y coliformes en el agua, leche u
otros materiales de importancia sanitaria. El sulfito de sodio y la fucsina básica inhiben el

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crecimiento de las bacterias Gram-positivas, al penetrar la membrana celular impidiendo el

desarrollo de dichos microorganismos.

Lectura y Resultados
El desarrollo de las colonias se manifiesta entre las 18 y 24 horas. Habiéndose sembrado las placas
por estría o por agotamiento.
Los microorganismos lactosa-positiva forman colonias de color rojo intenso, en el caso de la E. coli
con brillo metálico estable mientras que Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter y otros, no presentan
brillo y pueden variar su coloración desde rojo hasta rosa; presentando forma semiesférica.
Los microorganismos lactosa-negativo forman colonias incoloras.
E. coli y coliformes consumen lactosa formando aldehído y ácido. Por otra parte, el aldehído libera
Fucsina a partir de la combinación Fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloración roja de las colonias.
En el caso de la E.Coli, esta reacción es tan intensa que la Fucsina llega a cristalizarse y por este
motivo, confiere a dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo verde (típico de la Fucsina
cristalizada).
El crecimiento de la Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella y Proteus es muy
bueno; presentando colonias de color rojo con brillo metálico sólo las dos primeras.

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Clasificación científica

Reino: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gamma Proteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae

Géneros
Alishewanella Moellerella
Alterococcus Morganella
Aquamonas Obesumbacterium
Aranicola Pantoea
Arsenophonus Pectobacterium
Azotivirga Phlomobacter
Blochmannia Photorhabdus
Brenneria Plesiomonas
Buchnera Pragia
Budvicia Proteus
Buttiauxella Providencia
Cedecea Rahnella
Citrobacter Raoultella
Dickeya Salmonella
Edwardsiella Samsonia
Enterobacter Serratia
Erwinia Shigella
Escherichia Sodalis
Ewingella Tatumella
Grimontella Trabulsiella
Hafnia Wigglesworthia
Klebsiella Xenorhabdus
Kluyvera Yersinia
Leclercia Yokenella
Leminorella

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Práctica N° 08
Vibrionaceae: Vibrio

Introducción:
El cólera, causado por Vibrio cholerae es una enfermedad no contagiosa, pero puede causar grandes
epidemias con una elevada mortalidad. La mayoría de los brotes en el siglo XX se registraron en los
países asiáticos. En 1991 y 1992, una gran epidemia de cólera que comenzó en Perú se extendió a
muchos países de América del Sur y afectó a 640.000 personas, con 5.600 muertes. Las cepas no 01
que anteriormente se consideraban incapaces de causar grandes epidemias, fueron en 1992, un
serotipo no 01 y no 0139, que participó en las grandes epidemias en Bangladesh y la India.

Vibrio cholerae es el causante del cólera, una enfermedad epidémica. Este agente causal no
pertenece al grupo de las Enterobacteriaceas, pero desde el punto de vista metabólico y fisiológico
es muy próximo. Vibrio cholerae se reproduce en el intestino. Se fija sobre el epitelio intestinal, pero
no penetra en las células. La enterotoxina del cólera es una proteína, que se fija a las células del
epitelio intestinal (unos receptores específicos) y que determina la salida de iones sodio,
bicarbonato y cloruro, así como de agua a la luz intestinal.

Vibrio cholerae, al igual que otros vibrios, es un bacilo curvo, móvil, oxidasa positiva, fermentadores
de sacarosa y glucosa, no productoras de gas, crecimiento en caldo nutritivo con cloruro de sodio 1%
pero no al 6,5% y Gramnegativo. La especie tiene muchos serogrupos. Las cepas O1 y O139 se
asocian con la epidemia de cólera. El serotipo 01 se caracteriza además por biotipo y serotipo. El tipo
actualmente asociado con epidemias de cólera en todo el mundo es del biotipo El Tor. El serotipo O1
se clasifica en Inaba, Ogawa, y Hikojima. El serotipo O1 no tiene cápsula mientras que 0139 lleva una
cápsula. El serotipo no 01 no se aglutinan con anticuerpos preparados contra O1 antígenos. Además,
los serotipos no 01 incluidos, similares a los serotipos O1, no son sensibles a trimetoprim-
sulfametoxazol con furazolidona. Ambos tipos son sensibles al calor y se matan por la temperatura
utilizada para cocinar. La temperatura inadecuada (a temperatura más baja durante un tiempo más
corto) puede no ser capaz de matar todas las células presentes en un alimento. La temperatura
óptima de crecimiento es de entre 30 y 37°C. La tasa de crecimiento es muy rápida, incluso a
temperatura ambiente. Las células no se multiplican en cangrejos, ostras o pescado contaminado
vivo. Sin embargo, en pescados y mariscos cocidos, el rápido crecimiento puede ocurrir entre 25-
35°C. Los alimentos alcalinos facilitan un rápido crecimiento. La supervivencia de las células es mejor
en los alimentos cocinados entre 5-10°C.

El cólera es una enfermedad humana. La enfermedad resulta de la ingestión de dosis infectivas de

células Vibrio cholerae a través de alimentos y agua contaminados con heces de seres humanos que
padecen la enfermedad. Los portadores crónicos son poco frecuentes y pueden no ser importante
en las grandes epidemias. Los ambientes marinos pueden servir como depósitos a largo plazo. Los
pescados y mariscos capturados en áreas de contaminación pueden proporcionar la dosis infecciosa.
El agua contaminada también puede ser el origen de la enfermedad.

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Especies de Vibrios causantes de enfermedades en humanos

Especie Gastroenteritis Infección de heridas Sepsis y Fuente de la infección

y tejidos blandos Bacteriemia

V. cholerae:
V. cholerae O1 +++ + + Agua, alimentos
V. cholerae O139 +++ Agua, alimentos
V. cholerae no-O1, no-O139 +++ ++ + Agua, alimentos
V. parahaemolyticus +++ ++ + Crustáceos, agua de mar
V. fluvialis +++ Mariscos
V. mimicus +++ ++ Agua dulce
V. hollisae +++ + Crustáceos
V. furnissii +++ Agua de mar
V. vulnificus ++ +++ +++ Crustáceos, agua de mar
V. alginolyticus ¿? +++ Agua de mar
V. damsela +++ Agua de mar
V. cincinnatiensis ++ desconocido
V. carchariae ++ Agua de mar
V. metschnikovii desconocido
Modificado: Fuente: Tratado SEIMC de enfermedades infecciosas y microbiología clínica. 2014.

Factores de virulencia de Vibrio cholerae O1 y O139 y de otras especies de Vibrio

Especie Factor de virulencia Acción biológica

V. cholerae O1 Toxina del cólera Hipersecreción de agua y electrolitos

Fimbrias correguladoras Adherencia a celulas mucosas
Colonización accesoria Factor adhesina
Mucinasa (proteasa/hemaglutinación) Induce inflamación intestinal y degrada las
uniones estrechas
Sideroforos Secuestro de hierro
Neuraminidasa Aumenta los receptores de la toxina
V. parahaemolyticus Hemolisina directa termoestable
V. vulnificus Resistencia al suero
Polisacáridos antifagocitarios
Citolisinas
Colagenasa
Proteasas
Sideróforos
V. alginolyticus Colagenasa
V. hollisae Enterotoxina termolábil y termoestable
Hemolisinas
V. damsela Citolisinas
Modificado: Fuente: Tratado SEIMC de enfermedades infecciosas y microbiología clínica. 2014.

Objetivos:

❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos específicos de Vibrio cholerae.

❖ Interpretar las características bioquímicas o metabólicas de Vibrio cholerae.

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Material y Procedimiento

Material
Material biológico:
• La muestra es generalmente alimento de dudosa procedencia, diversos tipos de aguas,
heces.

Materiales de vidrio:
• Placas petri
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Frasco Erlenmeyer 500 mL.
• Probeta 100 mL.
• Pipetas 5 mL y 10 mL.
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

Medios de cultivo y reactivos

• Agar TCBS (Agar Tiosulfato Citrato sales Biliares Sacarosa)
• Agar Tripticasa soya
• Agua peptonada alcalina
• Agar TSI
• Agar LIA
• Medio MIO
• Cloruro de sodio
• Oxidasa
• Catalasa
• Inositol
• Glucosa
• Solución salina
• Reactivos de serología (Antisuero polivalente Vibrio cholerae O1, Antisuero monovalente
Ogawa, Antisuero monovalente Inaba y Antisuero monovalente O139.

Otros materiales:
• Asa de siembra
• Hisopos
• Utensilios estériles (cuchillo, tijera, pinza, espátula)
• Gradillas
• Palillos de madera
• Plumón indeleble
• Frasco goteros

Equipos:
• Autoclave
• Incubadora
• Licuadora
• Balanza
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

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Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento del microorganismo presente en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:
• La muestra de alimento (productos hidrobiológicos, agua, heces, etc.) se procede a
tomar la muestra en un recipiente esterilizado o bolsa plástica de primer uso, una
cantidad aproximada de 100 g. y se procede a llevarla inmediatamente al laboratorio
o colocarla en una caja de frio 5°C donde puede permanecer más tiempo (2-4
horas).

• La muestra puede ser heces, agua o productos hidrobiológicos etc. estos son
colectados de la siguiente manera:

Muestra de heces:
Las muertas son colectadas en frasco de boca ancha descartables, una cantidad
aproximada de 1 a 5 gramos, en caso de niños o lactantes se procede a realizar un
hisopado, donde el hisopo es humedecido en una solución salina estéril y se procede
a realizar el frotis rectal.
Si la muestra tiene que transportarse se coloca el hisopado en un medio de
transporte (Medio Cary Blair).

2. Enriquecimiento y Homogenizado de la muestra (alimento):

• La muestra, si es alimento se pesa 10g o 25g y se coloca en 90mL o 225mL de agua
peptonada alcalina para su homogenizado y recuperación de las células bacterianas.

3. Cultivos:
• Luego de la recuperación y homogenizado se procede a la siembra en los medios de
cultivos sólidos indicados para el aislamiento respectivo de las colonias.

4. Estudio morfológico de las colonias

5. Coloración Gram

6. Resiembra

7. Pruebas bioquímicas y serológicas

8. Cepario

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Resultados en Porcentaje para la Identificacion Bioquimica para Vibrio cholerae

Prueba Bioquimica %

TSI – glucosa (ácido) 100

TSI – glucose (gas) 0
TSI – lactose (acido) 7
Reactivo Oxidasa 100
Reactivo catalasa 100
Prueba del Indol 99
Lisina descarboxilasa con 1% de NaCl 99
Ornitina descarboxilasa 99
Prueba rojo de metilo con 1% de NaCl 99
Crecimiento en caldo nutritivo con 0% de NaCl 100
Crecimiento en caldo nutritivo con 1% de NaCl 100
Crecimiento en caldo nutritivo con 6% de NaCl 50
Crecimiento en caldo nutritivo con 8% de NaCl 100
Crecimiento en caldo nutritivo con 10% de NaCl 0

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Práctica N° 09
Espiroquetales

Introducción:
Los espiroquetales son bacterias Gram negativas, móviles, enrolladas y finas (como cabellos fideo de
ángel hervido), son anaerobios, anaerobios facultativos y aerobios, y quimioheterotróficos, su fuente
de carbono y energía primaria son los ácidos grasos de cadena larga, carbohidratos y aminoácidos.

El Orden Spirochaetales se divide en dos familias y 8 géneros, tres de ellos patógenos para el
hombre.

Orden: Spirochaetales
Familia: Treponemataceae
Familia: Leptospiraceae
Borrelia
Brachyspira
Cristispira
Leptonema
Géneros:
Leptospira
Serpulina
Spirochaeta
Treponema

Género Treponema
Solo dos especies de treponemas son patógenos para el hombre, Treponema pallidum (subspecie
pallidum, subespecie endemicum y subespecie perteneu) y Treponema carateum. Otras especies del
genero treponema son comunes en la cavidad oral del hombre siendo posible su aislamiento a
partir del espacio interdentario y encías (Treponema denticola, Treponema macrodentium y
Treponema oralis). También es posible encontrarlas en el rumen de ciertos animales herbívoros
(Treponema saccharophilum), son anaerobios estrictos, tienen la capidad de desdoblar la pectina, la
inulina y otros polisacáridos presentes en los vegetales.

Cabe resaltar la importancia clínica que tiene Treponema pallium y sus tres subespecies y
Treponema carateum como agentes patógenos causantes de enfermedades para el hombre.
Treponema pallidum subesp. pallidum es el agente causante de la sífilis (Infección de transmisión
sexual), Treponema pallidum subesp. endemicum agente causante de la infección denominada
Bejel; Treponema pallidum subesp. pertenue agente causante de la infección denominada Pian y
Treponema carateum agente causante de la Pinta (Bejel, Pian y la Pinta no son infecciones
venéreas).

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La sífilis es una infección de transmisión sexual que ha acompañado al hombre a lo largo de su

desarrollo, Treponema pallidum subesp. pallidum es una espiroqueta enrollada y fina, mide 0,1 x 5 a
15µm, no desarrolla en medios de cultivos comunes, sino donde se encuentren presentes células.
Son demasiadas finas para poder ser observadas con el microscopio óptico bajo una coloración Gram
o Giemsa, es posible su visualización con microscopio óptico si se colorean con anticuerpos
específicos anti-treponema marcados con colorantes fluorescentes.

Género Borrelia
Bacteria Gram negativa, mide 0,2 a 0,5 x 3 a 30µm, se colorean mucho mejor con Giemsa y Wright,
se pueden observar mejor en frotis de sangre de paciente contaminado, es patógena causante de
dos enfermedades humanas importantes como son la Fiebre recurrente y la enfermedad de Lyme.

La Fiebre recurrente es un proceso secuencial y repetitivo de fiebre y septicemia separados por

intervalos donde esta ausente la fiebre. Esta Fiebre recurrente es de dos tipos y se diferencias por el
agente transmisor. El primero transmitido por piojos (Pidiculos humanus) que causa la enfermedad
denominada Fiebre recurrente epidémica y el segundo transmitido por una garrapata que causa la
enfermedad denominada Fiebre recurrente endémica.
La enfermedad de Lyme es transmitida por las garrapatas provocando anomalías dermatológicas,
reumatológicas, neurológicas y cardiacas.

Género Leptospira
Bacteria Gram negativas, helicoidales y finas, miden entre 0,1 x 6 a 20µm, se encuentran
constituidos por un cuerpo citoplasmático y un axostilo que se dispone de forma espiral.
Las leptospiras se encuentran constituidos por dos especies Leptospira interrogans (con 19
serogrupos y 172 serotipos) y Leptospira biflexa (con 38 serogrupos y 65 serotipos). Leptospira
interrogans es patógeno del hombre, animales silvestres y domésticos. Leptospira biflexa es
saprofítico de vida libre que se encuentra en los ambientes húmedos y no causan ninguna
enfermedad.

Bajo el microscopio de campo oscuro se puede observar que una de sus extremidades termina en
gancho, es tan delicado que bajo el campo oscuro puede visualizarse como una cadena de diminutos
cocos, se colorea con dificultad pero puede impregnarse con plata. Son muy sensibles al calor, frio
extremo, variaciones de pH (acido). Su ph optimo es 7,2 – 7,4, no tienen la capacidad de sobrevivir
en agua salada como si lo hacen en agua dulce y pueden sobrevivir en leche diluida 1:20 o más.
En el frio pueden sobrevivir hasta 100 días a -20°C, cabe mencionar que la pasteurización no elimina
a esta bacteria, es necesaria la ebullición para matarla (10 segundos a 100°C o 10 minutos a 56°C).

La orina ácida es letal para el desarrollo de las leptospiras y se hace necesario alcalinizarlo para
proseguir con su aislamiento, en el medio ácido pierde su motilidad transcurridos 15 minutos. En
suelo húmedo sobreviven mucho más tiempo.
Se cultivan en medios específicos como Fletcher, Korthoff y Schuffner, donde la base principal de
estos medios de cultivos esta constituida por suero de conejo diluido, agar peptona, caldos simples y
sales. Las leptospiras utilizan como fuente primaria para su alimentación ácidos grasos de cadena
larga, no así los aminoácidos y carbohidratos, la fuente de nitrógeno lo obtiene de las sales de
amonio.
Las bacterias desarrollan mejor a 30°C en aerobiosis, forman colonias de 1 – 3mm de diámetro y
demoran en crecer de 6 a 10 días.

También pueden desarrollar en cultivo de células especialmente fibroblásticas en donde se puede

observar su efecto citopatogénico.

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Objetivos:
❖ Aislamiento e identificación en medios de cultivos específicos de los géneros Treponema,
Borrelia y Leptospira

❖ Interpretar las pruebas bioquímicas o metabólicas de los géneros Treponema, Borrelia y

Leptospira.

Material y Procedimiento para Treponema

Material

Material biológico:
• La muestra es generalmente orina, sangre, liquido cefalorraquídeo, exudados corporales.

Materiales de vidrio:
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Biker 100 mL.
• Pipetas Pasteur
• Pipetas 1mL, 5 mL y 10 mL.
• Baguetas
• Lamina serológica de 2x3 pulgadas con anillos de 14mm de diámetro
• Lamina cubreobjetos
• Laminas portaobjetos

Medios – reactivos – soluciones

• Kit de VRDL (Antígeno stock – Solución salina amortiguada)
• Alcohol yodado
• Suero control (reactivo y no reactivo)

Otros materiales:
• Micropipeta de 5 - 50µL
• Tips (1 - 100µL)
• Guantes
• Mascarilla
• Pinzas
• Plumón indeleble
• Lejía al 3 – 5%
• Frascos tipo penicilina de 5mL.
• Agujas descartables 20x1”
• Aguja roma (sin bisel) calibre 18 para reacciones con el suero
• Jeringa descartable de 5mL
• Chupones para pipeta Pasteur
• Frasco de boca ancha para colocar solución desinfectante
• Tarro de metal para descarte de agujas
• Algodón

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Equipos:
• Centrifuga
• Maquina rotatoria adaptable a 180 rpm. que describa un circulo de 19mm de diámetro en
plano horizontal.
• Microscopio de campo claro con ocular de 10x y objetivo de 10x
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismo presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:

• La muestra puede ser de diferentes partes del cuerpo del hombre: sangre, orina,
esputo, heces, liquido cefalorraquídeo, etc. estos son colectados de la siguiente
manera:

Muestra de Sangre para análisis de Sífilis:

Las muestras son colectadas en la cantidad adecuada es de 5 a 30mL en condiciones
de esterilidad. La piel en la zona a realizar la punción debe ser desinfectada con
alcohol al 70% más yodo al 2%, de igual modo los dedos del colector. Se utiliza una
aguja número 21 por 1”. Se realiza la punción de manera precisa con el bisel hacia
arriba, introduzca la aguja en el centro, sin titubeos, de 1 a 1,5cm aproximadamente
y se tira lentamente del embolo para aspirar la sangre. Se retira la aguja y se coloca
un pedazo de algodón en la zona de la punción.

Vierta lentamente la sangre en un tubo de prueba sin anticoagulante y tápelo, dejar

reposar el tubo por un lapso de 30 minutos a 2 horas, centrifugar a 2000 – 2500 rpm
durante 5 minutos. Si no se cuenta con una centrífuga se debe dejar en la
refrigeración por varias horas y finalmente el suero se separará del coagulo.

Destapar el tubo y aspirar el suero con una pipeta Pasteur, depositar el suero en
otro tubo limpio y seco, así esta listo para ser inactivado. (si se tuviera que trasladar
la muestra a otro laboratorio, se coloca en viales de plástico tapa rosca o en frascos
tipo penicilina estéril de 5mL de capacidad sellándolo con parafilm).

2. Prueba de Laboratorio VDRL (Venereal Disease Research Laboratory):

La prueba de VDRL, es una prueba de microfloculación en lámina, utiliza un

antígeno que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol.
La suspensión del antígeno forma grumos cuando se enfrenta con anticuerpos
antilipídicos presentes en el suero o liquido cefalorraquídeo del paciente con sífilis.

T. Agurto – J.C. Ramos

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El antígeno para esta prueba es una solución alcohólica que contiene cardiolipina al
0,03%, colesterol al 0,9% y lecitina purificada al 0,21%, esta solución alcohólica debe
mantenerse a una temperatura de entre 23 y 29°C antes de su utilización.

Para la presente Prueba de VDRL cualitativa se utiliza el suero obtenido durante la

toma de muestra de la sangre y se sigue los siguientes pasos:

• Examinar que la muestra no presente turbidez o hemolisis.

• El suero debe ser inactivado por calor en baño maría a 56°C durante 30 minutos.
• Las muestras deben estar a temperatura ambiente para su evaluación.
• Con una micropipeta colocar 50µl del suero control reactivo al primer anillo de
la lamina serológica y 50µl del suero control no reactivo al segundo anillo; a
partir del tercer anillo, colocar 50µl de los sueros problemas en cada uno de los
anillos de la lamina serológica.
• Añadir con una micropipeta 17µl de solución antígena sobre cada muestra en la
lamina serológica, de no contar con una micropipeta utilizar una jeringa de 2cc
con aguja calibre 18 (sin bisel) y sosteniéndola en una posición vertical dejar
caer una gota de la solución antigénica sobre cada muestra.
• Colocar la lamina serológica con las muestras sobre un rotor a 180 rpm durante
4 minutos a una temperatura ambiental de 23 a 29°C.
• Culminado el proceso de rotación mecánica, observar las laminas
inmediatamente bajo le microscopio con ocular 10x y objetivo 10x.
• Reportar los resultados de la siguiente forma:

Lectura Resultado
Grumosidad mediana a grande Reactivo (R)
Grumosidad pequeña Reactivo débil (RD)
Ausencia de grumosidad No Reactivo (NR)

Para confirmar los resultados preliminares se procede con a Prueba de VDRL

cuantitativa que consiste en lo siguiente:

• Colocar 50µl de la solución salina al 0,9% del segundo al cuarto circulo en la

lamina serológica.
• Anadir 50µl de suero en el primer y segundo circulo.
• Mezclar la solución salina mas el suero en el segundo circulo y transferir (pasar)
50µl al tercer circulo y repetir lo mismo hasta el cuarto circulo y descartar los
últimos 50µl.
• Añadir con una micropipeta 17µl de solución antígena sobre cada muestra en la
lamina serológica, de no contar con una micropipeta utilizar una jeringa de 2cc
con aguja calibre 18 (sin bisel) y sosteniéndola en una posición vertical dejar
caer una gota de la solución antigénica sobre cada muestra.
• Colocar la lamina serológica con las muestras sobre un rotor a 180 rpm durante
4 minutos a una temperatura ambiental de 23 a 29°C.
• Culminado el proceso de rotación mecánica, observar las laminas
inmediatamente bajo le microscopio con ocular 10x y objetivo 10x.
• La lectura es similar que en la prueba cualitativa.
• Reportar los resultados en términos de la mas alta dilución en que se produzca
un resultado reactivo.
T. Agurto – J.C. Ramos
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• Si se obtiene reactivo por sobre el titulo 1/8 proseguir con:

• Prepare una dilución 1/8, colocando en un tubo 0,7mL de solución
salina al 0,9% y agregue 0,1mL del suero problema.
• Colocar 50µl de solución salina 0,9% en los círculos segundo, tercero
y cuarto de la lamina serológica.
• Anadir 50µl de la dilución 1/8 en los círculos 1 y 2.
• Mezclar la solución salina mas el suero en el segundo circulo y
transferir (pasar) 50µl al tercer circulo y repetir lo mismo hasta el
cuarto circulo y descartar los últimos 50µl.
• Añadir con una micropipeta 17µl de solución antígena sobre cada
muestra en la lamina serológica, de no contar con una micropipeta
utilizar una jeringa de 2cc con aguja calibre 18 (sin bisel) y
sosteniéndola en una posición vertical dejar caer una gota de la
solución antigénica sobre cada muestra.
• Colocar la lamina serológica con las muestras sobre un rotor a 180
rpm durante 4 minutos a una temperatura ambiental de 23 a 29°C.
• Culminado el proceso de rotación mecánica, observar las laminas
inmediatamente bajo le microscopio con ocular 10x y objetivo 10x.
• Reportar los resultados en términos de la más alta dilución en que
se produzca un resultado reactivo.

• Informar los resultados según el siguiente esquema:

Suero no diluido Diluciones del suero Resultados

(1:1) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
R RD N N N N Reactivo 1 dil

R R N N N N Reactivo 2 dils

RD N N N N N Reactivo Débil 0 dil

R R R R R N Reactivo 16 dils

N: No Reactivo; R: Reactivo; RD: Reactivo Débil

3. Interpretación de los resultados:

a. Un VDRL Reactivo nos puede indicar una infección presente o pasada con treponemas
patógenos, sin embargo esto puede ser una reacción falso positiva. Un falso positivo se
detecta con una prueba treponémica, la cual, es No Reactivo.
b. Un VDRL No Reactivo sin evidencia clínica de sífilis, nos puede indicar que no hay
evidencia de infección por treponemas o que el tratamiento fue efectivo. Un VDRL No
Reactivo con evidencia clínica, se puede observar en sífilis primaria o secundaria.
c. El valor predictivo del diagnostico de sífilis se incrementa cuando se combina el
resultado de una VDRL con una prueba treponémica.

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Anexo:
Preparación de la solución antígena para trabajo
a. Depositar 0,4mL de buffer salino en un frasco pequeño.
b. Anadir 0,5mL de antígeno VDRL proporcionado por el kit, se debe adicionar gota a gota
con movimientos circulares del frasco para permitir una adecuada homogenización del
antígeno con el buffer salino.
c. Verificar que no quede antígeno en la pipeta
d. Anadir 4,1mL de buffer salino al frasco con la mezcla anterior.
e. Tapar el frasco, agitar vigorosamente por 10 segundos aproximadamente, así la solución
esta lista para ser utilizara por un día y debe mantenerse a una temperatura entre 23 y
29°C.

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Material y Procedimiento para Leptospira

Material

Material biológico:
• La muestra es generalmente orina, sangre, liquido cefalorraquídeo, exudados corporales.

Materiales de vidrio:
• Tubos de 13x100 tapa rosca
• Biker 100 mL.
• Pipetas Pasteur
• Pipetas 1mL, 5 mL y 10 mL.
• Baguetas
• Lamina cubreobjetos
• Laminas portaobjetos

Medios de cultivo – reactivos – soluciones

• Medio de Fletcher
• Medio de Korthoff
• Medio Vervoort

Otros materiales:
• Micropipeta de 5 - 50µL
• Tips (1 - 100µL)
• Guantes
• Mascarilla
• Pinzas
• Plumón indeleble
• Lejía al 3 – 5%
• Frascos tipo penicilina de 5mL.
• Agujas descartables 20x1”
• Aguja roma (sin bisel) calibre 18 para reacciones con el suero
• Jeringa descartable de 5mL
• Chupones para pipeta Pasteur
• Frasco de boca ancha para colocar solución desinfectante
• Tarro de metal para descarte de agujas
• Algodón

Equipos:
• Centrifuga
• Maquina rotatoria adaptable a180 rpm. que describa un circulo de 19mm de diámetro en
plano horizontal.
• Microscopio de campo claro con ocular de 10x y objetivo de 10x
• pH-metro
• Refrigeradora
• Otros aparatos propios del laboratorio

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Procedimiento
La metodología es experimental consiste en la preparación previa del material de vidrio y medios de
cultivos para el cultivo y aislamiento de los microorganismo presentes en las muestras biológicas
colectadas.

1. Toma de muestra:

• La muestra puede ser de diferentes partes del cuerpo del hombre: sangre, orina,
esputo, heces, liquido cefalorraquídeo, etc. estos son colectados de la siguiente
manera:

Muestra de Sangre para análisis de Leptospira:

Las muestras son colectadas en la cantidad adecuada es de 5mL en condiciones de
esterilidad con anticoagulante heparina o 0,5ml de oxalato de sodio al 1% estéril (no
usar citrato de sodio por su acción inhibitoria). Tomar la muestra en la primera fase
de la enfermedad cuando el paciente presente un estado febril y entre los tres
primeros días del cuadro. La piel en la zona a realizar la punción debe ser
desinfectada con alcohol al 70% más yodo al 2%, de igual modo los dedos del
colector. Se utiliza una aguja número 21 por 1”. Se realiza la punción de manera
precisa con el bisel hacia arriba, introduzca la aguja en el centro, sin titubeos, de 1 a
1,5cm aproximadamente y se tira lentamente del embolo para aspirar la sangre. Se
retira la aguja y se coloca un pedazo de algodón en la zona de la punción.

Vierta la sangre inmediatamente en el medio de cultivo para Leptospira.

2. Cultivos:
• Sembrar en los medios de cultivos sólidos y/o semisólidos indicados para el
aislamiento respectivo

4. Estudio morfológico de las colonias

5. Coloración Gram

6. Resiembra

7. Pruebas bioquímicas

8. Cepario

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Serología para el género Leptospira:

Los anticuerpos IgM se producen tempranamente, dentro de los 5 primeros días de la infección y
son detectados por la prueba de aglutinación microscópica (MAT), inmunohemaglutinación o ELISA
para IgM. Los anticurpos IgG son detectados posteriormente por MAT y ELISA.

En el periodo agudo y de convalecencia los anticuerpos IgM se detectan principalmente por ELISA
IgM, después de la recuperación del paciente esta prueba es negativa. Es importante mencionar que
los resultados de IgM negativo no descarta el caso si la muestra fue obtenida antes del quinto día de
la enfermedad.

Los anticuerpos si están presentes en el suero, se combinaran con el antígeno de leptospira fijados a
la superficie de los pocillos de poliestireno. El suero residual se remueve al lavar y se añade el
conjugado anti-humano IgM o IgG ligado a una enzima peroxidasa. Los pocillos son lavados y
coloreados por un sustrato (peróxido de hidrogeno) mas un cromógeno que es añadido. Al
hidrolizarse el sustrato por la enzima el cromógeno cambia de color. La intensidad del color esta
relacionado con la concentración de anticuerpo contra leptospira presente en la muestra.
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Práctica N° 10
Hongos y Levaduras

ENSAYO : NUMERACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

(Técnica de dilución en placa)
PRODUCTO : PRODUCTOS CARNICOS Y EMBUTIDOS
REFERENCIA: Yeasts. Molds and Mycotoxins, Enumeration of Yeast and Mold in Food - Dilution
Plating Technique. Bacteriologycal Analytical Manual on Line. FDA 8th Ed.
Rev. A / 1998. Revised: April 2001, Chapter 18

El enorme y variado grupo de mohos y levaduras (Fungi) microscópicos en alimentos incluyen algunos
cientos de especies. La capacidad de estos organismos para atacar muchos alimentos se debe en gran
parte a su relativa versatilidad de requerimientos ambientales. Aunque la mayoría de mohos y
levaduras son aerobios obligados (requieren oxígeno libre O2 para crecer), su requerimiento
ácido/alcalino es amplio, variando entre pH 2 a pH 9. Su rango de temperatura también es amplio (10 –
35° C), con pocas especies capaces de crecer por debajo o por encima de este rango. La humedad
requerida de los mohos patógenos en alimentos es relativamente baja, en el cual muchas especies
pueden crecer a una actividad de agua (aw) de 0,85 o menos, aunque las levaduras requieren
generalmente una actividad de agua mucho mayor.

Tanto mohos como levaduras causan diferentes grados de deterioro y descomposición en alimentos.
Ellos pueden invadir y crecer virtualmente sobre cualquier tipo de alimento en cualquier momento;
invadiendo las cosechas de granos, nueces, leguminosas y frutas en los campos, antes de la cosecha y
durante el almacenamiento. Así también pueden crecer en alimentos procesados y mezclas de
alimentos.

Su detección dentro o sobre el alimento depende del tipo de organismo involucrado, alimento y grado
de invasión; el alimento contaminado puede estar levemente alterado, severamente alterado o
completamente descompuesto, con crecimiento evidente como raíces pigmentadas de varios tamaños
y colores, costras de mal aspecto, micelio blanco algodonoso, o moho esporulante altamente
coloreado. Puede producirse olor y color anormal. Ocasionalmente, un alimento puede aparecer libre
de mohos, pero en el análisis micológico suele estar contaminado. La contaminación de mohos y
levaduras en alimentos puede resultar en una pérdida económica sustancial para el productor,
procesador y consumidor final.
Muchos mohos patógenos de alimentos, y posiblemente levaduras, pueden también ser riesgosos para
salud humana o animal, debido a su capacidad para producir metabolitos tóxicos conocidos como
micotoxinas. Muchas micotoxinas son compuestos estables que no son destruidos durante el

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procesamiento o cocinado doméstico del alimento. Aunque los organismos generadores pueden no
sobrevivir a la preparación del alimento, la toxina preformada puede permanecer en el mismo. Ciertos
mohos y levaduras pueden también provocar reacciones alérgicas o causar infecciones. Aunque
muchos hongos de alimentos no son infecciosos, algunas especies pueden causar infección,
especialmente en poblaciones inmunocomprometidas, como los ancianos y pacientes infectados con
VIH, y personas con tratamiento de antibióticos o que reciben quimioterapia.

Los métodos de vertido y diseminación pueden ser usados para detectar hongos en alimentos. El
método de difusión (diseminación) es más eficiente que el método de inclusión para detectar especies
de mohos individuales, incluyendo muchos productores de toxinas, pero es menos efectivo en la
detección de levaduras. Es también usado para determinar si la presencia de mohos se debe a
contaminación externa o invasión interna.

A. Equipos y Materiales.
1. Equipamiento básico (y técnicas apropiadas) para la preparación de un homogenizado
de muestra (ver Cap. 1: Food sampling and preparation of smples homogenate – FDA).
2. Equipo para el plaqueo de las muestras (ver Cap. 2: “Aerobic Plate count”)
a. Área de trabajo, mesa nivelada de amplia superficie dentro de un ambiente que
sea limpio, bien iluminado (100 candelas por pie en la superficie de trabajo), con
buena ventilación y razonablemente libre de polvo y corrientes de aire. La
densidad microbiológica del aire, en la sala de trabajo, cuantificada a través de
placas expuestas tomadas durante el plaqueo, no deben exceder las 15 colonias
por placa durante 15 minutos de exposición.
b. Espacio de almacenamiento, libre de polvo e insectos y adecuado para la
protección de equipos y suministros.
c. Placas Petri (al menos de 15 x 90 mm), de vidrio o plástico, estériles.
d. Pipetas dotadas de bombillas o pipeteadores (nunca debe pipetearse con la
boca), de 1, 5 y 10 mL graduadas en unidades de 0,1 mL
e. Frascos estériles para dilución, 6 onzas (160 mL, de vidrio resistente (borosilicato
o equivalente), con tapones de goma o tapa rosca plástica.
f. Recipientes para pipetas y placas Petri, adecuados para su protección.
g. Baño termostático con circulación forzada, para temperar el agar controlado a
45° C ± 1° C.
h. Contador de colonias (de campo oscuro, Quebec o equivalente) con fuente de luz
incorporada y rejilla de recuento adecuadas.
i. Contómetro.
j. Refrigeradora, para enfriar y mantener las muestras de 0 a 5°C.
k. Congeladora (Freezer), para mantener las muestras congeladas de -15 a -20°
3. Incubadora 25+/- 1°C
4. Canastilla de vaporización Arnold 1.
5. pHmetro.

1
Material recomendado pero no imprescindible para la ejecución del ensayo (véase C,1).
T. Agurto – J.C. Ramos
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B. Medios y Reactivos.
Medios:
1. Agar diclorán rosa de bengala cloranfenicol (DRBC), utilizado sólo cuando se trabaje con el
método de difusión en superficie.
2. Agar diclorán al 18% con glicerol (DG18)
3. Agar de Recuento en Placa (PCA: Plate Count Agar), añadir 100 mg de cloranfenicol / L cuando
este medio es usado para numeración de mohos y levaduras. Este medio no es eficiente
cuando hay mohos expansivos.
4. Agar Malta; puede usarse medio deshidratado comercial
5. Agar Extracto de Malta; puede usarse medio deshidratado comercial
6. Agar Papa Dextrosa (PDA: Potato Dextrosa Agar).

Preparación de la Solución Stock de Antibióticos:

Preparar la solución stock de Cloranfenicol por dilución de 0,1 g cloranfenicol en 40 mL de agua
destilada, añadir esta solución a 960 mL de medio y mezclar antes de autoclavar.
Cuando el Cloranfenicol, así como la clorotetraciclina sean utilizados, añadir 20 mL de la solución
stock de cloranfenicol a 970 mL de medio antes de autoclavar. Luego, preparar la solución stock de
clorotetraciclina, disolviendo 0,5 g de antibiótico en 100 mL de agua destilada y esterilizar por
filtración. Utilizar 10 mL de esta solución por cada 990 mL de medio autoclavado y temperado.
Refrigerar en la oscuridad y volver a utilizar la solución stock remanente hasta 1 mes después. La
solución stock deberá ser llevada a temperatura ambiental antes de añadir al medio temperado.
Los antibióticos son añadidos al medio micológico para inhibir el crecimiento bacteriano. El
cloranfenicol es el antibiótico de selección por su estabilidad en condiciones de autoclavado. Por lo
tanto, la preparación del medio es fácil y rápido porque se elimina el paso de filtración. La
concentración recomendada de este antibiótico es 100 mg por cada litro de medio. Si el
sobrecrecimiento bacteriano es aparente, preparar el medio añadiendo 50 mg/L de cloranfenicol
antes de autoclavar y 50 mg/L de clorotetraciclina previamente esterilizada por filtración cuando el
medio haya sido temperado. Mezclar antes de servir en placas.

C. Procedimiento
Preparación de la muestra

1. Analizar 25-50 g de cada submuestra; generalmente tamaño de muestra mayores incrementan

la reproducibilidad y baja la variaza comparado con muestras pequeñas. Probar submuestras
individuales o compósitos de acuerdo al Programa de Rendimiento respectivo para el alimento
bajo estudio.
2. Añadir la cantidad apropiada de agua peptonada 0,1% a la muestra recién pesada para lograr la
dilución 10-1, luego se homogeniza en un stomacher / homogenizador durante 2 minutos.
Alternativamente, la mezcla puede ser homogenizada por 30-60 seg., pero este procedimiento
es menos efectivo.
3. Hacer las diluciones apropiadas 1:10 (1+9) en agua peptonada 0,1%. Hasta la dilución 10 -6 es
suficiente.

T. Agurto – J.C. Ramos

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Plaqueo e incubación de muestra

A. Método por difusión en placa:

1. Pipetear asépticamente 0,1 mL de cada dilución en placas de agar DRBC solidificado y

difundir el inóculo con una varilla curvada de vidrio estéril. El agar DG18 es preferido
cuando la actividad de agua (aw) de la muestra analizada es menor de 0,95.
2. Plaquear cada dilución por triplicado.

B. Método por vertido en placa:

3. Usando pipetas estériles, taponadas de algodón, colocar alícuotas de 1 mL de las

diluciones muestrales en placas de Petri (plástico o vidrio), 15 x 100 mm, rotuladas y
añadir inmediatamente 20-25 mL del agar DG18 temperado.
4. Mezclar el contenido rotando cuidadosamente las placas vertidas en sentido horario y
luego antihorario, cuidando de no perder parte del agar licuado sobre los bordes de la
placa. Añadir el agar dentro de los 2 primeros minutos, después de añadida la dilución
correspondiente; de no respetarse este tiempo, la dilución puede llegar a adherirse al
fondo de la placa (especialmente si la muestra tiene un elevado contenido de almidón
y las placas son de plástico) y no se mezclará uniformemente.
5. Plaquear cada dilución por triplicado.
6. Desde la preparación de la primera dilución hasta el vertido final en la placa, no debe
transcurrir más de 20 minutos (de preferencia 10 minutos).

Nota: El método por diseminación en superficie de 0,1 mL de la muestra diluida se considera mejor
que el método de vertido en placa. Cuando se usa la técnica del vertido en placa, las colonias
fúngicas crecen más rápido sobre la superficie de la placa y frecuentemente ocultan a aquellas que
subyacen por debajo de la superficie del agar, conduciendo a una enumeración menos precisa. La
enumeración por siembra en superficie proporciona un crecimiento más uniforme y facilita el
aislamiento de las colonias.
El agar DRBC deberá ser usado sólo cuando se disemine o propague en placa las diluciones de
muestra.

7. Incubar las placas en oscuridad a 25 º C. No apilar (una encima de otra) más de 3

placas, teniendo cuidado de no invertirlas.
Nota: No mover, ni manipular de cualquier otra manera las placas incubadas hasta el
momento del recuento final.

Conteo de placas:
1. contabilizar las placas luego de transcurridos 5 días de incubación. Si no existiera
crecimiento hasta el quinto día, re-incubar las placas por otras 48 h. No efectuar el
recuento a los 3 días, debido a que la manipulación de las placas puede producir
crecimiento secundario a raíz de las esporas desprendidas, lo que invalidaría el recuento
efectuado al 5to día.

2. Realizar el recuento sobre placas que contengan 10-150 colonias.

3. Si se Observaran principalmente levaduras, por lo común pueden contabilizarse placas
T. Agurto – J.C. Ramos
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con 150 colonias. Sin embargo, si se observara cantidades apreciables de mohos

en las placas, dependiendo del tipo de moho desarrollado, el límite superior de
conteo puede disminuir a discreción del analista.

4. Reportar los resultados en unidades formadoras de colonias / UFC / g o UFC/mL/ en

base al recuento promedio de las placas por triplicado. Redondear los recuentos a 2
cifras significativas.
Si el tercer dígito es 6 o mayor, redondear por exceso (por ejemplo, 456 = 460);
mientras que si es 4 o menor , redondear por defecto (por ejemplo, 454 = 450).
Si el tercer dígito es 5, redondear por defecto si los primeros 2 dígitos son un número par
(por ejemplo, 445 = 440) y redondear por exceso si los primeros 2 dígitos son un número
impar (por ejemplo, 455 = 460).
Cuando las placas de todas las diluciones no tengan colonias, reportar el conteo de mohos
y levaduras como menor de 1 vez la más baja dilución utilizada.
Aislar colonias individuales en PDA o MA, si el posterior análisis e identificación de
especies es necesario.

REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO.

1. Agar de Recuento en Placa (PCA: Plate Count Agar)
Triptona .........................................................................5 g
Extracto de levadura .................................................2,5 g
Glucosa ..........................................................................1 g
Agar .............................................................................15 g
Agua destilada .........................................................1 litro

Calentar hasta disolver los ingredientes. Distribuir en tubos o frascos adecuados.

Autoclavar durante 15 min. a 121°C. El pH final debe ser 7,0 ± 0,2.

Para Mohos y Levaduras Viables:

Distribuir porciones de 20-25 mL en placas Petri estériles de 15 x 100 mm.

2. Agar Extracto de Malta

Extracto de Malta .......................................................30 g
Agar .............................................................................20 g
Agua destilada .........................................................1 litro

Hervir hasta disolver los ingredientes. Evitar el sobrecalentamiento ya que produce

ablandamiento del agar y oscurecimiento del medio. Autoclavar 25 minutos a 121 ºC.
Repartir 20-25 mL en placas Petri estériles de 15 x 100 mm. El pH final del medio debe ser
5,5 ± 0,2.

Para cosméticos: enfriar el medio a 47-50 ºC después del autoclavado. Repartir 4 mL de la

solución patrón (stock) de clortetraciclina HCl (1 g/100 mL), esterilizada por filtración, por

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litro de medio para obtener una concentración final de clortetraciclina HCl de 40 ppm.
Mezclar uniformemente y distribuir porciones de 20 mL en placas Petri de 15 x 100 mm.

3. Agar Papa Dextrosa (PDA: Potato Dextrose Agar)

Infusión de papa ................................................... 200 mL
Glucosa (Dextrosa) .....................................................20 g
Agar .............................................................................20 g
Agua destilada .........................................................1 litro

Para preparar la infusión de papa, hervir 200 g de papa sin pelar y rebanada, en 1L de
agua destilada durante 30 min. Filtrar a través de una gasa y rescatar el efluente, el cual
constituye la infusión de papa (o usar una forma deshidratada comercial). Mezclar con los
otros ingredientes y calentar hasta disolver. Autoclavar 15 minutos a 121 ºC. Dispensar
porciones de 20-25 mL en placas Petri estériles de 15 x 100 mm. El pH final del medio
debe ser 5,6 ± 0,2. El medio no debe ser relicuado más de una vez. El medio deshidratado
comercial puede también usarse pero puede que requiera ser suplementado con agar
extra hasta una concentración de 20 g/L. Al medio deshidratado BBL o Difco, añadir 5 g
de agar.

Para cosméticos: enfriar el medio a 47-50 ºC después del autoclavado. Añadir

clortetraciclina hasta 40 ppm (concentración final). Mezclar uniformemente y distribuir
porciones de 20 mL en placas de Petri de 15 x 100 mm. Repartir 4 mL de la solución
patrón (stock) de clortetraciclina HCl (1g/100 mL), esterilizada por filtración, por litro de
medio.

4 Agar dicloran al 18 % con cloranfenicol

Glucosa..................................................................10 g
Peptona....................................................................5 g
KH2PO4.....................................................................1g
MgSO4. 7H2O………………………………….. .0,5g
Solución diclorán (2,6 dicloro 4-nitroanilina)
Al 0,2% w/v etanol..................................................... 1mL
Cloranfenicol .............................................................. 0,1g
Agar ............................................................................. 15g
Agua destilada ........................................................ 800Ml

Mezclar los ingredientes y hervir para disolver el agar, entonces llevar a 1000 mL con agua
destilada. Añadir 220 g de glicerol (grado analítico), y esterilizar por autoclave a 121°C x
15 minutos. Temperar el medio a 45°C y servir en placas.
Peptona al 0,1%:
Peptona....................................................................1,0 g
Diluir en 1 litro de agua destilada y esterilizar por autoclave a 121°C x 15 minutos.

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5. Agar Diclorán Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC)

Glucosa..........................................................10.0 g
Peptona............................................................5.0 g
KH2PO4............................................................1.0 g
MgSO4.7H2O................................................... 0.5 g
Rosa de bengala (solución acuosa 5%)..........0.5 mL
Diclorán (solución etanólica 0.2%)..................1.0 mL
Cloranfenicol……………………………………. 0.1 g
Agar………………………………………………15.0 g
Agua destilada………………………………….....1.0 L

Mezclar los ingredientes y hervir para disolver el agar, y esterilizar por autoclave a 121°C por
15 min. Enfriar a 45 ± 1° C en un baño de agua y verter en placas. pH final: 5.6 ± 0.2

Nota: El agar DRBC se usa especialmente para el análisis de muestras que contienen mohos
“expansivos”’ (por ejemplo: Mucor, Rhizopus, etc.), luego de agregar el diclorán y la rosa de
bengala, disminuirá efecetivamente la proliferación de hongos de rápido crecimiento. De este
modo se podrá realizar la lectura y detección de otros propágulos de levaduras y mohos, de
crecimiento mas lento.

Los medios que contienen Rosa de bengala, son sensibles a la luz; una exposición
relativamente corta resultará en la formación de compuestos inhibitorios. Mantener este
medio en un lugar oscuro y frío hasta su uso. El agar DRBC solo debería ser usado para el
método de extensión en placa.

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Técnica de Microcultivo para Hongos

Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y enfriado, un trozo de medio gelificado de 1

cm de lado y 2 mm de espesor, tomado de una placa estéril. Sembrar el hongo en los bordes del
trozo de agar. Colocar un cubreobjetos, también flameado y enfriado.
Incubar a temperatura ambiente en una cámara húmeda durante 3 días. Después observar los
microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocado pasar al objetivo 10x para apreciar la
morfología inalterada de las estructuras fúngicas.

T. Agurto – J.C. Ramos

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COLORACIÓN PARA HONGOS

Coloración de Micosis Superficial.

1. Se hace el raspado de la piel, se recoge sobre un portaobjetos que contenga unas gotas de
solución de NaOH ó KOH al 15%.
2. Se cubre con una laminilla.
3. Se elimina el líquido excedente con papel de filtro.
4. Se coloca una gota de azul de metileno diluído por el borde de la laminilla.

Las muestras con infecciones de hongos por lo general no se colorean para su observación, se
extienden sobre el portaobjetos se le añade unas gotas de agua destilada se cubre con laminilla y
observa.

COLORACIÓN GRAM
Se sigue la técnica como para bacterias, en casos de colorearse Actinomyces, Candida, Geotrichum.

COLORACIÓN ACIDORRESISTENTES-ZIEHL-NEELSEN.
Se sigue la técnica como para las bacterias acidorresistentes. En caso de Hongos se colorean
Nocardia, los cortes se desparafinan con xilol-aceite de cacahuate 2:1.
El colorante se mantiene por 10 minutos y la decoloración es con acido sulfúrico al 1%.

COLORACIÓN DE GIEMSA Y WRIGHT

Estas técnicas y colorantes se utilizan cuando la muestra es sangre o punción de médula roja de los
huesos, como en casos de Histoplasma.

COLORACIÓN DE GOODPASTURE
1. Las muestras son biopsias o frotices de cultivos.
2. Colorear con colorante de Goodpasture durante 10 a 30 minutos.
3. Lavar con agua corriente.
4. Gotear formol hasta aclarar el preparado.
5. Lavar con agua corriente.
6. Gotear acido pícrico al 1.2% por 5 minutos.
7. Lavar con agua corriente, gotear luego alcohol de 95% y luego agua corriente.
8. Contracolorear con Cristal de Violeta de Stirling, por 5 minutos.
9. Lavar con agua corriente.
10. Gotear Lugol, por 1 minuto.
11. Escurrir, tratar el preparado con una mezcla 1:1 de Anilina-Xilol se hace el cambio hasta que
ya no salga más colorante.
12. Cubrir con laminilla con una pequeña gota de Bálsamo de Canadá.

Resultado: Los hongos aparecen de color azul oscuro, otras bacterias de rojo y el resto de elementos
de diferentes tonalidades.

COLORACIÓN DE GRIDLEY
1. La muestra que se tiene en el portaobjetos se trata con solución de Acido Crómico al 4%,
durante 1 hora.

T. Agurto – J.C. Ramos

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2. Lavar con agua corriente durante 5 minutos.

3. Colocar el reactivo de Schiff durante 15 minutos.
4. Lavar con Acido Sulfuroso, 3 veces, por cada vez 2 minutos.
5. Lavar con agua corriente durante 15 minutos.
6. Gotear o sumergir en una solución de Aldehído-fucsina, por 15 minutos.
7. Dejar las preparaciones en refrigeradora durante 48 horas.
8. Si hay exceso de colorante lavar con alcohol de 95%, luego con agua.
9. Después de lavar con agua corriente, Contracolorear con Amarillo de metanilo durante 5
minutos.
10. Lavar con agua corriente.
11. Luego hacer los pasajes en alcohol etílico de 70%, 95% absoluto y xilol, 1 minuto cada vez.
12. Montar con laminilla usándose una gota de Bálsamo de Canadá.

Resultado: Las hifas aparecen de color azul intenso, las conidias de rosa-púrpura, en un fondo
amarillo, los tejidos aparecen azules.

COLORACIÓN DE BAKER Y SMITH

Esta técnica es para cualquier hongo filamentoso, tipo Mucor, Aspergillus o cualquier Ficomiceto.

1. La muestra que se tiene sobre el portaobjetos, se le cubre con una gota de agua destilada y
se enjuaga con Acido Acético al 0.5%.
2. Teñir con Fucsina fenicada anilina de Goodpasture, durante 5 a 10 minutos.
3. Lavar con agua corriente y luego con Acido Acético al 0.5%.
4. Colorear con Picroíndigocarmín (ver fórmulas).
5. Lavar con Acido Acético al 0.5%.
6. Lavar con alcohol de 95% dos veces, luego con alcohol absoluto, dos veces con xilol dos
veces y montar con Bálsamo de Canadá Permount.

Resultados: Los hongos aparecen de color verde azulejos.

T. Agurto – J.C. Ramos

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¨La fortuna juega a favor de una

mente preparada¨
Louis Pasteur 1822 - 1895

T. Agurto – J.C. Ramos

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