Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE

Nombre: Mirla Luzón

NRC: 5340
Fecha: 2021-08-20
Taller: Advances in Non-Viral DNA Vectors for gene therapy
1. Ventajas y desventajas de vectores virales y no virales

Virales No virales
- Capacidad natural para invadir - Los vectores no virales
células y entregar una carga útil son mucho menos
genética manipulada para uso inmunogénicos que los
Ventajas
terapéutico. vectores virales
- Los vectores adenovirales se
mantienen episómicamente,
- Los vectores lentivirales y - Deben formar
retrovirales conllevan un alto complejos con
riesgo de alteración genética. vehículos de
- Los vectores adenovirales administración.
pueden causar toxicidad e - Los vectores de ARN
inmunogenicidad. son típicamente menos
- Algunos (AdV5) o (AAV2), estables y más
Desventajas presentan problemas con transitorios que el
inmunidad preexistente. ADN y, por lo tanto,
- El mismo serotipo de requieren medidas de
construcción no puede protección adicionales.
administrarse repetidamente al
mismo
paciente porque habrán
desarrollado inmunidad a él
2. Posibles limitantes de los vectores plasmídicos
La mayoría de las preparaciones de ADN plasmídico contienen varias variantes topológicas
del plásmido, incluido el superenrollado (la topología preferida), pero también las formas
circulares y lineales abiertas no deseadas de la molécula.
Los plásmidos son generalmente ineficaces para entregar sus cargas útiles en comparación
con los virus, por lo que requieren vehículos, fuerzas físicas o modificaciones especializadas
para la captación y la localización nuclear.
Algunos métodos de administración conducen a la rotura de la columna vertebral del ADN
plasmídico, lo que aumenta la probabilidad de integración del genoma y, si se produce la
rotura en la secuencia terapéutica, la expresión es menos eficaz.
Los plásmidos episomas no se replican, la expresión transgénica es transitoria y se diluye por
división celular.
Las secuencias bacterianas en los plásmidos pueden contribuir a su silenciamiento génico.
Los dinucleótidos de citosina-fosfato-guanina (CpG) no metilados tienen el potencial de ser
reconocidos por el sistema inmunológico de los mamíferos a través de TLR-9, lo que podría
precipitar no solo el silenciamiento del transgén sino también la respuesta inmunitaria.
El uso de antibióticos y sus genes de resistencia en la preparación de vectores plasmídicos,
sin embargo, está desaconsejado por organismos reguladores como la Administración de
Alimentos y medicamentos y la Agencia Europea de Medicamentos debido al riesgo de
transferencia y replicación de genes de resistencia a bacterias en humanos. microbioma y
posiblemente al medio ambiente.
3. Mejoras introducidas a los vectores plasmídicos
La disminución del tamaño del plásmido mejora la eficiencia de la transfección, lo que sugiere
que minimizar la longitud del vector debería ser uno de los objetivos del diseño de vectores
no virales.
Para optimizar los vectores de ADN plasmídico para la terapia génica implicaron primero la
eliminación de genes de resistencia a los antibióticos, aumentando así el potencial clínico.
Uno de los primeros sistemas fue la titulación del operador represor (TRO). Los plásmidos
ORT (pORT) contienen una o más secuencias operadoras que se utilizan para valorar,
mediante competición, proteínas represoras.
pORT se ha utilizado eficazmente en estudios preclínicos y clínicos como vacuna de ADN y
como componente de vacunas bacterianas vivas utilizando Salmonella entérica.
pCOR ha demostrado niveles más altos de actividad del gen informador en comparación con
los plásmidos disponibles comercialmente y también se ha llevado a ensayos clínicos para la
isquemia crítica de miembros.
El sistema pFAR se ha utilizado para lograr una alta expresión de luciferasa tanto en células
trasplantadas como en la piel de ratones. En ambos casos, los vectores pFAR mostraron mayor
expresión génica y persistencia que los vectores plasmídicos estándar.
4. Minivectores y Minicirculos
- Minivectores
Los minivectores son vectores de ADN no virales minimizados, se sintetizan a partir de un
plásmido original mediante recombinación específica de sitio. Al codificar solo la carga útil
genética y las secuencias de integración cortas, los minivectores pueden diseñarse tan
pequeños como ~ 350 bp y generarse con altos rendimientos. Las secuencias bacterianas no
deseadas están en un miniplasmido descartado. El sistema de recombinación y purificación
utilizado para fabricar minivectores está altamente optimizado, lo que resulta en una
contaminación de plásmidos hasta 100 veces menor que la recomendada por las agencias
reguladoras de la salud.

- Minicirculos
Las secuencias bacterianas, y en particular ori, tienen el potencial de desencadenar
inflamación o silenciar transgenes. La eliminación de estas secuencias extrañas adicionales
fue informada por primera vez en 1997 por Darquet et al. Estos investigadores utilizaron la
recombinación específica del sitio para convertir los plásmidos parentales en minicírculos,
que contienen las secuencias terapéuticas deseadas y solo segmentos muy cortos de ADN
bacteriano.
El resto del ADN bacteriano del plásmido principal, incluido ori, se recombina en un
miniplasmido descartado. Debido a que los minicírculos ya no contienen ori, no pueden
replicarse en bacterias y, por lo tanto, ya no se consideran plásmidos.
Se han utilizado múltiples sistemas de recombinasa para generar minicírculos, incluida la
integrasa del fago λ, la recombinasa phiC31, la recombinasa Flp, la resolvasa ParA y la
recombinasa Cre.
Los miniplasmidos codifican ori y, por lo tanto, todavía se denominan plásmidos.
 5. Aplicaciones de la terapia génica para tratamiento de diferentes enfermedades. cáncer,
células madres, terapia pulmonar, dermatológico.
Cáncer e inmunoterapia
Los vectores plasmídicos y, en al menos un caso, los vectores de ADN minimizados, se han
utilizado con éxito para administrar terapias génicas contra el cáncer:

- Wu et al. utilizaron minicírculos para inducir la expresión de interferón-γ en células de

carcinoma nasofaríngeo. La expresión de interferón-γ tuvo un profundo efecto
antiproliferativo in vitro y un efecto antitumoral
- Los sistemas de vectores de tamaño mínimo (MIDGE) se han utilizado con éxito tanto
preclínicamente como clínicamente como vacunas de ADN contra cánceres en estadio
avanzado junto con moléculas inmunomoduladoras de doble vástago (dSLIM) que sirven
como adyuvantes inmunes eficaces.
- Zhao et al. mostraron el potencial de los minivectores que codifican el ARN en horquilla corto
(ARNhc) contra la quinasa del linfoma anaplásico (ALK), mayor eficiencia de transfección
y capacidad de silenciamiento génico de minivectores en comparación con el plásmido, y
equivalencia del silenciamiento génico en comparación con el ARNip.
- Los minicírculos también se utilizaron recientemente para diseñar células T con el transposón
de la Bella Durmiente y se utilizaron además para administrar anticuerpos biespecíficos, lo
que permite que las células T destruyan los linfomas de células B.
- Los minicírculos también se han incorporado a los sistemas de detección del cáncer, donde
se utilizan como activadores de tumores para facilitar la detección de biomarcadores
sanguíneos endógenos.
Reprogramación de células madre
Se pueden usar vectores de ADN minimizados para reprogramar células somáticas para la
generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
Jia et al. creó un minicírculo policistrónico ligado a 2ª con genes de factores de
reprogramación Lin28, Oct4, Sox2 y Nanog, con GFP como informador. Este grupo pudo
inducir pluripotencia en células madre adiposas humanas. Las iPSC reprogramadas con ADN
de minicírculo formaron cuerpos embrioides en cultivo y teratomas en ratones
inmunodeficientes.
Daneshvar et al. creó iPSC a partir de células madre mesenquimales del cordón umbilical
utilizando minicírculos con los mismos cuatro factores de reprogramación, pero sin la
necesidad de una capa de células alimentadoras que suministren nutrientes adicionales y
factores de reprogramación.
Fernandes y Chari diseñaron células madre neurales para secretar factor neurotrófico derivado
del cerebro (BDNF) utilizando nanopartículas magnéticas junto con un minicírculo o ADN
plásmido.
Terapia para los pulmones
La impenetrabilidad de la capa mucosa del pulmón a los vectores de terapia génica (virales o
no virales). Los sistemas de vectores minimizados tienen el potencial de llegar a los pulmones
porque los minivectores de ADN desnudo de menos de 1200 pb pueden aerosolizarse.
Los minicírculos se han utilizado eficazmente tanto in vitro como in vivo para apuntar a las
células epiteliales pulmonares con aumento de GFP (eGFP), luciferasa de luciérnaga (Luc) o
DNAH5, que codifica una proteína del brazo de dineína externa implicada en la discinesia
ciliar primaria.
Los minicírculos que llevan estos genes muestran niveles más altos de expresión génica en
comparación con los plásmidos, reduce el número de tratamientos terapéuticos necesarios.
Menos administraciones de vectores reducen el potencial de respuestas inmunes adaptativas,
como se observa con el uso de vectores virales o plásmidos.
En este sentido, la reducción de CpG en los vectores plasmídicos o el uso de plásmidos libres
de CpG permite la administración repetida a los pulmones sin causar toxicidad o
inmunogenicidad.
Los vectores minimizados, como los minivectores, no contienen motivos CpG (a menos que
se agreguen específicamente como parte del diseño). Además, el tamaño nanométrico (~ 5
nm × 5 nm × 45 nm) de los minivectores superenrollados evitan que se atasquen en la capa
mucosa, lo que les permite penetrar en las células y mejorar los resultados de la terapia
pulmonar.
Dermatológico.
Una aplicación de la terapia génica de la piel es la cicatrización de heridas en diabéticos,
específicamente mejorando la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF). VEGF desencadena el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, lo que aporta más
factores de curación a una herida.
Yoon y col. mejoró la cicatrización de heridas en ratones diabéticos mediante la inyección
subcutánea de vectores que expresan VEGF en una solución de microburbujas, y luego
forzando la transfección haciendo estallar las burbujas con ultrasonido.
Se pueden aplicar tratamientos con vectores de ADN para la psoriasis, una enfermedad
autoinmune de la piel causada por inflamación crónica y angiogénesis desregulada.
La expresión de un gen que inhibe el factor de crecimiento transformante β previene la
angiogénesis aberrante que puede tratar no solo la psoriasis, sino también mejorar la
cicatrización de heridas en la córnea, se utiliza la aplicación tópica de un vector, lo cual es
teóricamente posible.
References
Hardee, C. L., Arévalo-Soliz, L. M., Hornstein, B. D., & Zechiedrich, L. (2017). Advances
in Non-Viral DNA Vectors for Gene Therapy. Genes, 8(2), 65.
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