1.

INTRODUCCIÓN
1.1 GENERALIDADES

Desde 1990 más personas han muerto por enfermedades coronarias

que por alguna otra causa. Se estima que 17 millones de personas mueren por
enfermedades cardiovasculares al año en el mundo, particularmente por
infartos cardiovasculares y cerebrales. Más del 60% de la población mundial
con enfermedades coronarias pertenece a países desarrollados (WHO, 2005;
Thom et al., 2006). En México, las enfermedades del corazón son la principal
causa de defunción, siendo la aterosclerosis la causa más importante de
enfermedades cardiacas, donde la elevada concentración sanguínea de
colesterol juega un papel muy importante (Krieger, 1998; INEGI, 2006). En
países desarrollados, al menos una tercera parte de las enfermedades
cardiovasculares son atribuidas a factores de riesgo: uso de tabaco, uso de
alcohol, presión alta, colesterol alto, diabetes y obesidad. Se ha encontrado
que el uso del tabaco induce a enfermedades cardiovasculares al promover el
daño al endotelio de vasos sanguíneos, incrementando las placas de colesterol
(depósitos grasos en las arterias). Se estima que un 82% del incremento en la
mortalidad en enfermedades coronarias ocurrirá en países desarrollados
(WHO, 2005).

A pesar de que el colesterol es necesario para realizar muchas

funciones de nuestro organismo, estudios epidemiológicos y experimentales
han demostrado que existe una fuerte correlación entre las concentraciones
elevadas de colesterol en la sangre con la frecuencia de enfermedades
cardiovasculares y de aterosclerosis en el hombre (Libby et al., 2000). El riesgo
de aparición de una enfermedad cardiovascular por cifras elevadas de
colesterol en sangre se ha relacionado con las LDL-colesterol (lipoproteínas de
baja densidad) y HDL-colesterol (lipoproteínas de alta densidad). El riesgo de
padecer aterosclerosis se incrementa con el aumento de la concentración de
las LDL-colesterol, mientras que es inversamente proporcional a los niveles de
HDL-colesterol (Krieger, 1998).

1
1.2 ESTRUCTURA QUÍMICA DEL COLESTEROL

El colesterol es un lípido, que pertenece a los esteroles. En la figura 1 se

muestra la molécula de colesterol, formada por 27 átomos de carbono, 46 de
hidrógeno y uno de oxígeno, dispuestos en anillos unidos entre sí, tres anillos
cíclicos hexagonales y uno pentagonal, una cadena lateral ramificada en la
posición 17, con grupos metilo en las posiciones 10 y 13, y un doble enlace en
la posición 5, además tiene un grupo hidroxilo en la posición 3 (Mathews et al.,
2000). El único grupo polar del colesterol es el hidroxilo en tanto que los anillos,
metilos y la cadena hidrocarbonada son los que le confieren a la molécula la
propiedad hidrofóbica

Figura 1. Estructura del colesterol

1.3 FUNCIONES FISIOLÓGICAS DEL COLESTEROL

El colesterol es el principal esterol en los mamíferos incluyendo a los

humanos, por lo tanto, existe en los alimentos de origen animal y se concentra
en la fracción lipídica de los alimentos de este origen, tiene especial
importancia principalmente para la formación de membranas, ya que la
proporción entre colesterol y fosfolípidos de la membrana es importante para
determinar la fluidez de las membranas celulares. El cuerpo también sintetiza
su propio colesterol llamado colesterol endógeno, casi todo el colesterol
endógeno que circula en las lipoproteínas del plasma se forma en el hígado,
pero todas las células del cuerpo sintetizan al menos algo de colesterol

2
(Campbell y Farell, 2004). Aproximadamente, la mitad del colesterol del
organismo se origina de su síntesis y el resto es proporcionado por una
alimentación promedio; el hígado sintetiza más o menos 50% del total, el
intestino cerca de 15% y la piel una gran proporción del resto (Murray et al.,
1988). El uso no membranal más abundante del colesterol en el organismo es
la formación de ácido cólico y el ácido quenodesoxicólico (ácidos biliares) en el
hígado, éstos se conjugan con otras moléculas para formar sales biliares, lo
que favorece la digestión y absorción de grasas. La biosíntesis de ácidos
biliares es el principal destino metabólico del colesterol aunque, una pequeña
cantidad de colesterol la utilizan: a) las glándulas suprarrenales para formar
hormonas corticosuprarrenales; b) los ovarios para formar progesterona y
estrógeno; c) los testículos para formar testosterona (Krieger, 1998; Devlin,
2002); y d) la piel para la formación de provitamina D (Krieger, 1998; Nelson y
Cox, 2000).

1.4 BIOSÍNTESIS DEL COLESTEROL

La biosíntesis de colesterol requiere una fuente considerable de átomos de

carbono y una fuente reductora. Todos los átomos de carbono se derivan del
acetato, la fuente reductora en forma de NADPH la proporciona principalmente
la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de
la ruta de las pentosas fosfato (Devlin, 2002).

La vía de biosíntesis del colesterol se realiza en el citosol y en el retículo

endoplásmico, ésta ocurre en tres etapas (Figura 2). La primera etapa se
refiere a la conversión de acetil CoA en el intermediario 3-hidroxi-3-metilglutaril
CoA (HMG CoA), esta primera etapa de la reacción ocurre en el citosol. Dos
moléculas de acetil CoA se condensan para formar acetoacetil CoA en una
reacción catalizada por la acetoacetil CoA sintetasa, en el siguiente paso se
introduce una tercera molécula de acetil CoA formando la HMG-CoA ésta
reacción es catalizada por la HMG CoA sintetasa, la HMG CoA que se forma
está presente en el citosol y es metabólicamente distinta de la que se forma en
la mitocondria para síntesis de cuerpos cetónicos (Montgomery et al., 1996). La
siguiente etapa de la síntesis de colesterol es la conversión de HMG CoA a

3
escualeno, en el primer paso, la HMG CoA se reduce a mevalonato, donde el
grupo tioéster de la HMG CoA se convierte a alcohol utilizando 2 moléculas de
NADPH, la reacción es catalizada por una importante enzima del retículo
endoplásmico, la HMG CoA reductasa, ésta enzima cataliza la reacción que
regula la biosíntesis del colesterol y se inhibe por altos niveles de colesterol. El
papel central de la HMG CoA reductasa en la homeostasis del colesterol, ha
sido evidenciado por la efectividad de una familia de fármacos denominados
estatinas (lovastatina, pravastatina, fluvastatina, cerivastatina, atorvastatina,
etc.), que inhiben la actividad de la HMG CoA reductasa, particularmente en el
hígado y bajan el colesterol total del plasma hasta en un 50% (Devlin, 2002).
Después, el mevalonato se convierte a escualeno a través de intermediarios
activados, el mevalonato se activa mediante tres fosforilaciones sucesivas y
una descarboxilación para dar isopentenilpirofosfato, luego una molécula se
isomeriza a dimetilalil pirofosfato y se combina con otra molécula de isopentenil
pirofosfato para dar geranil pirofosfato que reacciona con otra molécula más de
isopentenil pirofosfato para dar farnesil pirofosfato, estas reacciones ocurren en
el citosol. Posteriormente, la escualeno sintasa une dos moléculas de este
último para dar preescualeno pirofosfato que sufre la eliminación del pirofosfato
para dar el escualeno. Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la
ciclización del escualeno a lanosterol y la conversión de lanosterol en
colesterol, y esto ocurre en el retículo endoplásmico (Mathews et al., 2000).

Figura 2. Biosíntesis del colesterol

4
1.5 LIPOPROTEÍNAS Y SU RELACIÓN CON EL COLESTEROL

Los lípidos más abundantes del cuerpo humano son el colesterol, ésteres de
colesterol, triacilglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos libres. Debido a que los
lípidos son insolubles en agua, se requiere de proteínas especializadas para su
transporte y distribución en los diferentes órganos y tejidos corporales,
llamadas lipoproteínas. Se han descrito diversos tipos de lipoproteínas, cada
una de ellas, desempeña funciones concretas en el transporte de lípidos. Estas
lipoproteínas se clasifican en función de su densidad, determinada mediante
centrifugación (Campbell y Farell, 2004). Las lipoproteínas de cada clase
contienen apoproteínas características y poseen una composición química
distintiva en proteínas, triacilgliceroles, colesterol libre, ésteres de colesterol y
fosfolípidos. La clasificación de las lipoproteínas incluye: quilomicrones,
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad
intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta
densidad (HDL). En la figura 3, se muestra un esquema general de una
lipoproteína.

Figura 3. Estructura general de una lipoproteína. Modificado de Mckee y Mckee, 2003.

Las lipoproteínas son partículas hidrosolubles parecidas a micelas que

consisten de un núcleo no polar de triacilgliceroles y ésteres de colesterol,
rodeados por una monocapa de fosfolípidos y colesterol. Las proteínas

5
específicas se encuentran incrustadas en la membrana lipídica (Voet y Voet,
2004). Todas las lipoproteínas comparten características estructurales
comunes, especialmente una forma esférica que puede detectarse mediante
microscopía electrónica (Montgomery et al.,1996; Mathews et al., 2000) (Figura
3).

1.6 TRANSPORTE DEL COLESTEROL

Tras una ingesta de comida rica en grasas, el colesterol presente en la dieta

se incorpora dentro de micelas (quilomicrones) que se forman en combinación
con la bilis, producida en el hígado, almacenada en la vesícula biliar y
secretada al intestino delgado en respuesta a alimento con contenido graso.
Estas micelas contienen ácidos biliares conjugados (sales biliares), fosfolípidos
y colesterol. Los ésteres de colesterol presentes en la comida son hidrolizados
en las micelas por la colesterol esterasa, enzima secretada por el jugo
pancreático. El colesterol entonces se absorbe por el intestino delgado donde
se esterifican nuevamente, y es incorporado en las lipoproteínas llamadas
quilomicrones (Horton et al., 2006), éstas son secretadas vía ducto linfo-
torácico a la sangre y liberadas a los tejidos; este proceso es llamado ruta
exógena de transporte lipídico, porque los lípidos provienen del exterior del
organismo. La lipoproteín lipasa (LPL) actúa sobre los quilomicrones
circulantes en sangre, principalmente sobre los triacilglicéridos, reduciendo la
relación de triglicéridos: colesterol. Los quilomicrones remanentes son
absorbidos por el hígado, donde los lípidos y las lipoproteínas se degradan
(Figura 4).

Figura 4. Transporte exógeno de lípidos. TG, triacilglicéridos; COL, colesterol; LPL,

lipoproteín lipasa; AGL, ácidos grasos libres. Modificado de Montgomery et al., 1996.

6
 Los lípidos absorbidos por el hígado, vía quilomicrones remanentes, son
enzimáticamente digeridos y reensamblados dentro de nuevas partículas de
lipoproteínas; además, el hígado sintetiza lípidos “de novo”. Éstos, se combinan
con apoproteínas hepáticas y son secretados a la sangre como lipoproteínas
de muy baja densidad (VLDL). A través de la acción de la LPL sobre los
triacilglicéridos, las VLDL nacientes se convierten a remanentes. Después de la
liberación de los ácidos grasos a tejidos periféricos, muchas de las VLDL
remanentes son recolectadas por el hígado; la liberación de colesterol y
triacilglicéridos por las VLDL a tejidos extrahepáticos vía circulación sanguínea
forma parte de la ruta endógena de transporte de lípidos (Figura 5). Los
remanentes de las VLDL que no fueron absorbidos por el hígado sufren de
nuevo una lipólisis convirtiéndose en lipoproteínas de densidad intermedia
(IDL) que se transforman después en lipoproteínas de baja densidad (LDL).
Una fracción significativa de IDL y LDL es captada por el hígado, sin embargo,
aproximadamente el 60% de las LDL es recolectada por tejidos periféricos
(Montgomery et al., 1996; Krieger, 1998).

Figura 5. Transporte endógeno de lípidos. VLDL, lipoproteínas de muy baja densidad; IDL,
lipoproteínas de densidad intermedia; TG, triacilglicéridos; COL, colesterol; LPL, lipoproteín lipasa;
AGL, ácidos grasos libres. Modificado de Montgomery et al., 1996.

Aunque todos los tejidos del organismo son capaces de sintetizar su propio
colesterol, la incorporación de LDL es la forma preferente para abastecerse de

7
colesterol. La captación del colesterol de las LDL por las células, es mediante
la acción de un receptor específico llamado receptor de LDL y el mecanismo
por el cual sucede, se conoce en general como endocitosis mediada por el
receptor. Los receptores están agrupados en una invaginación rica en clatrina,
una proteína capaz de formar una estructura en forma de jaula. La endocitosis
se lleva a cabo cuando las LDL se unen a su receptor, mediante el
reconocimiento de la apoproteína B-100 por parte del receptor. La LDL se
engloba y es captada por la célula (Figura 6). La membrana plasmática se
fusiona en la proximidad del complejo LDL-receptor, y la invaginación se
convierte en una vesícula endocítica. Varias de estas vesículas revestidas de
clatrina se fusionan para formar un endosoma. El endosoma se fusiona
entonces con un lisosoma, con lo que el complejo LDL-receptor se pone en
contacto con las enzimas hidrolíticas del lisosoma. La apoproteína de las LDL
se hidroliza en sus aminoácidos, y los ésteres de colesterol se hidrolizan para
dar colesterol libre. El receptor se recicla, y vuelve a la membrana plasmática
para captar más LDL.

Figura 6. Participación de los receptores de LDL en la captación y metabolismo del

colesterol. ACAT: colesterol acil transferasa, LDL: lipoproteína de baja densidad. Modificado de
Mathews y Van Holde, 1998.

8
 Gran parte del colesterol liberado se desplaza hacia el retículo
endoplásmico liso, en donde se utiliza para la síntesis de las membranas. El
colesterol internalizado, además ejerce algunos efectos reguladores, por medio
de los cuales se controla la cantidad de colesterol que se internaliza en cada
célula como: 1) la supresión de la síntesis endógena de colesterol por la HMG
CoA reductasa. La inhibición farmacológica de esta enzima ha sido muy exitosa
para disminuir los niveles plasmáticos de colesterol (Devlin, 2002), 2) la
activación de la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa (ACAT), enzima
que se encuentra en el reticulo endoplásmico rugoso y cataliza la formación
intracelular de ésteres de colesterol y tienen un papel clave en el balance
intracelular de colesterol, en la absorción intestinal de colesterol y en la
secreción hepática de VLDL. Las moléculas que inhiben a esta enzima son un
blanco terapéutico muy efectivo contra la aterosclerosis (Chang et al., 2006), 3)
regulación del propio receptor de LDL, proceso que explica el por qué de una
regulación tan exacta de las concentraciones intracelulares de colesterol
(Mathews et al., 2000).

Bajo circunstancias normales, el exceso de colesterol se puede acumular en

las membranas de las células de tejidos extrahepáticos. Este colesterol puede
ser regresado al hígado vía HDL, en un proceso llamado transporte reverso de
colesterol. Las HDL adquieren el colesterol no esterificado (colesterol libre) de
las células, y una enzima llamada lecitin-colesterol-aciltransferasa (LCAT)
actúa sobre el colesterol en las HDL para formar ésteres de colesterol. Los
ésteres de colesterol pueden ser transferidos de las HDL a las VLDL por la
proteína que transfiere ésteres de colesterol (CETP) (Figura 7).

Además, las HDL pueden proveer de colesterol a las glándulas productoras de

hormonas esteroideas.

9
Figura 7. Transporte reverso de colesterol. CL, colesterol libre; EC, colesterol esterificado;
LCAT, lecitin colesterol acil transferasa; CETP, proteína que transfiere esteres de colesterol.: LPL,
lipoproteín lipasa. Modificado de Montgomery et al., 1996.

1.7 ELIMINACIÓN DE COLESTEROL Y CIRCULACIÓN ENTEROHEPÁTICA

El humano no tiene la capacidad de degradar núcleos esteroideos, el

colesterol y otros esteroides no pueden ser degradados a moléculas pequeñas,
sino que, se convierten en derivados con mejores propiedades de solubilidad,
permitiendo su excreción. El mecanismo más importante para la eliminación del
colesterol es la síntesis de ácidos biliares que ocurre en el hígado. La
conversión de colesterol a 7-α-hidroxicolesterol catalizada por la Colesterol 7-
α-hidroxilasa, es el paso limitante en la síntesis de ácidos biliares, importantes
componentes de la bilis, junto con el colesterol, los fosfolípidos y los pigmentos
biliares (McKee y McKee, 2003). Así el colesterol hepático puede ser excretado
en la bilis como ácido biliar o como colesterol libre, donde puede sufrir
reabsorción por el hígado o bien ser excretado por heces. La mayoría de los
ácidos biliares, secretados en el duodeno, se reabsorben en el íleon y vuelven
al hígado para ser excretados de nuevo en la bilis, a este ciclo se le conoce
como circulación enterohepática (Figura 8); el restante que no es absorbido, es
excretado en heces (Mathews et al., 2000). Sobre el colesterol actúan las
bacterias intestinales y se convierte a otro esterol neutro, antes de que éste sea
excretado en heces. En humanos, los principales esteroles neutros en heces

10
son el coprostanol y la colestanona. Otro esterol neutro excretado en heces es
el colestanol (Murray et al., 1988).

La conversión de colesterol a ácidos biliares en hígado es la principal vía de

mayor eliminación de colesterol, la estimulación de este proceso da como
resultado respuestas adaptativas que promueven la síntesis de colesterol
hepático y la endocitosis mediada por receptor de LDL, induciendo a la
reducción de LDL colesterol en plasma, esto ha mostrado ser benéfico en la
prevención de enfermedades del corazón (Gälman et al., 2003). Por otro lado,
la inhibición de la Colesterol 7-α-hidroxilasa está relacionada con la
aterosclerosis y padecimientos de cálculos biliares (Soudi et al., 1998).

Figura 8. Circulación enterohepática de ácidos biliares (AB) y colesterol (C).

Modificado de Newshole y Leech, 1983.

1.8 ENFERMEDADES NO GENÉTICAS CAUSADAS POR LA

HIPERCOLESTEROLEMIA

ATEROSCLEROSIS

La aterosclerosis es el proceso patológico causado por la acumulación de

colesterol en la pared de una arteria, donde éstas se obstruyen en mayor o
menor grado por la formación de depósitos de placas de colesterol, lo cual

11
conduce a infartos cardiacos y cerebrales. La hipercolesterolemia es uno de los
principales factores de riesgo para la aterosclerosis (Montgomery et al., 1996).
En la formación de placas ateroscleróticas, el cual es un proceso progresivo,
degenerativo, participan además, células del músculo liso, macrófagos y varios
restos de células. Como los macrófagos se llenan con lípidos
(predominantemente colesterol y ésteres de colesterol derivados de depósitos
de LDL), éstos toman apariencia espumosa, de ahí el nombre de células
espumosas (Figura 9) se secretan factores que aumentan la proliferación de
células musculares. Finalmente, las placas ateroscleróticas pueden calcificar y
sobresalir suficientemente dentro de la arteria impidiendo el flujo sanguíneo
(McKee y McKee, 2003).

Figura 9. Corte de una arteria con aterosclerosis (Internet 1)

COLELITIASIS
La presencia de cálculos biliares es llamada colelitiasis. La mayoría de las
piedras que se forman en adultos son predominantemente de colesterol. El
colesterol es solubilizado en la bilis por asociaciones moleculares con sales
biliares y fosfatidilcolina para su transporte por el tracto biliar, la cantidad de
colesterol que puede estar en estos agregados micelares depende de la
cantidad de sales biliares y fosfatidilcolina, así como de la cantidad de agua
contenida en la bilis. Una composición anormal de bilis secretada por el hígado

12
puede causar cristalización del colesterol y formación de piedras, por lo tanto la
cristalización del colesterol es resultado de que la bilis es incapaz de solubilizar
todo el colesterol (Montgomery et al., 1996).

1.9 TRATAMIENTOS CONTRA LA HIPERCOLESTEROLEMIA

Como la hipercolesterolemia implica básicamente un incremento de las

LDL-colesterol, se han buscado y diseñado moléculas con actividad
hipocolesterolemiante con la finalidad de que causen una disminución de las
LDL-colesterol en la sangre, dentro de ellos están: a) los inhibidores naturales y
sintéticos de la HMG-CoA reductasa, las estatinas, que reducen las
concentraciones de LDL-colesterol (Istvan y Deisenhofer, 2001), b) los
secuestrantes de ácidos biliares, como colestipol y colestiramina, que impiden
la reabsorción de las sales biliares al combinarse con ellas, incrementando así
su pérdida fecal (Benson, et al., 1993), c) la niacina, que es el agente más
potente para incrementar los niveles de HDL (Piepho, 2000), d) los fibratos, que
ejercen parte de su efecto hipolipidémico por el desvío de la utilización de
ácidos grasos libres en el hígado de las vías de esterificación a las de
oxidación, reduciendo así la secreción hepática de triacilgliceroles y colesterol
en las VLDL (Murray et al., 1988; Denke, 2004). Por otra parte, la inhibición
intracelular en la esterificación del colesterol en los macrófagos, como una
manera de prevenir la acumulación de ésteres de colesterol en las arterias, ha
sido considerada por la comunidad científica como una estrategia con gran
potencial aunque se han obtenido resultados contradictorios. Actualmente,
existen datos que sugieren que una estrategia para el tratamiento de
enfermedades del corazón relacionadas con la hipercolesterolemia, puede ser
la inhibición específica de la ACAT-2 (Rudel et al., 2005).

Pero, a pesar de que se han diseñado y probado una gran cantidad de

compuestos hipocolesterolemiantes, algunos de los cuales han dado resultados
alentadores, el problema de la aterosclerosis aún no ha sido resuelto.

13
1.10 α-ASARONA

Dentro de los compuestos probados con la finalidad de obtener una buena

actividad hipocolesterolemiante, se encuentra la α-asarona (Figura 10a). En
estudios realizados en el Laboratorio de Enzimología del Departamento de
Bioquímica, se obtuvieron los siguientes resultados cuando se probó a la α-
asarona en ratas macho con una dieta hipercolesterolémica: el colesterol total
se redujo en un 30%, las LDL-colesterol se redujeron en un 74.7%, la
concentración de colesterol biliar se redujo en 29.1%, la concentración de
ácidos biliares aumentó en 8%, el flujo biliar aumentó en 70.4%, las
secreciones de colesterol y de ácidos biliares aumentaron en un 56 y 93%
respectivamente, además de que el índice de saturación de colesterol se redujo
(Rodríguez-Páez et al., 2003). Todo esto, hace a esta molécula, excelente
contra la hipercolesterolemia, aunque su uso farmacológico, se ha restringido
por la toxicidad que presenta (Chamorro et al., 1993; Chamorro et al., 1994;
Hasheminejad y Caldwell, 1994).

Por otro lado, se han probado varios análogos de la α-asarona con la

finalidad de mejorar el efecto hipocolesterolemiante (Aquino, 2003; Calvo,
2003; Orduña, 2003; Jiménez, 2004) y disminuir su toxicidad, pero aún no se
ha logrado este objetivo.

El ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (Figura 10b) es el producto metabólico

principal de la α-asarona, que podría ser empleado en la clínica, por no
presentar efectos tóxicos como la α-asarona (Hasheminejad y Caldwell, 1994).
Al llevar a cabo el desarrollo experimental en ratas macho con dieta
hipercolesterolémica, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico redujo el colesterol total
en un 24.5 %, las LDL-colesterol se redujeron en un 73.3%, se redujo el
colesterol biliar en un 26.6%, los ácidos biliares se redujeron en un 16.6%,
aumentó en un 30% el flujo biliar y la secreción de colesterol y ácidos biliares
aumentaron en un 15 y 54.5%, respectivamente (Antúnez, 2001). Por lo que se
demostró que el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico presenta propiedades
farmacológicas semejantes a la α-asarona.

14
Sin embargo, a pesar de la toxicidad de la α-asarona, en el Laboratorio de
Enzimología del Departamento de Bioquímica de esta Escuela, tenemos interés
en dilucidar el mecanismo de acción hipocolesterolemiante de la α-asarona y
su principal metabolito, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, ya que nos ayudaría a
entender mejor los diferentes procesos que afecta la α-asarona, en el
metabolismo del colesterol, lo que a su vez nos permitiría, tomando a la α-
asarona como molécula guía, desarrollar nuevas moléculas
hipocolesterolemiantes con blancos de acción muy definidos.

Una primera aproximación a este planteamiento ya se ha iniciado, puesto que

en estudios in vitro se ha encontrado que la α-asarona es un inhibidor
competitivo de la HMG CoA reductasa de hígado de rata (Chávez, 2004). No
obstante, es necesario profundizar en ello para proponer un mecanismo de
acción coherente con todos los procesos metabólicos en los que
aparentemente participa la α-asarona y que tiene como resultado el efecto
hipocolesterolemiante.

CH3 COOH
H3CO H 3CO

H3CO OCH3 H3CO OCH3

(a) (b)

Figura 10. Estructura molecular de la α-asarona (a) y del ácido 2,4,5-

trimetoxicinámico (b).

15
 2. JUSTIFICACIÓN

Los estudios epidemiológicos indican que, en México se ha incrementado la

mortalidad por enfermedades cardiovasculares de manera importante,
convirtiéndose en la primera causa de defunción (INEGI, 2006) y que la
ateroclerosis derivada de la hipercolesterolemia es la tercera causa de
enfermedades cardiovasculares en todo el mundo (WHO, 2005) de tal manera
que la hipercolesterolemia se ha convertido en un problema de salud pública.

La progresión de las placas ateroscleróticas en las arterias depende

principalmente de la hipercolesterolemia, básicamente por un incremento en la
concentración de las LDL-colesterol en sangre, además se ha considerado que
las HDL-colesterol tienen propiedades antiaterogénicas. Por lo tanto, el objetivo
principal en el diseño de fármacos hipocolesterolemiantes es tratar de que
estos compuestos causen disminución de las LDL-colesterol en sangre, ya que
son éstas las verdaderamente aterogénicas, y que no se afecte la
concentración de las HDL- colesterol, debido al beneficio que se obtiene de
ellas.

Sin embargo a pesar de los esfuerzos por obtener fármacos con

actividad hipocolesterolemiante, el problema de la aterosclerosis aún no se ha
resuelto. Es por esto que en el Laboratorio de Enzimología del Departamento
de Bioquímica de la ENCB del IPN se ha intensificado la investigación en esta
área.

16
 3. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Dilucidar el posible mecanismo de acción hipocolesterolemiante de la α-

asarona y su principal producto metabólico, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico
(TMC) in vitro e in vivo, a través de sus efectos sobre el metabolismo hepático
del colesterol.

OBJETIVOS PARTICULARES

1) Estandarizar y determinar la actividad de la ACAT-2 (Acil Coenzima A:

colesterol acil transferasa 2) de hígado de rata en ausencia y presencia
de la α-asarona y el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, in vitro e in vivo.

2) Estandarizar y determinar la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa de

hígado de rata en ausencia y presencia de la α-asarona y el ácido 2,4,5-
trimetoxicinámico in vitro e in vivo.

3) Determinar la actividad de la HMG CoA (Hidroxi-metilglutaril coenzima

A) reductasa de hígado de rata en ausencia y presencia de la α-asarona
y el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico in vitro e in vivo.

17
 4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 REACTIVOS

HMGCoA-14C (57.7 mCi/mmol), Oleoil CoA [ Oleoil-1-14C] (53 mCi/mmol), 4-

14
C-colesterol (56.30 mCi/mmol) se obtuvieron de NEN-DUPONT. Colesterol,
DL-3-hidroxi-3-metilglutaril CoA, colesteril oleato, oleoil CoA, 2,6-di-ter-butil-4-
metilfenol (hidroxitolueno butilado), 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, tiloxapol
(Tritón WR-1339) glucosa-6-fosfato deshidrogenada, α-asarona y el TMC, se
obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemical Company. La resina Bio-Rex® resina 5,
fue obtenida de Bio-Rad Laboratories. Las placas de aluminio cubiertas de
sílica gel 60F254 se obtuvieron de Merck. Las columnas de sílica Sep-Pak®
(500 mg) fueron de Waters. El líquido de centelleo ACS II de Amersham. Todos
los demás reactivos que se utilizaron fueron de grado analítico.

4.2 MATERIAL BIOLÓGICO

Ratas macho Wistar de 350 a 400 g de peso fueron colocadas en cámaras de

40 x 60 x 20 (5 ratas por cámara) y a temperatura ambiente. El alimento y agua
fueron ad limitum.

18
 MÉTODOS

4.3 PROCEDIMIENTO GENERAL

4.3.a Experimentos in vivo: Se formaron tres lotes de 15 ratas macho,

que se alimentaron con una dieta hipercolesterolémica ad lubitum,
(Poplawsky et al., 2000), por 7 días. Un lote fue el control, al que se le
administró el vehículo, una solución de bicarbonato de sodio al 8%, otro lote
fue tratado durante 7 días con α-asarona a una dosis de 80 mg/kg de peso
y el último lote fue tratado durante 7 días con TMC a una dosis de 80 mg/kg,
todas las soluciones fueron administradas por vía subcutánea. Al término
del tratamiento, se extrajeron los hígados y se obtuvieron los microsomas
que se guardaron en congelación a -82 ºC hasta su análisis posterior.

4.3.b Experimentos in vitro: Se extrajeron hígados de ratas macho sanas

y se obtuvieron los microsomas que se guardaron en congelación a -82 ºC
hasta su uso. En los microsomas se midieron las actividades de HMG CoA
reductasa, ACAT-2 y Colesterol 7-α-hidroxilasa en presencia y ausencia de
α-asarona y ácido 2,4,5-trimetoxicinámico.

4.3.c Preparación del alimento hiperlipidémico:

Se molieron nutricubos (alimento estándar para roedor) y con base a la
siguiente formulación, se mezclaron todos los ingredientes (Poplawsky et
al., 2000):

Formulación para 1 kg de alimento

Componentes Cantidad (g)
Nutricubos molidos 938
Colesterol 10
Colato 2
Aceite de oliva 50

19
Con ayuda de agua bidestilada se preparó una masa homogénea con la
cual se formaron canicas de 2.5 cm de diámetro, las cuales se dejaron
secar sobre una charola de aluminio por un lapso de 3-4 días, pasado este
tiempo el alimento hiperlipidémico estuvo listo para servir de alimento a las
ratas macho.

4.3.d Obtención de microsomas. Después de que los animales se

sacrificaron, se extrajeron los hígados e inmediatamente se colocaron y se
homogeneizaron en regulador A (regulador de fosfatos 0.04 M, pH 7.2, con
sacarosa 0.1 M, KCl 0.05 M, EDTA 0.03 M), se emplearon 2 mL de
regulador por gramo de hígado. La homogeneización se realizó en un
homogeneizador eléctrico modelo GKH-GT motor control, marca Glas Col.
El homogeneizado resultante se centrifugó en una centrifuga modelo RC-
5B, marca Sorvall® DUPONT Instruments a 10,000 g por 10 min,
posteriormente el sobrenadante se centrifugó nuevamente a 100,000 g por
60 min en una ultracentrífuga modelo L8-M, marca Beckman. El
sobrenadante se decantó, eliminándose el material lipídico. Los microsomas
se lavaron por resuspensión del sedimento en el regulador A y se centrifugó
a 100,000 g por 45 min. Todo el procedimiento para la obtención de los
microsomas se realizó a 4°C. El paquete microsomal lavado se congeló
lentamente y se mantuvo hasta su análisis posterior en un congelador de -
86ºC de la marca Forma Scientific. Antes de usar los microsomas, se
resuspendieron en 250 µL del regulador B (Regulador A + 10 mM de
ditiotreitol) y se determinó la concentración de proteínas por el método de
Bradford y las actividades enzimáticas correspondientes.

4.3.e Determinación de proteínas por el método de Bradford.

Reactivo de Bradford. Se disolvieron 100 mg de azul de Coomassie G250

en 50 mL de etanol al 95% y se adicionaron 100 mL de ácido fosfórico al
85%. Esta solución concentrada se diluyó en 0.8 L con agua destilada y con
filtró en papel Whatman No. 2

20
 Procedimiento:

1.-A siete tubos de 16 X 150 mm, se les colocaron las siguientes cantidades
de una solución de 0.3 mg/mL de albúmina sérica bovina (ABS): 0.0, 0.05,
0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mL respectivamente, por duplicado.

2.- A otros tubos se les adicionaron 5 µL de una solución diluida 1:2 de las
muestras de microsomas de las ratas.

3.-Se adicionó agua a cada uno de los tubos del paso 1 y 2 hasta llevarlos a
un volumen final de 1 mL.

4.- Se adicionaron 4 mL del reactivo de Bradford a cada tubo y se agitó.

5.-Después de 15 min a 1 hora se leyeron las absorbancias de las muestras

en un espectrofotómetro a 595 nm y se determinó la concentración de
proteína microsomal de las muestras, utilizando la curva tipo preparada.

4.4 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA HIDROXI-METILGLUTARIL

COENZIMA A REDUCTASA (HMG CoA REDUCTASA) (Alberts et al., 1980;
Edwards et al., 1979).

4.4.a Medición de la actividad de la HMG CoA reductasa. Se descongeló la

preparación microsomal. Una vez descongelada se activó a 37°C durante 30
min. Se preparó la mezcla de reacción que contenía en 100 μL: regulador de
fosfatos 0.14 M, pH 6.8; KCl 0.18 M, EDTA 3.5 mM, pH 7; ditiotreitol 10 Mm,
albúmina sérica bovina a una concentración final de 0.1 mg/mL, DL- HMG CoA-
14C 0.04 µCi; 50 µM de HMG CoA, y 30 µL de la preparación enzimática. Se
preincubó esta mezcla 5 min a 37°C. La reacción se inició con la adición de 0.2
mM de NADPH, se incubó 60 min a 37°C. La reacción de detuvo con la adición
de 20 µL de HCl 5 M. Se incubó 30 min más a 37°C, se eliminó la proteína
precipitada por centrifugación a 10,000 g por 15 min, en una microcentrifuga

21
modelo Micro Centaur, marca Sanyo, se pasó el sobrenadante por una
columna de 0.5 X 5 cm de resina Bio-Rex, previamente equilibrada con agua
desionizada. Se eluyó con agua desionizada y se colectaron los primeros 3 mL
a los que se les adicionaron 15 mL de líquido de centelleo ACS II. Se leyó la
radiactividad asociada a las fracciones colectadas que contienen el producto de
la reacción enzimática (mevalonato), en un contador de centelleo líquido
Beckman modelo LS6500. Una unidad de HMG CoA reductasa es la cantidad
de enzima que produce un pmol de mevalonato por min, bajo las condiciones
experimentales.

Para la determinación de la actividad HMG CoA reductasa in vitro, los

compuestos α-asarona y TMC se disolvieron en dimetilsulfóxido al 80% y se
probaron diversas concentraciones de los compuestos mencionados para
obtener la cinética correspondiente. Se utilizó un control positivo conteniendo
dimetilsulfóxido al 80%.

4.4.b Fundamento de la reacción:

La determinación de la actividad se basa en la cuantificación del producto
14
marcado con C, mevalonato, que se forma de la reacción catalizada por la
14
HMG CoA reductasa, que utiliza HMG CoA marcada con C y NADPH como
sustratos. La reacción es la siguiente:

O
C SCoA H2C OH

CH2 CH2
Hidroxi-metilglutaril Co A
reductasa
HO C* CH3 + 2 NADPH HO C* CH3 + CoA SH + 2 NADP

CH2 CH2

COOH COOH

Hidroxi-metilglutaril Co A Mevalonato

22
4.5 DETERMINACIÓN DE ACIL COENZIMA A: COLESTEROL ACIL
TRANSFERASA (ACAT) (Ligeramente modificada de Gillett y Owen, 1992).

4.5.a Reactivos:
a. Regulador de fosfatos de potasio 0.1 M, pH 7.4 con glutatión reducido 1
mM.
b. Albúmina sérica bovina: 20 mg/mL en el regulador de fosfatos.
c. Solución madre de colesterol/Tritón WR-1339: 33.4 mg de colesterol y 1
g de tritón WR-1339 en 10 mL de acetona.
d. Solución de trabajo de colesterol/Tritón WR.1339. Esta solución se
preparó diariamente para 10 determinaciones. Se adicionó 1 mL de
regulador (a) a un tubo con tapón de rosca, se pesó y calentó a 60°C. La
solución (c) se calentó a 60ºC para asegurar que el colesterol se
disolviera. Se adicionaron 60 µL de la solución (c) al regulador (a), gota a
gota mientras se agitaba en un “vortex”. Se eliminó la acetona por
calentamiento en baño maría a 50-55ºC. Se volvió a pesar el tubo para
calcular la cantidad de agua perdida; se reemplazó adicionando agua,
gota a gota, mientras se agitaba en un “vortex”. La solución resultante fue
transparente (soluciones turbias daban resultados falsos negativos por lo
que se descartaron) y cada mL contenía 520 nmoles de colesterol y 6 mg
de Tritón WR-1339.
e. 1-14C-oleoil Co A (5000 dpm/nmol): 1 mM en regulador de fosfato de
potasio 0.01M, pH 6.0. Se diluyó la oleoil CoA marcada (50-60 µCi/µmol
almacenada en atmósfera de nitrógeno a –80°C para evitar su
descomposición) con oleoil CoA no marcada, justo antes de usar.

4.5.b Determinación de la actividad de ACAT-2. A cada tubo con tapón de

rosca, se adicionó 200-300 µg de proteína microsomal, 50 µL de albúmina
bovina y 100 µL de la solución de trabajo de colesterol/TritónWR-1339. Se
completó a 0.18 mL con el regulador de fosfatos (solución a) y los tubos se
preincubaron a 37°C por 30 min. Se inició la reacción y se adicionó, a intervalos
14
de 15 seg, 20 µL de C-oleoil CoA a cada tubo y se mezcló. Después de
exactamente 10 min, se detuvo la reacción en el primer tubo con la adición de 4

23
mL de la mezcla cloroformo-metanol (2:1, v/v) conteniendo 40 µg de colesteril-
oleato como acarreador. Éste último procedimiento se repitió a intervalos de 15
seg para los otros tubos. Se adicionaron 0.8 mL de agua, se mezcló y
centrifugó en una centrifuga analítica marca Clay Adams a 4000 g por 15 min
para separar y clarificar las fases clorofórmica y acuosa. Se eliminó la fase
superior y las proteínas desnaturalizadas de la interfase por aspiración. Los
14
ésteres de C-colesterol se separaron de la fase inferior por cromatografía en
capa fina, después de concentrar casi a sequedad en baño María a 50-55°C.
Se utilizaron placas de aluminio cubiertas de sílica gel G de 10 X 20 cm. Cada
placa se dividió en 10 carriles. El solvente se preparó aproximadamente una
hora antes del desarrollo cromatográfico, que es una mezcla de hexano: éter
dietílico: ácido acético, 90:20:1 (v/v/v). Se desarrolló hasta 1 cm del tope de la
placa. Después, se secó por 5 min aproximadamente, y se reveló con yodo.
Las posiciones de los ésteres de colesterol y colesterol libre se marcaron por
comparación con estándares. Los valores de Rf fueron 0.80 y 0.15,
respectivamente. Se dejó sublimar el yodo. Cada mancha se cortó con tijeras y
se transfirió a viales a los que se les adicionó 15 mL de líquido de centelleo
ACS II. Se agitó y se midió la radiactividad de los ésteres de colesterol. La
actividad de la ACAT-2 se expresó como pmol de oleato de colesterilo formado
por min por mg de proteína.

Para la determinación de la actividad ACAT-2 in vitro, los compuestos α-

asarona y TMC se disolvieron en dimetilsulfóxido al 80% y se probaron
diversas concentraciones de los compuestos mencionados para obtener la
cinética correspondiente. Se utilizó un control positivo conteniendo
dimetilsulfóxido al 80%.

4.5.c Fundamento de la reacción:

La determinación se basa en la cuantificación de ésteres de colesterol
14
marcados radiactivamente con C, que se forman en la reacción enzimática
catalizada por la ACAT-2 presente en los microsomas y que utiliza como
14
sustratos el colesterol y la oleoil CoA marcada con C. El producto de la
reacción se separa por cromatografía en placa fina y se cuantifica en un
contador de centelleo líquido.

24
 O

H3C (CH2)7 HC CH (CH2)7 C O

HO
*
Colesterol Oleoil colesterol

Acil Coenzima A: colesterol

O Acil transferasa

H3C (CH2)7 HC CH (CH2)7 C SCoA

* Coenzima A
Oleoil CoA

4.6 DETERMINACIÓN DE COLESTEROL 7-α-HIDROXILASA (Ligeramente

modificada de Van Patten et al., 2001; De Caprio, et al., 1992).

4.6.a Medición de la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa. La mezcla

de reacción contenía en un volumen final de 0.5 mL, regulador de fosfatos de
potasio 100 mM, pH 7.4, EDTA 0.1 mM, ditiotreitol 5 mM, nicotinamida 30 mM,
300-400 µg de proteína microsomal. Por separado, se preparó una solución
que contuvo 150.4 nmol de 4-14C-colesterol y 265.1 nmol de colesterol no
marcado solubilizado en 160 µL de 2-hidroxipropil-ß-ciclodextrina al 45%
(peso/volumen). Una muestra (10 μL de la solución previamente preparada: 26
nmol de colesterol, 52 μmol/L, 9% de 2-hidroxipropil-ß-ciclodextrina,
concentración final) se adicionó a cada ensayo enzimático. La reacción se
inició por la adición de un sistema generador de NADPH (NADP 3.4 mM,
glucosa-6-fosfato 30 mM, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0.3 U) y se incubó
por 15 min a 37°C. La reacción se detuvo por la adición de 0.5 mL de KOH 1 N
conteniendo 5 µg de hidroxitolueno butilado. Se saponificó a 37°C por una hora
y se extrajeron los esteroles dos veces con 3 mL de n-hexano. Los extractos se
evaporaron a sequedad en baño maría entre 50-55ºC. El residuo se disolvió en
0.3 mL de n-hexano:2-propanol (97:3, vol/vol) y se aplicó sobre una columna de
sílica (500 mg, Waters). Después de lavar la columna con 1 mL de n-hexano,
seguido por 4 mL de n-hexano:2-propanol (97:3, vol/vol), se eluyó 7-α-

25
hidroxicolesterol con 3 mL de n-hexano:2-propanol (80:20, vol/vol) y
posteriormente se separó por cromatografía en placa fina, en placas de sílica
gel, con éter dietílico como solvente de desarrollo cromatográfico y se
cuantificó en un contador de centelleo líquido Beckman modelo LS6500. El
valor de Rf para 7-α-hidroxicolesterol fue de 0.7. La actividad de la Colesterol 7-
α-hidroxilasa se expresó como pmol de 7-α-hidroxicolesterol formado por min
por mg de proteína.

Para la determinación de la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa in vitro,

los compuestos α-asarona y TMC se disolvieron en dimetilsulfóxido al 80%, y
se probaron diversas concentraciones de los compuestos mencionados para
obtener la cinética correspondiente. Se utilizó un control positivo conteniendo
dimetilsulfóxido al 80%.

4.6. b Fundamento de la reacción:

14
El colesterol marcado con C es hidroxilado en el carbono 7 por la Colesterol
7-α-hidroxilasa. El producto, 7-α-hidroxicolesterol, se obtiene en la fracción
80:20 (hexano:2-propanol) y se separa por cromatografía en placa fina. La
reacción es la siguiente:

NADPH NADP

HO Colesterol HO OH
* 7-α-hidroxilasa *
Colesterol 7-α-hidroxicolesterol

26
4.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La evaluación estadística se realizó con el programa Sigma Stat®. Los datos se

trataron por un análisis de varianza de una cola (ANOVA). La significancia de
las medias se determinó por el método de Holm-Sidak. El valor aceptado de p
fue <0.05.

27
 5. RESULTADOS

5.1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA HMG CoA REDUCTASA

5.1.a In vitro

Se determinó el efecto del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico y de la α-

asarona sobre la actividad de la HMG CoA reductasa de microsomas hepáticos
de ratas macho alimentadas con una dieta estándar. Los resultados se
muestran en la figura 10 y en la Tabla 1. Se observa que la α-asarona inhibe a
la HMG CoA reductasa, con una IC50 de 3.22 mM, como ya se había
encontrado previamente (Rodríguez-Páez et al., 2003); también se encontró
que el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, inhibe a la reductasa, con una IC50 de
69.8 mM, es decir, aproximadamente 22 veces menos que la α-asarona,
resultado que también se había obtenido en un estudio anterior (Antúnez,
2001).

5.1.b In vivo

Se determinó la actividad de la HMG CoA reductasa de microsomas

hepáticos de ratas hipercolesterolémicosque estuvieron sometidas a los
tratamientos con el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico y con la α-asarona,
obteniéndose para las ratas testigo 3.8 + 0.59 pmol mevalonato/min/mg
proteína, mientras que para las ratas tratadas con el TMC fue de 3.43+0.43
pmol mevalonato/min/mg proteína y para las ratas tratadas con α-asarona fue
de 11.88 + 1.32 pmol mevalonato/min/mg proteína (Figura 11). De acuerdo a
estos resultados, la actividad de la HMG CoA reductasa in vivo aumenta por el
tratamiento con la α-asarona al compararla con la actividad del grupo testigo,
mientras que el tratamiento con el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico no produjo
diferencias significativas con respecto al control. Cuando se comparan los

28
datos de los lotes problema (α-asarona y ácido 2,4,5-trimetoxicinámico) sí hay
diferencia estadísticamente significativa (Figura 11).

100
A

80

Actividad enzimática (%)

60

40

20

0
0 20 40 60 80 100
Concentración del inhibidor (mM)

100 B

80
Actividad enzimática (%)

60

40

20

0
0 1 2 3 4 5
Concentración del inhibidor (mM)

Figura 11. Inhibición de la HMG CoA reductasa hepática in vitro en microsomas

de ratas macho alimentadas con una dieta estándar por el ácido 2,4,5-
trimetoxicinámico (A) y la α-asarona (B). La actividad enzimática se
expresa como porcentaje del testigo (sin inhibidor). La actividad total de la
enzima fue 122 pmol de mevalonato producido/min/mg de proteína.

29
 14 *
(pmol mevalonato/min/mg proteína)

12

10
Actividad enzimática

Testigo TMC α−asarona

Figura 12 . Actividad enzimática de la HMG CoA reductasa hepática in vivo en ratas

macho hipercolesterolémicas. TMC: ácido 2,4,5-trimetoxicinámico. * p <
0.0001, n= 15

30
5.2 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ACAT-2

5.2.a In vitro

El efecto que producen el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico y la α-asarona sobre la

actividad de esta enzima microsomal hepática de ratas macho alimentadas con
una dieta estándar, fue semejante al que produjeron sobre la actividad de la
HMG CoA reductasa. Ambos compuestos fueron capaces de inhibir a la ACAT-
2 hepática de una manera dependiente de la concentración (Figura 12).
También en este caso, la α-asarona fue mucho mejor inhibidor que el ácido
TMC, inhibió 31.2 veces más que el TMC, ya que las IC50 fueron de 0.96 mM y
30.0 mM, para la α-asarona y el TMC, respectivamente (Tabla 1). Es más, la α-
asarona produjo mayor inhibición sobre la ACAT-2 que sobre la HMG CoA
reductasa. Esta es la primera vez que se informa que esta enzima es inhibida
por la α-asarona. Es probable que, como lo mencionamos en el caso de la
inhibición de la HMG CoA reductasa, la densidad de carga negativa del grupo
carboxilo en el TMC, que no se presenta en la α-asarona, produce una
inhibición mucho menor, ya que también es una enzima de retículo
endoplásmico y por lo tanto, hidrofóbica.

5.2.b In vivo

Cuando se determinó la actividad de la ACAT-2 de microsomas

hepáticos de ratas macho hipercolesterolémicas, que estuvieron sometidas a
los tratamientos con el TMC y con la α-asarona, se obtuvieron los resultados
que se presentan en la figura 13. Las ratas testigo presentaron una actividad de
73.7 + 12 pmol de colesteril oleato/min/mg proteína, mientras que para las
ratas tratadas con TMC fue de 89.7 + 15.4 pmol colesteril oleato/min/mg
proteína y para las ratas tratadas con α-asarona fue de 99.8 + 18.9 pmol
colesteril oleato/min/mg proteína. De acuerdo al análisis estadístico aplicado a
estos datos, la actividad de la ACAT-2 hepática in vivo no se modifica por los
tratamientos con el TMC y la α-asarona al compararla con la actividad del

31
grupo testigo. Cuando se comparan los datos de los lotes problema (α-asarona
y ácido 2,4,5-trimetoxicinámico) tampoco hay diferencias significativas.

100
A

80
Actividad enzimática (%)

IC50 = 30.00 mM

60

40

20

0 20 40 60

Concentración del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (mM)

100

B
80
Actividad enzimática (%)

IC50 = 0.96 mM
60

40

20

0
0 1 2 3 4 5 6

Concentración de α-asarona (mM)

Figura 13. Inhibición de la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa-2

hepática in vitro en microsomas de ratas macho alimentadas con
una dieta estándar, por el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (A) y la α-
asarona (B). La actividad enzimática se expresa como porcentaje del
testigo (sin inhibidor). La actividad total de la enzima fue 100 pmol de
colesteril oleato producido/min/mg de proteína.

32
 140

120
(pmol colesteril oleato/min/mg)
Actividad enzimática

100

80

60

40

20

0
Testigo TMC α-asarona

Figura 14. Actividad enzimática de la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa-2

hepática in vivo en ratas macho hipercolesterolémicas. TMC: ácido 2,4,5-
trimetoxicinámico. n=15

33
5.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA COLESTEROL 7-α-
HIDROXILASA

5.3. a In vitro

Cuando se midió la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa microsomal

hepática de ratas macho alimentadas con una dieta estándar, se obtuvieron los
resultados de la figura 14 y la tabla 1. Como puede observarse, la α-asarona
fue capaz de incrementar la actividad de la enzima, de una manera
impresionante. El aumento en la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa fue
dependiente de la concentración de α-asarona hasta 15 mM. Los resultados en
la figura 14, se presentan normalizados. Se tomó un valor de 1 para el control
sin α-asarona y, de acuerdo a estos datos, la concentración que provoca un
aumento del 50% de la actividad de la enzima (AC50) fue de 2.41 mM. Este
resultado aunque aparentemente extraño, no lo es, ya que en estudios previos
(Antúnez, 2001) encontramos que se produce un incremento significativo en la
concentración de ácidos biliares en la bilis de ratas macho
hipercolesterolémicas tratadas con α-asarona y la Colesterol 7-α-hidroxilasa es
la enzima que regula la vía clásica de síntesis de ácidos biliares (Montgomery
et al., 1996).

Al medir la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa en presencia de

TMC, encontramos que esta enzima se inhibe de una manera dependiente de
la concentración de TMC (Figura 14). La IC50 de esta inhibición fue de 54.4 mM
(Tabla 1). Es decir, el TMC es un débil inhibidor de la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, como lo es para las otras dos enzimas ensayadas. Es posible que,
como ya lo mencionamos previamente, su estructura química más polar que la
α-asarona, le impida interaccionar con la Colesterol 7-α-hidroxilasa.

5.3.b In vivo

Al determinar la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa extraída de

microsomas hepáticos de ratas macho hipercolesterolémicas, que estuvieron

34
sometidas a los tratamientos con el TMC y con la α-asarona, se obtuvieron los
resultados que se presentan en la figura 15. Las ratas testigo presentaron una
actividad de 13.5 + 1.36 pmol de 7-α-hidroxicolesterol/min/mg proteína,
mientras que para las ratas tratadas con TMC, la actividad fue de 17.5 + 2.6
pmol 7-α-hidroxicolesterol producido/min/mg proteína y para las ratas tratadas
con α-asarona, la actividad fue de 25.5 + 5.2 pmol 7-α-hidroxicolesterol
producido/min/mg proteína. El análisis estadístico mostró que la α-asarona
incrementó la actividad de esta enzima en comparación con el lote testigo, en
concordancia con los resultados mencionados antes, donde hubo un
incremento en la concentración de ácidos biliares en la bilis de ratas macho
hipercolesterolémicas tratadas con α-asarona. El TMC, no produjo modificación
de la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa en relación al grupo testigo ni en
relación al grupo tratado con α-asarona.

35
 120 A

100
Actividad enzimática (%)
IC50 = 54.4 mM
80

60

40

20

0 20 40 60

Concentración del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (mM)

B
3.0

2.5
(normalizada con el control)
Actividad enzimática

2.0

1.5 AC50= 2.41 mM

1.0

0.5

0.0

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Concentración de α-asarona (mM)

Figura 15. Efecto del ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (A) y la α-asarona (B) sobre la
Colesterol 7-α-hidroxilasa in vitro en microsomas de ratas macho
alimentadas con una dieta estándar. La actividad enzimática se expresa
como porcentaje del testigo. La actividad total de la enzima fue 22.02 pmol de
7-α-hidroxicolesterol producido/min/mg de proteína.

36
 35 *
30
(pmol 7-α-hidroxicolesterol/min/mg)

25
Actividad enzimática

20

15

10

Testigo TMC α-asarona

Figura 16. Actividad enzimática de la Colesterol 7-α-hidroxilasa hepática in vivo en

ratas macho hipercolesterolémicas. TMC: ácido 2,4,5-trimetoxicinámico. * p
< 0.05. n=15.

37
TABLA 1. Determinación de la IC50 o AC50 de la α -asarona y el TMC sobre
las enzimas que regulan el metabolismo hepático del colesterol

IC501 AC502
Enzima (mM) (mM)
Microsomal hepática
α -asarona TMC3 α -asarona TMC3

HMG CoA reductasa 3.22 69.8 -4 -

ACAT-2 0.96 30.0 - -

Colesterol 7-α- - 54.40 2.41 -

hidroxilasa
1
Concentración que inhibe el 50% de la actividad enzimática. 2 Concentración que
activa el 50% de la actividad enzimática.3 Acido 2,4,5-trimetoxicinámico. 4 no se
observó.

38
 6. DISCUSION

En la búsqueda de nuevos agentes hipocolesterolemiantes que contribuyan a

disminuir las impresionantes cifras a nivel mundial de enfermedades
cardiovasculares derivadas de la aterosclerosis (Thom et al., 2006), y además,
porque los fármacos hipolipidémicos se están utilizando para el tratamiento de
las dislipidemias asociadas a la resistencia a la insulina y a la diabetes mellitus
tipo 2 (Moon y Kashyap, 2004; Ducobu, 2005), la investigación sobre nuevas
moléculas y/o combinaciones de moléculas, tanto sintéticas como naturales,
con actividad hipocolesterolemiante e hipolipidémica se está realizando en
muchos laboratorios de investigación y compañías farmacéuticas en todo el
mundo (Harris et al., 2003; Ishihara et al., 2004; Kim et al., 2005; Dell’Uomo et
al., 2006; Santos et al., 2006).

En nuestro laboratorio desde hace algunos años, nos hemos dedicado a la

investigación sobre nuevas moléculas hipocolesterolemiantes y
antiaterogénicas tratando de hacer nuestra aportación en este campo.

En mamíferos, la homeostasis corporal de colesterol se mantiene

principalmente por el balance entre su síntesis (a través de la HMG CoA
reductasa) y su absorción intestinal (a través de la dieta y la circulación
enterohepática) regulada a través de la modulación de los niveles de
receptores de LDL en las superficies celulares y por cambios en los niveles y
actividad de HMG CoA reductasa (Brown y Goldstein, 1986; Ness y Chambers,
2000).

El hígado tiene un papel relevante en la regulación de los niveles de colesterol.

Este órgano podría llamarse el sensor del colesterol porque expresa los
receptores corporales de las diferentes lipoproteínas y es el principal sitio de
degradación de colesterol por su conversión a ácidos biliares y, aunque la HMG
CoA reductasa se encuentra en casi todos los tejidos, el hígado expresa uno de
los niveles más altos de esta enzima; además, y muy importante, la regulación
por retroalimentación de la HMG CoA reductasa por el colesterol ocurre

39
principalmente en este órgano (Ness y Chambers, 2000). Por esto es que en
este trabajo, nos enfocamos a estudiar, en el hígado, tanto in vitro como in vivo,
los posibles mecanismos de acción hipocolesterolemiantes de la α-asarona y el
ácido 2,4,5-trimetoxicinámico (TMC).

Nuestros resultados in vitro muestran que la HMG CoA reductasa

hepática es inhibida tanto por la α-asarona como por el TMC, aunque la α-
asarona la inhibe aproximadamente 22 veces más que el TMC. El hecho de
que la HMG CoA reductasa fuera inhibida por la α-asarona, es un resultado
que ya se había obtenido en un estudio previo (Chávez, 2004). En ese estudio,
se encontró que la α-asarona se comportó como un inhibidor competitivo de la
reductasa, es decir, es capaz de acomodarse en el sitio activo de la enzima y
lograr la inhibición. Al realizar un análisis comparativo de los sitios de unión de
las estatinas (inhibidores competitivos de la enzima, con afinidades aún
mayores que la del sustrato, Figura 17. (Istvan y Deisenhofer, 2001)) y los
posibles sitios de unión de la α-asarona en la reductasa, se encontró que ésta
última, podría anclarse en una región hidrofóbica que presenta el sitio activo de
la reductasa, tal y como se ha demostrado, para las estatinas, por estudios
cinéticos y cristalográficos, a través de sus regiones no polares (Istvan y
Deisenhofer, 2001). Recientemente, por estudios químicos teóricos
(acoplamiento molecular y QSAR tridimensional), se está tratando de
correlacionar la estructura de la α-asarona con sus propiedades
hipolipidémicas (Medina-Franco et al., 2005; Magdziarz et al., 2006). En cuanto
al TMC, éste presenta una actividad inhibitoria muy baja hacia la HMG CoA
reductasa, esto de debe probablemente, a la densidad de carga negativa del
grupo carboxilo en el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico, que no presenta la α-
asarona y que impide la inhibición de la HMG CoA reductasa, ya que es una
enzima asociada a las membranas del retículo endoplásmico y por lo tanto,
hidrofóbica, los inhibidores conocidos de esta enzima son generalmente no
polares (Endo, 1992; Istvan y Deisenhofer, 2001).

40
 Tipo 1

HMG- CoA
Compactina Simvastatina

Tipo 2

Fluvastatina
Cerivastatina
Atorvastatina Rosuvastatina

Figura 17. Estructuras químicas de algunas estatinas. Tipo 1: Naturales, Tipo

2: Sintéticas. (Modificado de Istvan y Deisenhofer, 2001)

Con estos resultados, supusimos que el efecto hipocolesterolemiante de

la α-asarona, demostrado en ratas macho hipercolesterolémicas (Rodríguez-
Páez et al., 2003) se debía a que era un inhibidor de la HMG CoA reductasa
hepática, enzima que como ya se dijo con anterioridad, cataliza el paso
limitante en la síntesis de colesterol; ya que, in vivo, al inhibirse esta enzima en
los hepatocitos, hay una disminución del nivel intracelular de colesterol; las
células responden sintetizando más receptores de LDL y enviándolos a la
membrana celular para captar las LDL-colesterol circulantes y de esta manera
mantener la homeostasis hepática de colesterol. Al inducirse este mecanismo,
disminuyen los niveles sanguíneos de LDL-colesterol y se produce
hipocolesterolemia (Shepherd, 2004). Sin embargo, al medir la actividad in vivo
de la HMG CoA reductasa hepática en nuestras ratas macho
hipercolesterolémicas tratadas con α-asarona, encontramos que ésta enzima,
no solo no fue inhibida por el tratamiento, sino que se incrementó más de tres
veces la actividad enzimática.

41
 Las estatinas, que son los fármacos más utilizados y efectivos para
disminuir la concentración sanguínea de colesterol por inhibición de la HMG
CoA reductasa, producen altos niveles de expresión de la reductasa e
incremento en la estabilidad de la proteína, como respuesta a su inhibición in
vivo en ratas, de tal manera que la inhibición de la biosíntesis corporal de
colesterol, no es tan grande como se esperaría (Fujioka et al., 1995; Ness et
al., 1998; Ness y Chambers, 2000). Goldstein y Brown (1990) demostraron que
la expresión de HMG CoA reductasa está controlada por retroalimentación
negativa de los metabolitos producidos en la vía de síntesis de colesterol, así la
inhibición de la HMG CoA reductasa, induce la expresión de la misma, lo que
explica el incremento de la actividad de la enzima en presencia de las estatinas
(Fujioka et al., 1995; Sawada et al., 2002).

De acuerdo a lo anterior, la α-asarona se comporta como las estatinas:

a) produce disminución en la concentración de colesterol en sangre, b) es un
inhibidor de la HMG CoA reductasa hepática, c) se revierte la inhibición de la
HMG CoA reductasa porque la disminución de colesterol hepático por inhibición
de su síntesis, provocará también una disminución en los metabolitos que son
sintetizados en la vía de la síntesis del colesterol, que son los que regulan por
retroalimentación a la reductasa, de tal manera que la disminución o pérdida de
metabolitos inducen la expresión de la enzima.

Por otro lado, el TMC, que no es un buen inhibidor de la HMG CoA

reductasa in vitro, no modifica la actividad in vivo de la HMG CoA reductasa
hepática, con lo cual probablemente no se altera la concentración de
metabolitos derivados de la síntesis de colesterol que tienen importantes
efectos de regulación sobre la misma.

La ACAT es la enzima microsomal responsable de la esterificación de

colesterol con ácidos grasos de cadena larga, en una gran variedad de células
y tejidos. Al transformar el colesterol libre en un éster de colesterol, la ACAT
permite almacenar al colesterol intracelularmente de una manera no tóxica. La
ACAT es otra de las enzimas significativas en el mantenimiento del balance
intracelular de colesterol además de la HMG CoA reductasa, cuya posible

42
inhibición ha sido blanco recientemente de tratamientos quimioterapéuticos
relacionados con la aterosclerosis (Burnett et al., 1999; Matsui et al., 2001;
León et al., 2005; Chang et al., 2006), ya que aun con las estatinas existe la
necesidad de desarrollar otros compuestos que pudieran complementar la
acción de las mismas para reducir la incidencia de enfermedades
cardiovasculares y muerte.

Los inhibidores de la ACAT trabajan de manera diferente a las estatinas,

ya que pueden actuar, por un lado, al disminuir el tamaño del núcleo lipídico en
la placa aterosclerótica (por inhibición de la ACAT de los macrófagos),
estabilizando y/o disminuyendo el riesgo de ruptura de la placa y por otro,
disminuyendo la absorción intestinal del colesterol de la dieta (por inhibición de
la ACAT intestinal) y la secreción hepática de VLDL-colesterol (por inhibición
de la ACAT hepática). De tal manera que los inhibidores de la ACAT pueden
prevenir la aterosclerosis no sólo por su actividad hipocolesterolemiante, sino
también por su actividad antiaterosclerótica directa (León et al., 2005; Chang et
al., 2006).

Sin embargo, hasta hace aproximadamente 7 años, se conoció la

existencia de dos genes que codifican para la actividad de ACAT, a las que se
les llamó ACAT-1 y ACAT-2 y actualmente esta claro que las dos enzimas
realizan funciones fisiológicas diferentes. La ACAT-1 se expresa en la mayoría
de las células, esterificando el colesterol en respuesta a la abundancia de
colesterol dentro de las células. En lesiones ateroscleróticas donde los
macrófagos ingieren exceso de colesterol, esta enzima parece que es
importante para la sobrevivencia celular, y la inhibición de la ACAT-1 puede
llevar a la muerte celular. En contraste, la ACAT-2 se expresa sólo en
hepatocitos y enterocitos y parece que su función es proporcionar ésteres de
colesterol para su transporte en lipoproteínas. Estos dos tipos celulares tienen
mecanismos adicionales para disponer del colesterol y la disminución de la
ACAT-2 no provoca apoptosis (Rudel et al., 2005). De tal manera que la
información disponible a la fecha sugiere que la estrategia para el tratamiento
de las enfermedades cardiovasculares asociada a aterosclerosis e
hipercolesterolemia podría ser la inhibición específica de la ACAT-2.

43
 Debido al efecto hipocolesterolemiante de la α-asarona y el TMC y a que
este efecto podría ser debido a inhibición de la ACAT-2, medimos la actividad
de la ACAT-2 hepática en presencia de la α-asarona y el TMC in vitro e in vivo.
Los resultados mostraron que ambos compuestos inhibieron in vitro a la ACAT-
2 y, al igual que con al HMG CoA reductasa, la α-asarona inhibió a la ACAT-2,
más de 30 veces con respecto al TMC. Al comparar la estructura química de la
α-asarona con la de algunos inhibidores conocidos de la ACAT, encontramos
que éstos pueden ser de dos tipos generales, derivados de amidas aromáticas
con ácidos grasos y derivados de la urea (León et al., 2005). Dentro de los
primeros existe una amplia gama de compuestos que incluyen inhibidores
competitivos de derivados polimetoxilados, con regiones semejantes a la α-
asarona y al TMC (Azuma et al., 1998; Matsui et al., 2001). De aquí que,
podríamos explicarnos la razón de la inhibición in vitro de la ACAT por nuestros
compuestos de estudio. De acuerdo a esto, esperábamos encontrar la actividad
de la ACAT disminuida in vivo, sin embargo, encontramos un ligero incremento
no significativo, producido por los grupos tratados con respecto al control en la
actividad de la ACAT-2 hepática. Posiblemente, la ACAT-2 se inhibe al inicio
del tratamiento, pero después de los 7 días de tratamiento, y, de acuerdo a los
resultados obtenidos con respecto a la elevación de la actividad de la HMG
CoA reductasa en las ratas tratadas con α-asarona, que repercute en una
elevación de los niveles intracelulares de colesterol libre, ocurre un ligero
incremento en la actividad de la ACAT-2, porque el colesterol libre es un
activador alostérico de esta enzima (Chang et al., 2006). Resultados similares
se han obtenido con inhibidores de la HMG CoA reductasa al analizar el efecto
de éstas moléculas sobre el metabolismo hepático de colesterol en ratas
macho con una dieta hiperlipidémica (Clerc et al., 1993).

En nuestro estudio, también analizamos el efecto de la α-asarona y el

TMC, sobre la actividad de la colesterol 7-α-hidroxilasa, otra de las enzimas
importantes en el mantenimiento de la homeostasis de colesterol. Ésta es una
enzima exclusiva del hígado, que cataliza el paso limitante, por la vía clásica,
en la síntesis de ácidos biliares, los productos de excreción del colesterol

44
(Souidi et al., 2000). La transformación de colesterol en ácidos biliares es la
única vía de eliminación corporal de colesterol. En estudios previos de nuestro
laboratorio (Rodríguez-Páez et al., 2003), encontramos que la α-asarona
produjo un incremento en la concentración de ácidos biliares de ratas macho
hipercolesterolémicas que podría haber sucedido por un incremento en la
actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa y, en este trabajo, comprobamos que
realmente hay un incremento de casi el doble, en la actividad de la Colesterol
7-α-hidroxilasa, en ratas hipercolesterolémicas tratadas con la α-asarona. La
elevación en la concentración biliar de los ácidos biliares derivada del
incremento en la actividad de esta enzima, significa que hay, a su vez, un
incremento en la excreción (eliminación corporal) de colesterol. Y éste sería
parte del mecanismo por el que la α-asarona presenta efecto
hipocolesterolemiante. También, la elevación en la concentración biliar de
ácidos biliares, producida por la elevación en la actividad de la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, explica el gran incremento en el flujo biliar, inducido por la α-
asarona (Rodríguez-Páez et al., 2003) que contribuye a eliminar mayor
cantidad de colesterol y ácidos biliares del organismo.

La crilvastatina y la pitavastatina, inhibidores de la HMG CoA reductasa

producen, al igual que la α-asarona, elevación aparentemente inespecífica, en
la expresión y actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa, en ratas (Clerc et al.,
1993; Fan et al., 2004), aunque existe la posibilidad de que el incremento en la
actividad de esta enzima sea debido a que estos inhibidores de la HMG CoA
reductasa, se sitúen en el sitio de unión del colesterol, que es quien activa a la
Colesterol 7-α-hidroxilasa (Jelinek et al., 1990), o pueden modificar directa o
indirectamente, la acción de los factores que regulan la expresión de esta
enzima.

El TMC, se comportó de manera diferente que la α-asarona, éste no

modificó la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa in vivo. Un
comportamiento semejante fue el que se observó in vitro: la α-asarona
incrementó la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa, posiblemente, como ya
lo mencionamos para las estatinas, porque ocupó el sitio de unión del

45
colesterol, activándola; mientras que el TMC inhibió a la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, posiblemente, porque se comportó como los ácidos biliares, que
inhiben a la enzima (Xu et al., 1999).

En resumen, en la búsqueda del mecanismo por el que la α-asarona y

el TMC producen efecto hipocolesterolemiante, podemos decir que:

¾ Por lo menos son cinco los mecanismos responsables de la homeostasis

del colesterol que afectan su concentración sanguínea: a) biosíntesis a
partir de acetato, regulada por la HMG CoA reductasa, enzima limitante en
la vía. b) expresión de los receptores de LDL, especialmente en el hígado,
donde se localizan más de la mitad de ellos. c) incorporación de colesterol a
través de la dieta. d) almacenaje intracelular como ésteres de colesterol
regulado por la ACAT. e) transformación de colesterol a ácidos biliares, sus
productos catabólicos, regulado por la formación de 7-α-hidroxicolesterol,
molécula sintetizada por la colesterol 7-α-hidroxilasa.

¾ En este estudio, analizamos cuatro de los cinco puntos anteriores, tomando

como base los resultados obtenidos previamente (Rodríguez-Páez et al.,
2003) en ratas macho hipercolesterolémicas, que fueron: a) La α-asarona
produjo una disminución la concentración de colesterol total en suero. b)
produjo un incremento en la concentración de ácidos biliares en la bilis. c)
produjo disminución en la concentración de colesterol biliar. d) produjo
incremento en el flujo biliar. e) produjo incremento en la secreción de
colesterol y ácidos biliares hacia el intestino.

¾ Los resultados antes mencionados, junto con los obtenidos en este estudio,
y en otros estudios donde se utilizaron inhibidores de la HMG CoA
reductasa, nos hace proponer el siguiente mecanismo de acción
hipocolesterolemiante de la α-asarona in vivo:

La α-asarona inhibió inicialmente a la HMG CoA reductasa hepática, lo que

provocó captación de LDL-colesterol circulante en el hígado, disminución de

46
 los niveles sanguíneos de LDL-colesterol y como consecuencia de ello, se
produjo hipocolesterolemia; también hubo inducción y/o activación de la
HMG CoA reductasa, por falta de colesterol. Esto produjo una elevación
posterior del colesterol libre hepático, que no activó a la ACAT-2, para formar
ésteres de colesterol no tóxicos, sino que activó a la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, incrementándose la síntesis de ácidos biliares y disminuyendo la
concentración de colesterol biliar y hepática. A su vez, los ácidos biliares
produjeron un aumento en la coleresis y por lo tanto, un aumento en la
secreción de colesterol y de ácidos biliares, lo que finalmente condujo a una
excreción corporal incrementada.

¾ El TMC, que presentó los mismos efectos farmacológicos de la α-asarona,

pero en menor proporción, se comportó diferente a la α-asarona: in vivo no
fue capaz de activar a la HMG CoA reductasa, posiblemente debido a que in
vitro, fue un inhibidor muy débil de la HMG CoA reductasa y en el tiempo en
el que transcurrió el experimento, no pudo lograr el mismo efecto que la α-
asarona. Tampoco modificó la actividad de la Colesterol 7-α-hidroxilasa. In
vitro, su comportamiento frente a esta enzima fue completamente opuesto al
de la α-asarona, e in vivo, se comportó igual que el grupo control. Realmente,
el TMC sí presenta efecto hipocolesterolemiante, pero el mecanismo de ello,
puede ser diferente al de la α-asarona, por lo menos en algunos aspectos,
como que el efecto hipocolesterolemiante esté orientado principalmente al
efecto colerético que produce, lo que incrementaría la excreción corporal de
colesterol y de ácidos biliares.

47
 7. CONCLUSIONES

1) In vitro, la α-asarona inhibe a la HMG CoA reductasa y a la Acil

Coenzima A: colesterol acil transferasa-2 hepáticas, con IC50 de 3.22
mM y 0.96 mM, respectivamente; y activa a la Colesterol 7-α-hidroxilasa
hepática con una AC50 de 2.41 mM.

2) In vivo, después de un tratamiento por 7 días, a una dosis de 80 mg/kg,

a ratas hipercolesterolémicas, la α-asarona incrementa la actividad de la
HMG CoA reductasa y de la Colesterol 7-α-hidroxilasa hepáticas y no
modifica la actividad de Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa
hepática-2.

3) In vitro, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico inhibe a la HMG CoA reductasa,

a la Acil Coenzima A: colesterol acil transferasa-2 y a la Colesterol 7-α-
hidroxilasa hepáticas, con IC50 de 69.8 mM, 30 mM y 54.4 mM,
respectivamente.

4) In vivo, después de un tratamiento por 7 días, a una dosis de 80 mg/kg,

a ratas hipercolesterolémicas, el ácido 2,4,5-trimetoxicinámico no
modifica las actividades enzimáticas de HMG CoA reductasa, Acil
Coenzima A: colesterol acil transferasa hepática-2 y Colesterol 7-α-
hidroxilasa hepáticas.

5) Nuestros resultados sugieren que el mecanismo por el que la α-asarona

tiene efecto hipocolesterolemiante es por inhibición inicial a la HMG CoA
reductasa, lo que provoca captación de LDL circulante en el hígado, y
activación de la HMG CoA reductasa, por falta de colesterol; elevación
posterior del colesterol libre hepático, activación de la Colesterol 7-α-
hidroxilasa, incremento en la síntesis de ácidos biliares que produce un
aumento en la coleresis y por lo tanto, un aumento en la secreción de

48
 colesterol y de ácidos biliares, lo que finalmente conduce a su excreción
corporal incrementada.

6) Nuestros resultados sugieren que el mecanismo por el que el ácido 2,4,-

trimetoxicinámico produce efecto hipocolesterolemiante es diferente, por
lo menos en parte, al sugerido para la α-asarona.

8. PERSPECTIVAS
La realización de este trabajo nos ha permitido proponer la manera por
la que la α-asarona produce efecto hipocolesterolemiante, a través de la
medición de las actividades enzimáticas de la HMG CoA reductasa, la ACAT-2
y la colesterol 7-α-hidroxilasa hepáticas, que son las enzimas que regulan el
metabolismo hepático de colesterol. Sin embargo, aún faltan estudios por
realizar para dilucidar el mecanismo de acción de este fármaco, como: evaluar
las actividades enzimáticas antes mencionadas, in vivo, efectuando cinéticas a
tiempos más cortos que los realizados en este trabajo, lo que evidenciaría el
momento en el que la α-asarona deja de inhibir a la HMG CoA reductasa y se
revierte esta inhibición; también, determinar las actividades de las tres enzimas,
en ratas macho, tanto en condiciones normolipémicas como hiperlipémicas,
para conocer la regulación natural de las actividades enzimáticas, en este
modelo experimental, bajo estos regímenes alimenticios; determinar los niveles
de las VLDL en presencia de la α-asarona para corroborar la participación de la
ACAT-2 hepática; es importante también, cuantificar el efecto de la α-asarona
sobre la ACAT-2 intestinal, in vivo, ya que es posible que la α-asarona presente
un efecto inhibidor sobre esta enzima y como consecuencia, puede impedir la
absorción intestinal de colesterol, lo que incrementaría los posibles sitios de
acción de la α-asarona; estudiar el comportamiento de los receptores hepáticos
de LDL en presencia de la α-asarona.

Finalmente, este estudio evidencia, en forma rotunda, que la α-asarona

puede estar ejerciendo su efecto, no solamente por acción directa sobre las
actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo hepático de colesterol,

49
sino sobre la expresión de las mismas, lo que abre un nuevo campo de
investigación.

9. BIBLIOGRAFÍA
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