INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUIMICA E

INDUSTRIAS EXTRACTIVAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA
ACADEMIA DE QUIMICA ANALITICA

PRACTICA 2 “Influencia de la cantidad del analito en la respuesta del equipo HPLC”

Alumna: Ramos Carpio Rosario

Profesor: Camacho Camacho Luis Enrique

Materia: Laboratorio de técnicas de separación

Grupo: 3IV7B
 OBJETIVOS
 Inyectar diferentes cantidades de analito para observar cómo afecta las respuestas del HPLC.
 Realizar una calibración con los datos obtenidos.
 Cuantificar un analito en una muestra problema.
 INTRODUCCION

La cafeína es un alcaloide perteneciente al grupo de las metilxantinas (1,3,7-

trimetilxantina), en estado puro es un sólido cristalino blanco. Fue aislada por primera vez
en 1820 por el químico alemán Friedrich Ferdinand Runge. Se encuentra en forma natural
en las hojas, semillas y frutos de más de 60 plantas, entre las que se pueden mencionar,
hojas de té, nueces de cola, café y granos de cacao. También se encuentra en el
chocolate, plantas de yerba mate y guaranás.
Propiedades físico químicas:

En estado puro, la cafeína es un polvo blanco de sabor amargo. La solubilidad de la

cafeína a 25 ºC es 21 mg/ml y aumenta conforme aumenta la temperatura. Su peso
molecular es 194,19 g/mol.
Es un estimulante que actúa sobre el sistema nervioso central, incrementa la actividad
motora, el rendimiento intelectual y disminuye la fatiga. En dosis altas pueden producir
ansiedad y disforia, así como trastornos del sueño. Fisiológicamente, la cafeína aumenta
la presión arterial, la frecuencia respiratoria y la diuresis. Todos los efectos que produce
son dependientes de la dosis. Incrementa la presión arterial y la frecuencia respiratoria y
taquicardia, produciendo diuresis y estimulando la liberación de adrenalina.
La cafeína también provoca la disminución del flujo sanguíneo cerebral, por vaso
constricción,de esta manera las cefaleas o migrañas. Otro efecto importante es que
aumenta la secreción de jugos -como el ácido clorhídrico y la pepsina- en el estómago.
Esta acción la convierte en una droga irritante de la mucosa gástrica; pero, a su vez, tiene
acción antiespasmódica en la vesícula.
La cafeína posee también un leve efecto diurético; aumenta la capacidad de trabajo
muscular, refuerza la contracción y produce un muy pequeño efecto en los pulmones,
dilatando los bronquios. Finalmente está presente en productos cosméticos debido a que
también presenta propiedades anticelulíticas (favorece la lipólisis), antioxidantes y
reafirmantes.

USOS INDUSTRIALES:
 Fabricación de helados.
 Refrescos.
 Bebidas saborizadas.
 Polvos para preparar bebidas saborizadas.
 La cafeína se ha agregado a los analgésicos comunes como el paracetamol, el
ibuprofeno y la aspirina, con la creencia de que mejora la eficacia analgésica.
La forma más eficiente de mejorar la resolución es optimizar la selectividad. Este
parámetro es más fácilmente influenciado por dos factores, la fase estacionaria y la fase
móvil.
Desde triángulos de selectividad hasta elución de gradientes, esta publicación trata sobre
cómo puede usar la fase móvil para lograr la mejor selectividad y resolución posibles en
sus separaciones.
En general, cada disolvente tiene sus propias propiedades selectivas. L.R. Snyder y J.J.
Kirkland investigó y comparó varios disolventes y agrupó los que
tenían efectos similares en grupos de selectividad. Los grupos de
selectividad están organizados en un triángulo de selectividad que
permite comparar visualmente los disolventes.
La consecuencia práctica más importante del triángulo de selectividad
es que si un determinado disolvente no puede proporcionar suficiente
selectividad en una separación dada, es poco probable que cualquier
otro disolvente del mismo grupo pueda hacerlo. En su lugar, debe
utilizar disolventes de otros grupos de selectividad.
Con frecuencia, se inicia una separación isocrática, es decir, la composición de la fase
móvil permanece constante durante todo el proceso de separación. En la práctica, a
menudo es imposible lograr una separación isocrática. Esto es especialmente cierto
cuando se trata de compuestos cuya polaridad varía ampliamente o la mezcla a purificar
consta de muchos componentes. Siempre que los valores de R f son demasiado altos, los
tiempos de análisis se prolongan excesivamente. En las separaciones en las que los
valores de R f son demasiado bajos, los compuestos solo podrían eluirse de la columna
con mucho tiempo y disolvente.
Para disminuir estos efectos, es posible que necesitemos cambiar la composición de la
fase móvil durante el transcurso de la ejecución cromatográfica. Con la denominada
elución en gradiente, puede variar la composición de la fase móvil aumentando la cantidad
de disolvente con mayor fuerza de elución. En consecuencia, al comienzo de la
ejecución,cuando la resistencia de la fase móvil es baja, el analito se concentrará en la
fase estacionaria en la cabeza de la columna. A medida que aumenta la fuerza de la fase
móvil, el analito comenzará a dividirse en la fase móvil y se moverá a lo largo de la
columna. En algún momento, el analito puede estar completamente dividido en la fase
móvil y se moverá con la misma velocidad que la fase móvil.
 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

a) Hacer referencia a la práctica anterior debido a que en ella se menciona el

procedimiento para realizar el Encendido del equipo Flexar.
b) Creación de un método de análisis usando el programa Chromera.

1.- Seleccionar en la parte inferior

izquierda el icono del folder amarillo
para poder seleccionar el método que
vamos a utilizar.

2.- Posteriormente de seleccionar

el folder amarillo aparece una
lista con folder y seleccionamos
el folder que dice Camacho,
posteriormente, sale otra lista y
seleccionamos el método que
vamos a utilizar que es el de la
cafeína.

3.- Posteriormente de seleccionar el

método nos sale una pantalla en
donde nos indica el nombre del
método, el grupo que es en donde
se encuentra el método, que es lo
que vamos a analizar, también se
encuentra las notas que es donde se
especifica los parámetros en lo que
vamos a utilizar nuestra
experimentación.
4.- Posteriormente del lado izquierdo
donde esta el recuadro de method,
seleccionamos el detector en este
caso tenemos un detector uv-vis,
seleccionamos los datos que van a
ser recibidos por el cromatografo que
van a ser 5, le vamos a poner 4.5
minutos de tiempo final para que
nosotros podamos hacer nuestro
análisis, en la segunda parte es donde
vamos a poner la longitud de onda,y
se realiza en automático la señal a 0.

5.- Posteriormente de trabajar

con el detector vamos a trabajar
con la bomba, la bomba puede
trabajar de dos maneras de forma
isocratica o de forma gradiente
de fase móvil, nosotros
trabajaremos de forma isocratica,
el tiempo de equilibrio va a ser de
1 min, hasta que lleguemos a 1
ml/min, el flujo en standby es de
0.1, ya que uando dejamos de
y¿utilizar el equipo o se dejo de
analizar la bomba en automático
lo baja a 0.1 para nio
desperdiciar fase móvil, hay que
checar muy bien la presión,
guardamos nuestro método, nos
vamos a la opción de run time.

C) cómo se usa una jeringa de cromolitografía para ingresar la muestra en el equipo

Flexar.

1.- La válvula tiene una parte frontal

por donde se introduce la aguja de
la jeringa que contiene la muestra.
 2.- Tenemos que fijarnos que la
palanca que tiene se encuentre en
la parte de arriba para que
podamos agregar la inyección,
recordando que tiene que ser con
una aguja especial para que no
dañemos la válvula.

3.- Empezamos a llenar la jeringa que

vamos a ocupar con nuestra muestra,
cabe mencionar que debemos de usar
una jeringas adecuadas para el tipo de
mezcla que vamos a ocupar.

4.- Una vez que ya tomamos la

muestra le vamos a colocar un filtro
para poderla inyectar en el
cromatografo ya que recordemos que
nuestra debe de ser agregada con las
menos impurezas posibles.

5.- Tenemos que retirarle el aire que

pueda contener la aguja para no
ingresar aire en el cromatografo.
 6. Despues de retirarle todo el aire que
tiene la jeringa ya procedemos a poder
inyectar la muestra en el cromatografo.

7.- Al ingresar la primera muestra el cromatografo,

bajo la palanca, espero un minuto y vuelvo a subir
la palanca, cuando yo ya tengo la palanca en
posición de carga nuevamente mi inyector retiro la
jeringa y la enjuago e inyecto unicamente aire para
sacar todo el liquido que se quedo en la jeringa y
en el loop.

8.- posteriormente retiramos la jeromja y con una

jeringa nueva limpiamos el loop para despues poder
ingresar la otra muestra y que no halla interferencias
con la muestra anterior y así cada que vamos a
ingresar una muestra nueva tenemos que limpiar el
loop

D) Diagrama de bloques de cómo se usa el programa Chromera para obtener los datos
contenidos en un cromatograma.

1.- Despues de un tiempo vamos a

ver que empiezan a aparecer
diferentes picos esos picos se deben
impurezas de la cafeína o impurezas
del disolvente

2.- La señal es muy baja pero vamos a

llega a que el pico gaussiano aparezca
el analito de mi interés.
 3.. El pico significa que toda la señal que cambio el
detector es por que el detector ha notado la presencia de
un analito y que llega en de una banda , y es un pico de
forma gaussiana.
Del pico podemos obtener 3 datos :
 El tiempo de retención: que seria el tiempo promedio
que tarda este analito en llegar al detector desde que
lo inyecte.
 La altura del pico: es una forma de conocer la cantidad
de analito que ha pasado a través del detector.
 El área bajo la curva del pico, es también una forma de
medir la cantidad de analito que ha pasado por este
detector.

4.- Cuando yo ya tengo un cromatograma terminado voy a

buscar los reportes. Elijo el reporte que quiere y me
aparece una hoja de resultados en done me aparece el
tiempo de retención, el área, la altura. Y en cada uno
escribirle los datos de cual fue la muestra a la que
corresponde esos resultados para poderlo diferencias ya
que los comatogramas pueden ser muy similares.

E) Hacer referencia a la práctica anterior debido a que en ella se menciona el

procedimiento para realizar el Apagado del equipo
 RESULTADOS EXPERIMENTALES

Conc. TR A H A/H
Mg/ L (min) (ua.s) (ua) (seg)

15 3.337 627533 75745 8.28

30 3.356 1071502 135481 7.91
50 3.351 1706396 220186 7.75
? 3.355 1285689 150270 8.56

Resultados de 15 mg/ l
Resultados 30 mg/l
Resultados 50 mg/l
 ANALISIS DE RESULTADO

Los valores que se obtuvieron en la gráfica comparando la concentración vs el tiempo de

retención, se observa que no es creciente de forma linea ya que se puede observar como
e l segundo punto llega a una parte mas alta y despues decrece.

En esta gráfica en donde estamos representando la concentración vs el Área del pico

podemos observar que si crece de forma mas lineal lo que quiere decir que todo es
equivalente conforme va creciendo concentración va creciendo el are del pico o es
proporcional,solo en el primero punto aumentan un poco pero no varia tanto.
En la tercra gráfica se pude observr casi lo mismo que n la anterior el valor de su
concentracion es proporcional a la altura de pico lo que provoca que la gráfica sea lineal a
excepción del segundo punto que aumento un poco más la altura del pico.

Al anazlizar la cuart gráfica podemos observar que los puntos que se obtuvieron están
muy diferentes a que sea lineal ya que varia un poco con respecto a la linea de tendencia
lineal.
 CÁLCULOS

a) Utilizar el método de estándar externo para realizar la calibración del equipo usando
área y altura con los datos obtenidos en clase presencial
b) Calcular el contenido de cafeína en la muestra problema usando como dato su Área
de pico y
c) Calcular el contenido de cafeína en la muestra problema usando como dato su Altura
de pico

Utilizando la regresion lineal obtenida con el grafico de concentración vs área

y = 33606 x + 53204

Donde :
y = señal anaitica = área
x = concentración

Por lo tanto:
Área = 33606 ∗ concentración + 53204

En donde:
Área de la muestra desconocida= 1285689 ua*s

Por lo tanto:

á��� − 53204
ConcentracionMuestra problema =
33606

1285689 − 53204
ConcentracionMuestra problema =
33606

ConcentracionMuestra problema = 36.6745 mg/l

Calculando la concentración de la muestra con la regresión lineal del grafico

de la concentración vs altura.

Altura = 4357.2 ∗ concentración + 4370.3

������ − 4370.3
ConcentracionMuestra problema =
4357.2

150270 − 4370.3
ConcentracionMuestra problema =
4357.2
 ConcentracionMuestra problema = 33.4847 mg/L

CONCLUSIONES

Logramos cumplir nuestros objetivos ya que inyectamos diferentes cantidades de analito

para observar como es que afecta en los resultados por medio del HPLC, así como
también lograr realizar una calibración correcta con los datos obtenidos en la
experimentación, Así como lograr cuantificar el analito de la muestra problema y poder
sacar cual es la concentracion del analito en cuestión en este caso,la cafeína, así como
también , poder seguir practicando el encendido y el apagado del equipo, para lograr tener
una respuesta y solución correcta a cualquier análisis que realizamos y poder obtener
buenos resultados.

BIBLIOGRAFIA.

 Rango de valores del pKa de la cafeína protonada, Harry G. Brittain, Richard J.

Prankerd (2007). Academic Press, ed. Profiles of Drug Substances, Excipients and
Related Methodology, volume 33: Critical Compilation of Pka Values for
Pharmaceutical Substances. ISBN 0-12-260833-X. Archivado desde el original el 21 de
abril de 2014. Consultado el 4 de febrero de 2010.
 Weinberg, B. A. y Bealer, B. K. (2001/2018). El mundo de la cafeína: la ciencia y la
cultura en torno a la droga más popular del mundo [The World of Caffeine. The
Science and Culture of the World's Most Popular Drug]. 1a. reimpresión.
Routledge/Fondo de Cultura Económica. México. 534 páginas. ISBN 978-607-16-
0943-4
 Luis Camacho, (2021), youtube [Link] Calibración de equipo
HPLC y Filtración de fase Móvil