Técnicas para realizar los procedimientos de siembra en cajas

petri y en tubos de ensaye (Práctica N°6)

 Técnica de gota pendiente: Se coloca una gota de la muestra en el centro del

cubreobjetos, que se impregna ligeramente con unas gotas de vaselina. El cubreobjetos se invierte
sobre un portaobjetos situado boca arriba, de manera que la gota queda en suspensión sobre el
mismo.

OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS VIVOS CON EL MÉTODO DE GOTA PENDIENTE

OBSERVACIÓN DE MICROORGANÍSMOS VIVOS CON EL MÉTODO DE GOTA

PENDIENTE.

OBJETIVO.

Observar los microorganismos vivos bajo el microscopio y así poder observar su movimiento.

FUNDAMENTO.

Las observaciones con el método de gota pendiente permiten visualizar los microorganismos vivos sin el uso de colorantes, ya que la
utilización de colorantes mataría a los microorganismos.
La observación con el método de gota pendiente nos permite ver el movimiento de los diferentes microorganismos.
MATERIAL.

Papel de filtro
Portaobjetos
Cubreobjetos
Gradilla
Pipeta pasteur
Tubos de ensayo
Microscopio óptico
Agua destilada
Muestras de agua: de un charco y del agua del rio Segura.

PROTOCOLO.

Con una pipeta pasteur cogemos una gota de la muestra y la colocamos en el centro del cubreportaobjetos y humedecemos con
bordes con un poco de agua destilada.
Situamos el portaobjetos especial que tiene unas excavaciones de manera invertida, quedando la muestra de agua sobre la
excavación sin llegar a tocar el portaobjetos.

A continuación, observaremos la preparación al microscopio.

RESULTADO.

En la visualización de la muestra de agua del rio Segura podemos distinguir algunos Volvox (algas).

Si lo comparamos con el método de observación en fresco el movimiento de los microorganismos es mucho mayor ya que tienen más
superficie para desplazarse.
 Muestra de agua rio Segura.

Muestra de agua de un charco.

 Como se realiza un frotis:

Colocar una pequeña gota de agua en el

centro de un portaobjetos limpio. Se Flamearelasa de Remover la mezcla con el
necesita muy poca cantidad de agua, por siembra, tomar, en asa de siembra hasta
lo que se puede usar el asa de siembra, ya condiciones asépticas, formar una suspensión
que en el extremo curvo de su filamento una colonia del cultivo homogénea que quede
queda retenida una mínima gota de agua, bacteriano en medio bastante extendida para
que resulta suficiente. sólido y transferirlo a la facilitar su secado.
gota de agua

Esperar hasta que el líquido se evapore Si la muestra se toma de un cultivo en

o acelerar su evaporación acercando la medio líquido, no es necesario realizar
Fijación de las porta a la llama del mechero. En este los dos primeros pasos ya que basta
bacterias al caso hay que tener mucha precaución con colocar y extender una gota de la
portaobjetos de no calentar demasiado el porta pues suspensión bacteriana, que se toma con
las células pueden deformarse o el asa de siembra, directamente sobre
romperse. el portaobjetos.
 Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido). Añadir unas gotas de meta
Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases.

Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparac

Método o Procedimiento para la Tinción de Ziel-Nelsen:

Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos
suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (ácido alcohol sensibles)
PROCEDIMIENTO:
Se calienta hasta que empiecen a
desprenderse vapores blancos,
Sobre el preparado ya
haciendo pasar por debajo del
fijado se vierte la solución Dejar enfriar 5 min
portaobjetos la llama de un y lavar con
de fucsina de Ziehl sin
hisopo embebido en alcohol. Se
repite tres veces el
procedimiento.

Decolorar con una solución

Cubrir unos minutos con solución de Azul de Metileno (según Loeffler). de ácido clorhídrico al 3%
Lavar con (V/V) en etanol de 95%
(mezcla alcohol- ácido), hasta
la decoloración casi total del
frotis.

Lavar con agua, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

  Descripción de cada una de las tinciones selectivas:
Tinción de endosporas:

Tinción de flagelos:
1. Hacer crecer el organismo Se tiñerá a temperatura ambiente en agar sangre
durante 16 a 24 horas.
2. Agregue una pequeña gota de agua a un portaobjetos de microscopio.
3. Sumerja un asa de inoculación estéril en agua estéril.
4. Toque brevemente el borde de la colonia con el asa llena de agua (esto permite que
las células móviles naden hacia la gota de agua).
5. Toque el bucle lleno de células móviles con la gota de agua en el portaobjetos.
Nota: agitar el bucle en la gota de agua en el portaobjetos hace que los flagelos se
desprendan de la célula.
6. Cubra la gota de agua ligeramente turbia en el portaobjetos con un cubreobjetos.
Una preparación húmeda adecuada apenas tiene suficiente líquido para llenar el
espacio debajo de un cubreobjetos. Son preferibles los pequeños espacios de aire
alrededor del borde.
7. Examine el portaobjetos inmediatamente por debajo de 40× a 50× en busca de
células móviles. Si no se ven células móviles, no continúe con la tinción.
8. Si se observan células móviles, deje el portaobjetos a temperatura ambiente durante
5 a 10 minutos. Esto permite que las células bacterianas se adhieran al portaobjetos
de vidrio o al cubreobjetos.
9. Aplique 2 gotas de tinte de flagelos RYU suavemente en el borde del cubreobjetos.
El tinte fluirá por acción capilar y se mezclará con la suspensión celular. Las
pequeñas bolsas de aire alrededor del borde del preparado húmedo son útiles para
favorecer la acción capilar. (Nota: el tinte Ryu tiene dos componentes. La solución
I, el mordiente, contiene 10 ml de una solución acuosa de fenol al 5%, 2 g de ácido
tánico y 10 ml de una solución acuosa saturada de sulfato de aluminio y potasio-12
hidrato. Solución II, el tinte, es una solución etanólica saturada de cristal violeta (12
g en 100 ml de 95% etanol). La tinción final se preparó mezclando 1 parte de
 solución II con 10 partes de solución I y luego filtrando la mezcla a través de papel
de filtro para eliminar el precipitado grueso.

Tinción de genoma:
La tinción de genoma es una técnica utilizada para visualizar el ADN en una muestra. La
tinción de genoma se puede realizar utilizando diferentes tintes, como el yodo, la etidio
bromuro y el DAPI. El procedimiento de tinción de genoma generalmente implica la
fijación de la muestra, la permeabilización de la membrana celular y la incubación con el
tinte. La muestra se puede visualizar utilizando un microscopio de fluorescencia o un
microscopio confocal

Tinción de capsula:
La tinción de cápsula es una técnica de coloración diferencial que tiene la propiedad de
resaltar la estructura polisacárida que rodea a ciertas bacterias y levaduras denominada
cápsula. Se utiliza en los laboratorios clínicos para ayudar al diagnóstico de ciertas
patologías originadas por microorganismos capsulados.
Existen varias técnicas sencillas para demostrar la presencia de la cápsula en los
microorganismos que la poseen, estas son: la tinción negativa, la tinción de Anthony y una
variante que combina las dos anteriores.
La tinción negativa se utiliza principalmente en muestras de LCR cuando se sospecha la
presencia de la levadura Cryptococcus neoformans. Esta levadura es una causa frecuente de
meningitis.
Esta técnica utiliza nigrosina o tinta china y se fundamenta en crear un contraste entre el
fondo del preparado y la cápsula impenetrable del microorganismo. El fondo se tiñe de
oscuro y la cápsula queda incolora. De esta manera se pone en evidencia esta estructura. En
cuanto a la técnica de Anthony se puede decir que es mayormente utilizada en laboratorios
de docencia para demostrar la estructura polisacárida en bacterias como Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis. El uso de esta técnica
para fines diagnósticos es muy poco frecuente, ya que existen otras pruebas de rutina que
permiten identificar a estos microorganismos.

Tinción de Anthony: La tinción de Anthony utiliza como colorante al cristal violeta.

Este teñirá el cuerpo bacteriano y el fondo de color violeta. Por otra parte, se utiliza sulfato
de cobre al 20%. Este sirve de solución de lavado, es decir, quita el exceso de cristal violeta
de la preparación, haciendo que las cápsulas se aclaren pero sin que el cuerpo bacteriano ni
el fondo pierdan el color.

Materiales

– Leche tornasolada.

– Lámina portaobjeto.

– Cristal violeta al 1%.

– Sulfato de cobre al 20%.

– Microscopio óptico.
– Aceite de inmersión.
Procedimiento

Esta técnica consiste en:

1. Cultivar el microorganismo en leche tornasolada por 36 horas.

2. Colocar una gota del cultivo en el extremo de una lámina porta objetos y al lado
colocar una gota de cristal violeta, mezclar y extender con el extremo de otro
portaobjetos.

3. Secar al aire libre y no fijar al calor.

4. Lavar con solución de sulfato de cobre al 20%, dejar secar al aire libre.

5. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Buscar hacia los extremos del
extendido.

Es importante no utilizar calor ni para fijar, ni para secar, ya que ello daña la cápsula.
Tampoco lavar con agua.