Digestión: El objetivo es romper los enlaces que mantienen unidos a los polipéptidos y
convertirlos en sustancias químicas mas simples. Estas reacciones puedes acelerarse DIGESTIÓN catalizadores→ (1) n - C -NH2 + mH2SO4 → CO2 + (NH4)2
La muestra se descompone en considerablemente con la presencia de un catalizador y de una sustancia neutra. SO4 + SO2 proteína calor→ DESTILACIÓN (2) (NH4)2SO4 + 2 NaOH →
caliente medio sulfúrico, en 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O
Destilación: Este paso separa el amoníaco de la mezcla de digestión.
− Kjeldah presencia de un agente reductor
(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) → NH4 + H2BO3- (ion borato) TITULACIÓN
catalizador (mercurio, cobre o
l selenio). Titulación: Cuando el amoníaco se disuelve en la solución que atrapa el ácido, neutraliza El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCI
parte del HCI que encuentra allí. (o H2SO4) estandarizado: (4) H2BO3-+H→H3BO3.
. .
Combustión: La muestra se pesa y se purifica de los gases atmosféricos, se introduce en un
horno de alta temperatura y se quema rápidamente en presencia de oxígeno puro a 1000C°. Conduce a la liberación de sustancias como dióxido de
carbono, agua y, sobre todo, nitrógeno en forma de diferentes
El método dumas es un método
Reducción y separación: Los gases de combustión se recogen y pasan a un horno de alta óxidos (NyOx). Muestra + O2 → CO2 + H20 + NxOy + O2 +
preciso y sensible para la
temperatura y pasan a través del cobre caliente para eliminar el oxígeno y convertir los óxidos otros óxidos.
− Dumas determinación del nitrógeno en
muestras orgánicas. de nitrógeno en nitrógeno molecular.
Eliminan el agua y el dióxido de carbono.
Detección: La señal medida por el detector de conductividad térmica se convierte en contenido CO2 + H20 + NxOy + O2 + Cu → CO2 + H20 + N2 → N2.
total de nitrógeno. Se puede usar ácido aspártico, acetanilida, urea, atropina y otros reactivos.
.
.
Implica la emisión de luz de una fuente de espectro 1. La luz del infrarrojo cercano se dirige a una muestra.
cercano al infrarrojo cercano, que se dirige hacia la 2. La luz se modifica de acuerdo con la composición de la muestra y se
muestra a analizar. Parte de esta luz es absorbida detecta esta luz modificada (ver transmisión y reflectancia a continuación)
METODO NO − NIR-IR por la muestra, mientras que otra parte es
3. Las modificaciones espectrales se convierten en información sobre la
transmitida o reflejada. Luego se mide la cantidad de
EXTRACTIVO luz que se absorbe, se transmite o se refleja en composición de la muestra
diferentes longitudes de onda mediante un detector. 4. Estos algoritmos de conversión se denominan "calibraciones”
.
Está técnica determina el contenido de proteínas
mediante la valoración ácido- base, ya que, tras la
1. Tomar 10 gramos de la muestra en un matraz Erlenmeyer.
adición de formol a la muestra, el formaldehido se
2. Añadir 20 mL de agua destilada y adicionar unas gotas de fenolftaleína.
− Sorense une a los grupos amino de los aminoácidos de las 3. Neutralizar la acidez titulable natural de la muestra con la solución de hidróxido sódico hasta
proteínas dejando los grupos carboxilos libres. la aparición de un color rosa.
La reacción resultante de este método es:
Es un proceso reversible mediante el cual un gas Se mide el colorante no adherido, soluble posterior a la equilibración de la ración y la
− Adsorcion es fijado en un sólido, habitualmente un material remoción del complejo insoluble por centrifugación y filtrado. El colorante no adherido La proteína + el exceso de colorante = complejo
poroso. El sólido que adsorbe es el adsorbente y esta inversamente relacionado al contenido proteico de la muestra. de proteína – colorante insoluble + colorante
de adherido soluble.
el material gaseoso adsorbido en la superficie es
colorantes el adsorbato.
.
-Disolver monocapas celulares y / o Cell Pellets en un tampón de lisis de volumen El triptófano, la tirosina y la fenilalanina son
Se basa en el principio físico de apropiado. -Para evitar la dispersión de la luz es importante verificar que la solución de aminoácidos que se encuentran presentes
proteínas no esté turbia. Centrifugar a 10000 rpm para 10 acero inoxidable y otros
− Absorbancia absorción de luz de ciertos
artículos que no se pueden esterilizar en autoclave 4 °C para eliminar los restos celulares.
en proteínas y absorben luz en la región
a 280 nm(uv) aminoácidos en las proteínas, en ultravioleta, debido a esta característica, la
-Encienda la lámpara UV del espectrofotómetro (o lector de placas). -Seleccione la lectura
concreto en el espectro mayoría de las proteínas absorben luz a 280
de absorbancia en 280nm..
ultravioleta (alrededor de 280 nm). nm.
La turbiedad producida cuando una proteína se mezcla con alguno La cantidad de luz dispersada depende
Se mide el nivel de atenuación de un haz de de los precipitantes comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido de la cantidad de partículas presentes
luz en la muestra, el que se produce gracias sulfosalicílico y ferrocianuro de potasio en ácido acético) para en la solución, por lo que se puede
Métodos − Turbidimetria a los fenómenos de absorción y dispersión proteínas en bajas concentraciones, se puede utilizar como un calcular la concentración de partículas
de la luz. índice de la concentración de proteínas. La turbiedad se mide a partir de la medida de la turbidez..
extractivos físicos espectofotométricamente.
Pipetear 0,1 ml de la solución proteica a cuantificar, agregar 2 ml del Ciertas moléculas absorben luz de una
También conocida como espectroscopia reactivo de Bradford. Agitar vigorosamente. A los 2 minutos longitud de onda específica para
− Fluorometria de fluorescencia, toma como base la aproximadamente, medir la absorbancia de la solución a 595 nm. El después emitirla a una longitud de onda
emisión fluorescente de una muestra. producto coloreado dentro de la primera hora de producida la reacción. distinta, y por lo general mayor. Dichas
Para estimar la cantidad de proteínas en la solución se debe utilizar moléculas son llamadas fluorocromos..
una curva de calibración de proteínas.
1. Se toma un tubo de ensayo y se colocan tres centímetros cúbicos de albúmina. Se basa en la reacción coloreada del reactivo de Biuret. Biuret
Conocido también como reactivo de produce un complejo de color púrpura al reaccionar con una
Biuret y prueba de Biuret, este método 2. Se añaden 2 centímetros cúbicos de solución de hidróxido de sodio al 20%. solución alcalina de sulfato de cobre. Los péptidos (a partir de los
− Biuret busca detectar químicamente los tripéptidos) y las proteínas reaccionan con el reactivo de Biuret. Los
3. Inmediatamente se agregan 4 o 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%. iones cúpricos forman un complejo de coordinación con los pares
enlaces peptídicos, que son los que
de electrones no compartidos del N, presente en los aminoácidos
unen a los aminoácidos de las proteínas 4. El resultado es que la mezcla se torna de color violeta, indicando la presencia de proteínas..
de las proteínas.
a) Carbonato sódico al 2 % en hidróxido sódico O'IO N.
b) Sulfato cúprico al 0,5 % en tartrato sódico al 1 %. Estas disoluciones deben conservarse por separado y mezclarse El Cu+ entonces reacciona con el reactivo de Folin, en la reacción
momentos antes de su utilización. de Folin Ciocalteau, donde, en sustancia, el fosfomolibdotungstato
c) Mezcla de reactivos a y b en la relación 50: 1 en volumen. se reduce a azul de heteropolimolibdeno por oxidación catalizada
Empleando un medio alcalino y por Cu+. Las reacciones dan como resultado un color azul fuerte.,
METODOS técnicas de colorimetría, se mide el d) Reactivo Folin-Ciocalteu diluido con igual volumen de agua bidestilada (34). A 1 ml de la disolución proteica (en agua o que depende en parte del contenido de tirosina y triptófano.
EXTRACTIVOS − Lowry total de proteínas comparando la hidróxido sódico 0'2 N) que contenga de 25-500 ug, se le añaden 5 ml de disolución c. Se deja reposar durante 10 minutos
diferencia cromática con una y a continuación se incorporan 0'5 ml del reactivo d agitando constantemente. Se introduce en un baño de agua durante 30
QUIMICOS segunda muestra minutos. Por último, se mide el color desarrollado en un espectrofotómetro..
Pipetear 0,1 ml de la solución proteica a cuantificar, agregar 2 ml del Tiene una reacción colorimétrica de proteínas con un
reactivo de Bradford. Agitar vigorosamente. A los 2 minutos tinte, Coomassie Azul Brillante G-250. Las proteínas se
Se utiliza un colorante conocido como
aproximadamente, medir la absorbancia de la solución a 595 nm. El unen al tinte en un ambiente ácido., induciendo un
azul de coomassie G-250, el que
producto coloreado dentro de la primera hora de producida la cambio espectral del color marrón (absorbancia máxima
− Bradford permite teñir proteínas para su
reacción. Para estimar la cantidad de proteínas en la solución se debe a 465 nm) al azul (absorbancia máxima a 610 nm)..
posterior medición
utilizar una curva de calibración de proteínas.
