OCTUBRE 3/2023 2.

Principios de
CURSO DE VIROLOGÍA
cultivos celular
Escuela de Microbiología
Universidad de Antioquia

➢ Subcultivo celular
➢ Soluciones y diluciones

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Laboratorio #2
Objetivo general
Abordar los principios básicos de cultivos celular y su importancia en las practicas de
virología
Objetivos específicos
✓ Conocer los requerimientos básicos de mantenimiento y manejo necesarios para
realizar un cultivo de células VERO CCL81
✓ Practicar cálculos que involucren cantidades de soluto y solvente, relacionando
entre si dichas magnitudes
✓ Aplicar la preparación de soluciones y diluciones en la siembra de células

Fundamentos de cultivo celular

El cultivo de células ha sido una práctica desarrollada principalmente para los laboratorios de
investigación, gracias a ella se han podido obtener aislados de diferentes agentes virales para su estudio,
enfocando los esfuerzos al desarrollo de terapias antivirales para combatir las enfermedades de origen
viral. Luego de las técnicas en embriología, los cultivos celulares se convirtieron poco a poco en la
principal técnica in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, y de este modo, comprender el
funcionamiento de pequeños sistemas tisulares y el impacto del cambio de ciertas variables en su vida
media y metabolismo. En el área de virología, además de permitir el aislamiento viral de una forma
accesible, también han facilitado el estudio de toda la biología celular y molecular de los virus,
descubrimiento de nuevos virus para dar así, grandes avances en el estudio de interacción virus
(huésped)-células (hospedero).

Para simular el microambiente metabólico de un conjunto de células, se debe semejar de igual manera
los requerimientos nutricionales en un medio líquido artificial llamado medio de cultivo celular, el cual
posee azucares, aminoácidos, sales y proteínas en la proporción adecuada, lo que permite el crecimiento
celular (tabla 1), el medio más usado es el DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco). Al mimetizar
el ambiente del cual provienen, las células podrán ser susceptibles y permisivas a las infecciones virales,
a su vez que conserva las propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Este conjunto de procesos
in vitro se han convertido en la base principal de la virología actual.

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Tabla 1. Componentes básicos de los medios de cultivo celular.

Componentes Función
Sales En el medio ayudan a mantener el equilibrio osmótico y a regular el potencial
inorgánicas de membrana al proporcionar iones de sodio, potasio y calcio.
La regulación del pH es crítica para establecer las condiciones óptimas de
pH
cultivo. El pH óptimo de crecimiento celular se encuentra entre 7,2 y 7,4.
Son los bloques de construcción de las proteínas, y por tanto son ingredientes
obligatorios de todos los medios de cultivo conocidos. Se necesitan para la
proliferación celular y su concentración determina la densidad celular máxima
Aminoácidos
alcanzable. La L-glutamina, un aminoácido esencial, es particularmente
importante que provee nitrógeno para el NAD, el NADPH y los nucleótidos y
sirve como una fuente de energía secundaria para el metabolismo.
Son la principal fuente de energía. La mayoría de los medios contienen glucosa
Carbohidratos
y galactosa.
Muchas vitaminas son esenciales para el crecimiento y la proliferación de las
Vitaminas células. Las vitaminas no pueden ser sintetizadas en cantidades suficientes por
las células y son, por tanto, suplementos importantes para el cultivo de tejidos.
Se utilizan para evitar la contaminación de los cultivos celulares por bacterias
Antibióticos y u hongos. Su concentración debe ser estrictamente controlada para evitar
antimicóticos efectos tóxicos en las células. Los más usados son penicilina, estreptomicina y
anfotericina B.
El suero es uno de los componentes más importantes de los medios de cultivo
celular y aporta al cultivo factores de crecimiento, aminoácidos, proteínas,
vitaminas, carbohidratos, lípidos, hormonas etc. El suero se debe inactivar
previamente con calor para evitar contaminaciones con agentes infecciosos y
Suero la lisis mediada por el sistema del complemento. Debido a la presencia
especialmente de factores de crecimiento, la concentración del suero en el
medio puede variar. Así, por ejemplo, para los medios de crecimiento se utiliza
una concentración entre 10-15%, mientras que para el mantenimiento celular
la concentración disminuye a un 2%.

Tipos de cultivo celular

➢ Cultivos primarios: Se denominan así a aquellos cultivos obtenidos directamente a partir de un

tejido u órgano. En estos cultivos las células conservan sus características originales y su
proliferación es muy limitada. Una vez han consumido los nutrientes del medio de
mantenimiento y han alcanzado confluencia de más del 90% (las células ocupan el 90% o más de
la superficie disponible), las células deben ser removidas del recipiente de cultivo a un nuevo
soporte. Esta operación se denomina subcultivo o pase.

➢ Línea celular: Provienen de los sucesivos pases del cultivo primario, lo que promueve que la
población celular sea más homogénea y dan lugar a líneas celulares semicontinuas. Estas células
pueden prolongarse entre 20 o 100 generaciones más, pero al superar ese límite de pases entran
en una etapa de senescencia en al que pierden su capacidad de proliferar (en gran parte por el
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 acortamiento progresivo de los telómeros) y mueren. Sin embargo, algunas células (como las
tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas, que crecen
indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma espontánea (exposición a radiaciones
ionizantes o a carcinógenos químicos) o inducida (infección vírica o transfección de ADN) y son
el resultado de un cambio genotípico denominado transformación

Tipos de crecimiento celular

Según la forma en la cual se disponen las células en la fase de crecimiento existen 3 tipos de cultivos
celulares:

➢ Células adherentes o cultivos fijos: Las células requieren de un soporte sólido para proliferar, es
decir, son dependientes de anclaje. Al crecer forman una monocapa que puede desprenderse
por métodos enzimáticos para realizar subcultivos.

➢ Células no adherentes o cultivos en suspensión: Como su nombre lo indica, las células no se

adhieren a una superficie y estas crecen dispersas en el medio líquido. Una vez han agotado los
nutrientes del medio, el subcultivo se realiza haciendo diluciones de las células en medio fresco.

Diluciones y soluciones
Una disolución es una mezcla homogénea a nivel molecular o iónico de dos o más sustancias puras que
no reaccionan entre sí, cuyos componentes se encuentran en proporciones variables. Estas tienen como
características generales:

a) Al disolver una sustancia, el volumen final es diferente a la suma de los volúmenes del disolvente
y el soluto, debido a que los volúmenes no son aditivos.

b) Las propiedades físicas de la disolución cambian y van a depender de su concentración, mientras

que las propiedades químicas no se alteran.

c) La cantidad de soluto y la cantidad de disolvente se encuentran en proporciones variables y va a

estar relacionada con la solubilidad del soluto en el disolvente, es decir, tiene que ver con la
cantidad de soluto que es capaz de admitir este disolvente.

La cantidad de soluto disuelto en una cantidad dada de disolución se denomina concentración y hay
varias formas de expresarla, una de ellas es la forma empírica, es decir, son aquellas que se dice que
están concentradas o diluidas con base en la cantidad de soluto, pero no se tiene cuantificado la
cantidad de soluto y solvente. Por ejemplo: café suave o fuerte, jugo dulce (con mucho azúcar) o simple.
Por el contrario, las disoluciones valoradas son aquellas en las que la concentración se determina de
manera cuantitativa y así se conoce con precisión la cantidad de soluto y de solvente que hay en la
disolución. Profundizaremos en las más usadas en el cotidianidad de un laboratorio de virología:

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 ➢ Dilución Simple (factor de dilución): Es aquella en la que se combina un volumen unitario de un
material líquido de interés con un volumen apropiado de un líquido disolvente para alcanzar la
concentración deseada. El factor de dilución es la cantidad total de volúmenes de unidades en
las que se disolverá su material. Por ejemplo, una dilución 1:5 implica combinar 1 unidad de
volumen del material a diluir + 4 volúmenes unitarios del medio disolvente (por lo tanto, 1 + 4 =
5 = factor de dilución).

Ejemplo 1: Diluir una solución de formaldehido 1:300. Mezcle 1 unidad de volumen de solución de
formaldehido con 299 volúmenes de agua grado 1.

En algunos casos, las soluciones se expresan en términos de "X", un indicador de la concentración

relativa de soluto. Es común encontrar estas concentraciones “X” en soluciones madre (stock) que
típicamente se deben diluir hasta 1x para su uso. Por ejemplo, el Phosphate Buffered Saline (PBS) es
preparado como una solución madre 20X. Sin embargo, se diluye hasta 1x (o sea se diluye 20 veces)
antes del uso.

Ejemplo 2: Se puede preparar una solución 1X de PBS a partir de una solución madre 20X de PBS
mezclando un volumen unitario de 20X PBS con 19 volúmenes de agua

➢ Dilución en serie: es simplemente una serie de diluciones simples para reducir la concentración
de un soluto al adicionar más solvente. La fuente del material de dilución para cada paso
proviene del material diluido del anterior y el factor de dilución total en cualquier punto es el
producto de los factores de dilución individuales en cada paso (Figura 1). Factor de dilución final
(FD) = FD1 * FD2 * FD3, etc.

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 Ejemplo 3: En el laboratorio de virología los estudiantes realizan una dilución en serie de tres pasos
1:100 de un cultivo celular. El paso inicial combina 1 unidad de volumen de cultivo (ejem: 10 μL) con
99 volúmenes de unidad de medio de cultivo (990 μL) = dilución 1:100. En el siguiente paso, se
combina un volumen de la dilución 1:100 con 99 volúmenes unitarios de medio que ahora arroja
una dilución total de 1:100 * 100 = 1:10.000. Repetido nuevamente (el tercer paso) la dilución total
sería 1:100 * 10.000 = 1:1.000.000 de dilución total. La concentración de células es ahora un millón
de veces menor que en la muestra original.

Práctica
A cada grupo se le entregará una botella de cultivo de 25cm2 (T25), la cual tiene una monocapa células
VERO CCL81 con una confluencia mayor al 80%.

➢ Verificar en el microscopio invertido la morfología y la confluencia.

➢ Realizar 5 lavados con 1 mL de PBS 1x suavemente por las paredes de la botella (no directamente
sobre la monocapa) para eliminar el contenido del medio de crecimiento DMEM (si aún observa
alguna coloración proveniente del medio, realice más lavados hasta observar el PBS translucido).

➢ Retirar el PBS 1x y agregar 500 uL de tripsina. Homogenizar el contenido para que la tripsina
cubra toda la monocapa e incubar a 37° C durante un máximo de 10 min. Verificar el estado
desprendimiento de las células cada 2 min. Observe el cambio en la morfología por acción de la
tripsina.

➢ Una vez se han desprendido las células es momento de inhibir la acción de la tripsina,
adicionando 1 mL de DMEM al 5% de SFB (suero fetal bovino).

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 ➢ Tomar el completamente el contenido de la botella y transferir a tubo tipo falcon de 15mL.
Centrifugar entre 1.500 rpm a 1.800 rpm durante 5 minutos, con aceleración de 5 y
desaceleración de 5.

➢ Descartar el sobrenadante por inversión y resuspender el pellet celular suavemente en 1 mL de

DMEM al 5% SFB

➢ Para el conteo: realizar dilución 1:10 con azul de tripano para determinar la cantidad de celular
en cámara de Neubauer

El conteo debe realizarse en los 4 cuadrantes del extremo de la cámara. Sólo se debe contar en el área
comprendida dentro de los 16 cuadrados y excluir las células que se encuentra más allá de esta área
como se muestra cuadrante a. Para realizar el conteo, se recomienda seguir a dirección que se muestra
en cuadrante b.

Luego de conteo responda:

1. Determinar la cantidad de células obtenidas por mL de volumen de resuspensión.

2. Para sembrar 100.000 células en 1 pozo en un volumen final de 200 uL de DMEM al 2% SFB. ¿Qué
volumen de células del conteo inicial debe agregar y cuánto de medio de cultivo?
3. Realice dilución 1:2 a partir del primer pozo de siembra (escriba los cálculos)

Visualizar en el microscopio los diferentes pozos con las diferentes siembras y entregue la placa al
profesor encargado.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Álvarez, D. M. D. C. D. (2021). Cultivos celulares: reducción histórica en el uso de animales de

laboratorio. Revista Fesahancccal, 7(1), 17-24.
• Dilnessa T*1 and Zeleke H. Cell Culture, Cytopathic Effect and Immunofluorescence. Diagnosis of
Viral Infection. J Microbiol Modern Tech. 2017, 2 (1): 1-8.
• Anderson Greg. How to make solutions and dilutions. Bates college, Lewiston. 2018.