FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
CULTIVOS CELULARES

INTEGRANTES CODIGO
Brayan Camilo Pulido Franco 13592117559
Keily Alicia Bertel Peñate 13592129276
Maidy Alejandra Suarez Oviedo 13592127579
Yuri Andrea Riveros Lopez 13592123212

Línea celular A549

Fig 1. Línea celular A549 (1).

Las células A549 son células humanas de epitelio alveolar basal. Son de naturaleza
escamosa y responsables de la difusión de agua y electrolitos a través de los alvéolos del
pulmón. In vitro estas crecen como una monocapa adhiriéndose al matraz de cultivo, e in
vivo pueden inducir tumores en ratones atímicos. Es derivada del ADENOCARCINOMA
humano, células epiteliales basales ALVEOLARES aisladas de los pulmones de un paciente
masculino en 1972. La línea celular es positiva para QUERATINAS, puede sintetizar
LECITINAS y contiene altos niveles de ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS en su
membrana plasmática. Se utiliza como modelo para la función de los ALVEOLOS
PULMONARES y las infecciones virales, como huésped de TRANSFECCIÓN, y para la
EVALUACIÓN PRECLINICA DE MEDICAMENTOS. (1)
Morfología y tiempo de duplicación de las células A549
Acerca de la morfología, en un análisis de las células A549, se estimó que el diámetro
celular medio de las células en microscopía invertida e imágenes TEM era 14,93 µm y 10,59
µm respectivamente. Sobre el tiempo de duplicación de las células A549, se ha determinado
que suele ser de 22 horas, aunque a veces puede tardar hasta 40 horas; y para garantizar
que las células A549 sigan siendo viables, el cultivo debe almacenarse en fase de vapor de
nitrógeno líquido (2).

Características de las células A549

Se sabe que las células A549 son muy proliferativas e invasivas, y suelen ser resistentes a
la quimioterapia y la radioterapia (3). Estas células tienen la capacidad de sintetizar lecitina
y contienen un alto porcentaje de ácidos grasos insaturados que son responsables del
mantenimiento de los fosfolípidos de la membrana (2).

● Medio de cultivo celular: Deberá seleccionar un medio de cultivo celular

adecuado para su tipo de célula.

Las células A549 normalmente se cultivan usando un medio base F12/K (Gibco/Invitrogen).
Se añade suero bovino fetal (FBS) al 10 % al medio base para obtener el medio de
crecimiento completo. Las células también se pueden cultivar en medios completos que
consisten en MEM de Dulbecco (DMEM) modificado con FBS al 10% (2). Las células
pueden cultivarse como adherentes o en suspensión in vitro . La línea celular A549 crece
fácilmente y el tiempo de duplicación del recuento de células suele ser de 22 a 40 horas.

El medio de cultivo elegido para el cultivo de las células A549 es el medio de cultivo DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) suplementado con suero fetal bovino (FBS) y
antibióticos. El DMEM es un medio de cultivo ampliamente utilizado que proporciona los
nutrientes esenciales necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células (2).

Sus componentes principales incluyen:

-Sales minerales: El DMEM contiene una mezcla equilibrada de sales minerales, como
cloruro de calcio, cloruro de magnesio y fosfato de potasio, que proporcionan los iones
necesarios para el crecimiento celular.

-Aminoácidos: El DMEM contiene una mezcla de aminoácidos esenciales y no esenciales

que son necesarios para la síntesis de proteínas y el crecimiento celular.

-Vitaminas: El DMEM está suplementado con vitaminas, como la biotina, el ácido fólico y la
vitamina B12, que son esenciales para el metabolismo celular y el crecimiento.

-Glucosa: El DMEM contiene glucosa como fuente de energía para las células.

● Suero fetal bovino (FBS): Se suele añadir a los medios de cultivo celular para
proporcionar nutrientes y factores de crecimiento a las células.

El Suero Fetal Bovino (FBS) es un componente utilizado en el medio de cultivo MEM al 10%
para el cultivo de células A549. El FBS proporciona nutrientes esenciales y factores de
crecimiento que promueven la viabilidad y el crecimiento de las células. Además, el FBS
puede ayudar a mantener la integridad de las células A549 y mejorar su capacidad de
proliferación. Se ha observado que el uso de FBS en el medio de cultivo MEM puede
aumentar la eficiencia del cultivo y garantizar la obtención de datos significativos y
confiables en los estudios in vitro de las células A549.

● Antibióticos: Los antibióticos como la penicilina/estreptomicina se añaden a

menudo a los medios de cultivo celular para evitar la contaminación.
En el cultivo de células de la línea A549 se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana,
se suelen agregar antibióticos, como la penicilina y la estreptomicina, al medio de cultivo.
Penicillin-Streptomycin Solution (200X) contiene aproximadamente 20 000 U/ml de
penicilina y 20 mg/ml (es decir, 20 000 μg/ml) de estreptomicina en una solución de cloruro
de sodio al 0,85 %. Es adecuado para el cultivo celular en una concentración de trabajo de
200 veces. La penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) es la solución antibiótica más utilizada
para el cultivo de células de mamíferos debido a su eficaz acción combinada contra
bacterias grampositivas y gramnegativas (4) (5).

● Tripsina/EDTA: Se utiliza para separar las células de las placas de cultivo para
su paso.

Según el protocolo de cultivo de la línea A549, se debe agregar a las células, tripsina al
0,05-0,25 %/ EDTA 0,53 mM (3).

● Solución salina tamponada con fosfato (PBS): Se utiliza para lavar las células
y para otras aplicaciones como la dilución de reactivos.

El PBS utilizado es el EDTA, en un matraz T75, se agregan 2 ml de tripsina-EDTA con el fin

de observar el desprendimiento de la capa celular bajo un microscopio invertido. El
desprendimiento ocurre dentro de 3 a 10 minutos (3).

● Fijadores: Reactivos como el formaldehído o el paraformaldehído se utilizan

para fijar células para inmunotinción u otros ensayos.
Para fijar las células de la línea celular A549 y hacer ensayos de inmunotinción estas se
fijan con paraformaldehído (2% en PBS) durante 15 minutos (6).

● Anticuerpos primarios y secundarios: Se utilizan para la inmunotinción y la

detección de proteínas específicas.
Para la inmunotinción y la detección de proteínas específicas, las células se incuban con
anticuerpo monoclonal de conejo anti-ubiquitil-histona H2A humana (Cell Signaling
Technologies #8240 S; dilución 1:1600 en PBB) durante 1 h a temperatura ambiente y 1,5
horas adicionales a 4 °C (6).
Luego se recomienda lavar las células con PBB (cuatro veces) e incubar con el anticuerpo
secundario (IgG anti-Conejo de burro AlexaFluor 647 de Jackson ImmunoResearch
#711-605-152 a una dilución 1:250 en PBB) durante 1 hora a temperatura ambiente en la
oscuridad (6).

● Colorantes fluorescentes: Los colorantes fluorescentes como Hoechst o el

yoduro de propidio pueden utilizarse para etiquetar células para microscopía o
citometria
Después de utilizar los anticuerpos en las células, estás se lavan cuatro veces con PBB
(PBB se refiere a "albúmina sérica bovina al 0,5% en PBS) , y se tiñen con Hoechst 33342
(1 mg/100 ml en agua) durante 30 segundos y se lavan con PBS (tres veces) (El PBS
utilizado es el EDTA). Luego, las células se deben mantener en PBS a 4 °C antes de
obtener imágenes, no más de 7 días a de flujo para marcar células para microscopía o
citometría de flujo (6).

● Ensayos de viabilidad celular: Pueden utilizarse reactivos como el azul tripán

o el yoduro de propidio para evaluar la viabilidad celular.

Se utiliza un ensayo MTT para medir la viabilidad celular, el ensayo de reducción de

tetrazolio MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) penetra fácilmente
en las células eucariotas viables. Este ensayo requiere la incubación de un reactivo con una
población de células viables para convertir un sustrato en un producto coloreado o
fluorescente que pueda detectarse con un lector de placas (7).

El sustrato de MTT se prepara en una solución fisiológicamente equilibrada, se añade a las

células en cultivo, normalmente a una concentración final de 0,2 - 0,5 mg/ml, y se incuba
durante 1 a 4 horas esto genera una señal proporcional al número de células viables
presentes (7).

Usualmente el reactivo que más se utiliza para evaluar la viabilidad celular mediante un
ensayo MTT es azul Alamar; este se ha utilizado habitualmente para estudios de viabilidad
celular y citotoxicidad en diversos sistemas biológicos y medioambientales (8).

● Reactivos de biología molecular: Dependiendo de sus necesidades de

investigación, puede necesitar reactivos adicionales como kits de extracción de
ADN, reactivos PCR o siRNA.
No se necesitan reactivos adicionales como kits de extracción de ADN, reactivos PCR o
siRNA.

● Reactivos de Transfección: Lipofectamina:

La Lipofectamina es un reactivo de transfección ampliamente utilizado para la introducción
de ácidos nucleicos en células A549. (9)

Reactivos de Extracción de Ácido Nucleico: Trizol:

Trizol es un reactivo común para la extracción de ARN y ADN de células A549 y se utiliza en
técnicas como la RT-PCR y la PCR cuantitativa. (10)

Reactivos de RT-PCR y PCR Cuantitativa:

SuperScript III Reverse Transcriptase: Este enzima se utiliza para la síntesis de ADN
complementario (cDNA) a partir de ARN en reacciones de RT-PCR. (11)

SYBR Green Master Mix: SYBR Green se utiliza en la PCR en tiempo real para la detección
y cuantificación de ácidos nucleicos. (12)

Reactivos de Western Blot:

Anticuerpos secundarios HRP-conjugados: Estos anticuerpos se utilizan en Western blot
para detectar proteínas específicas. (13)

● Enzimas y sustratos:
Enzimas de Digestión de Ácido Nucleico: Rnasa A: Se utiliza para degradar el ARN en
muestras celulares, permitiendo la extracción de ADN libre de ARN. (14)

Enzimas de Amplificación de ADN: Polimerasa Taq: Es una enzima utilizada en la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ADN. (15)

Sustratos para Ensayos de Viabilidad Celular: MTT (Bromuro de

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio): Se utiliza en ensayos de viabilidad celular para
determinar la capacidad de las células A549 para convertir el MTT en un producto
coloreado.(16)

Enzimas para Análisis de Expresión Génica: Reverse Transcriptase (RT): Se utiliza para
convertir ARN en cDNA en técnicas de RT-PCR y RT-qPCR. (17)

● Factores de crecimiento y citoquinas:

En un estudio realizado se determinó que el factor de crecimiento transformante beta-1
(TGFbeta-1) es un regulador de la proliferación, diferenciación y apoptosis celular. La
doxorrubicina (adriamicina), una antraciclina que provoca roturas de la doble cadena del
ADN, se utiliza ampliamente en la quimioterapia contra el cáncer. Aquí demostramos que el
TGFbeta-1 mejoró la acción citotóxica (proapoptótica) de la doxorrubicina hacia células
cultivadas de carcinoma de pulmón humano A549. Se utilizaron análisis de transferencia
Western e inmunocitoquímica para mostrar que la doxorrubicina indujo la degradación de
PARP en células A549, y el TGFbeta-1 mejoró esa acción del fármaco. Los resultados
obtenidos sugieren la posibilidad de un efecto biomodulador del TGFbeta-1 sobre el
tratamiento de células tumorales con doxorrubicina.(18)

● Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF): El EGF es un factor de crecimiento que

puede promover la proliferación y la diferenciación de las células A549. (19)
● Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF): El HGF puede desempeñar un papel
en la migración y la invasión de células A549. (20)

● Reactivos de lisis celular y extracción de proteínas:

Dentro de los principales reactivos utilizados en estudios para la lisis celular y extracción de
proteínas sin daño de la membrana celular de las células A549 se encuentran:
Reactivos de Lisis Celular: RIPA Buffer (Radioimmunoprecipitation Assay Buffer): El RIPA
buffer es un reactivo de lisis celular ampliamente utilizado para extraer proteínas totales de
las células. Contiene componentes como Triton X-100, SDS, y una serie de sales y buffers.
(20)

Buffer de Lisis de Detergentes NP-40: Otro reactivo común para la lisis celular. Este buffer
contiene NP-40, un detergente no iónico que rompe las membranas celulares. (21)
Protocolo de Extracción de Proteínas:
Tripsina: Para el análisis de proteínas mediante espectrometría de masas, la tripsina se
utiliza comúnmente para digerir proteínas en péptidos. (22)
 ● Reactivos de electroforesis:
En general, el uso de reactivos de electroforesis no es específico para el tipo de célula
A549. Si se deseara hacer una electroforesis los utilizados serían: Agarosa, Ácido Bórico ≥
99.5%, Ác. Acético glacial, Tris base Glicerol, Xileno, cianol, Azul de bromofenol (23)

Reactivos de transfección celular:

Las células A549 son un modelo importante para el metabolismo de fármacos y también se
utilizan como huésped para la transfección de genes.
Altogen Biosystems ofrece un kit de transfección A549 preoptimizado que incluye:

-Reactivo de transfección A549 (0,5 ml/1,5 ml/8,0 ml)

-Potenciador de transfección (0,5 ml) y
-Condensador complejo (0,5 ml)

El kit está optimizado para transfectar ARNip, miARN o plásmido de ADN después de una
transfección estándar o inversa (3).

● Suministros para microscopía:

Medio celular: se utiliza para mantener condiciones óptimas de crecimiento de las células
A549 antes de la preparación de la muestra y durante los experimentos de microscopía.
Placa o portaobjetos de cultivo celular: se utiliza para cultivar células A549 y preparar
muestras para observación. Material de montaje para microscopía: Los materiales de
montaje se utilizan para preservar y cubrir muestras montadas en portaobjetos antes de la
observación microscópica.
Reactivo de fijación: se utiliza para fijar las células A549 antes de la tinción. El
paraformaldehído al 4% es un fijador de microscopios de uso común.
Anticuerpos conjugados con fluoróforo: estos anticuerpos se utilizan en inmunofluorescencia
para detectar proteínas específicas en células A549. Tinciones de ADN y ARN: DAPI (para
núcleos) y Hoechst (para núcleos) son ejemplos de tinciones utilizadas para marcar
componentes celulares específicos.
Tinciones de microtúbulos y microfibrillas: se utilizan reactivos como fitoquímicos, tubulina y
actina para marcar las estructuras citoesqueléticas. Medios de montaje que contienen DAPI:
estos medios de montaje contienen DAPI y se utilizan para montar muestras para teñir
núcleos para la visualización del ADN.
Cubierta de portaobjetos: Se utiliza para cubrir y sellar la muestra en el portaobjetos.
Lo anterior se encuentra descrito en el reciente análisis de “The morphometrical analysis on
the ultrastructure of A549 cells” (24)

Material estéril:
En general para este tipo de estudios se deben tener en cuenta los siguientes parámetros
de esterilidad para evitar contaminación dirigida hacia los cultivos:
Medio de cultivo celular estéril: El medio utilizado para el crecimiento y mantenimiento de
las células A549 debe ser estéril y libre de contaminantes. Estos materiales suelen
presentarse en frascos o bolsas selladas.
Placas de cultivo celular estériles: utilizadas para inocular y cultivar células. Ejemplos de
recipientes estériles son placas de Petri, matraces de cultivo y placas de Petri en placas de
6, 12 o 96 pocillos.
Pipetas estériles: Las pipetas automáticas y manuales deben ser estériles para manipular
muestras líquidas y celulares.
Portaobjetos y cubreobjetos estériles,puntas de pipeta estériles: las puntas de pipeta
desechables deben ser estériles para evitar la contaminación cruzada de las muestras.
Batas, guantes y mascarillas estériles, soluciones y tampones estériles: las soluciones
utilizadas en experimentos y procedimientos deben ser estériles para evitar la
contaminación de las muestras celulares. Y sobre todo, incubadora estéril. (25)

Suministros para la eliminación de residuos:

Para la eliminación de residuos se tienen en cuenta las siguientes opciones:
Separación de los residuos de células A549 de otros tipos de desechos biológicos y
químicos. Utilizando contenedores de desechos biológicos específicos, como bolsas rojas o
amarillas, etiquetadas adecuadamente para la eliminación de residuos biológicos.
Por autoclave o desinfección: Los residuos de células A549 pueden ser autoclavados, lo
que implica la exposición a altas temperaturas y presión para eliminar patógenos y
esterilizar los desechos. Esto es especialmente importante si se trabaja con patógenos o
materiales potencialmente infecciosos.
Por tratamiento Químico: En algunos casos, es posible tratar los desechos con agentes
desinfectantes químicos, siguiendo las recomendaciones de seguridad y procedimientos
establecidos.(25)
APLICACIONES MÁS COMUNES DE LAS CÉLULAS EN CASOS DE ESTUDIOS

Con su origen en el pulmón humano, la línea celular A549 es un modelo celular designado
para estudios de infecciones respiratorias virales .Dado el tropismo de algunos virus
respiratorios , como el virus de la influenza A (IAV), por las células epiteliales respiratorias
humanas, las células A549 representan un modelo particularmente adaptado para
experimentos de infecciones virales y posteriores ensayos de inmunidad innata . (26)

Entre otras aplicaciones se encuentran:

Producción de adenovirus
La línea celular A549 se ha utilizado para la producción de adenovirus . Lo más significativo
es que se ha utilizado para replicar construcciones de adenovirus que no necesitan
complementación por el oncogén viral, región temprana 1A (EA1). También se ha utilizado
como control negativo en ensayos para medir la replicación de adenovirus que carecen de
E1A, así como una línea celular diana para la detección de adenovirus competentes en
replicación.
Modelado de enfermedades
Las células A549 se han utilizado para modelar el epitelio pulmonar alveolar tipo II . Los
estudios han demostrado que esto puede ser particularmente útil en la investigación para
estudiar el procesamiento metabólico del tejido pulmonar y para identificar los mecanismos
de administración de fármacos al tejido. Esta línea celular se ha utilizado no solo para
estudiar el cáncer de pulmón sino también para otras infecciones relacionadas con el
pulmones como alergias, asma e infecciones respiratorias. A continuación se enumeran
algunos ejemplos de estudios de investigación en los que se utilizaron células A549 para
modelar enfermedades.

P53, también conocida como proteína tumoral, es un gen que codifica una proteína que
regula el ciclo celular y actúa como supresor de tumores. M3814 es un inhibidor
farmacológico selectivo de la proteína quinasa dependiente de ADN de serina/treonina
quinasa (DNA-PK) y desempeña un papel vital en la unión de extremos no homólogos. En
un estudio reciente , los investigadores utilizaron líneas celulares isogénicas p53 nulas/de
tipo salvaje A549 y HT-1080 para demostrar que M3814 bloquea la reparación de roturas
bicatenarias inducidas por radiación y mejora la fosforilación y activación de p53.
En otro estudio, se utilizó la línea celular A549 para investigar el papel de las quimiocinas
durante la respuesta local inicial a la infección por Mycobacterium tuberculosis en el pulmón
humano. Los investigadores descubrieron que la línea de células epiteliales alveolares
humanas infectadas con M. tuberculosis producía las quimiocinas MCP-1 e IL-8 mediante la
regulación positiva de sus respectivos ARNm. La producción de estas citoquinas sólo
dependió del crecimiento intracelular de micobacterias y no estuvo relacionada con la
virulencia.
Desarrollo de fármacos
Estas células han demostrado ser excelentes para pruebas in vitro e in vivo de nuevos
fármacos como docetaxel, paclitaxel y bevacizumab. Las pruebas in vivo se realizan
mediante xenoinjertos, mientras que las pruebas in vitro se realizan en cultivo celular. El
modelo de ratón A549 CDX (xenoinjerto derivado de línea celular) es el modelo de
xenoinjerto de cáncer de pulmón más utilizado.
Estudios enzimáticos
La línea celular humana A549 se ha utilizado para probar la capacidad de la
2-(2,4-dihidroxifenil)tieno-1,3-tiazin-4-ona (BChTT) en la inhibición de la proliferación de
células cancerosas y para comprender su mecanismo de acción. a nivel molecular. También
se ha utilizado para estudiar los efectos de la insulina y el factor de crecimiento similar a la
insulina 1 sobre la apoptosis y la proliferación de las células A549.
Entrega CRISPR
CRISPR Cas9, como ya sabemos, es una gran herramienta para editar con precisión el
ADN. Sin embargo, la introducción de la proteína Cas en las células sigue siendo un área
poco investigada y con mucho potencial de innovación. En un estudio reciente, los
investigadores construyeron complejos de ribonucleoproteína Cas9 conjugados con el
nanocuerpo 7D12 y demostraron la transfección de Cas9 mediada por receptores en células
A549 mediante la unión al receptor del factor de crecimiento epitelial. También demostraron
que la transfección con una ribonucleoproteína Cas9 dirigida al gen BRCA2 daba como
resultado una mayor sensibilidad al cisplatino, un fármaco quimioterapéutico, y conducía a
una dosis sintética letal en las células. (26)
 Línea celular MDCK

TINCIÓN

CELL CULTURE BASICS -LIBRO VIRTUAL

[Link]
[Link]

Fig 2. Células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (Línea MDCK). (4)

Estas células son células de riñón canino que se utilizan a menudo en la investigación de
virología y desarrollo de vacunas.

Estas líneas celulares se utilizan para la multiplicación de virus, en donde se infectan con un
virus las células MDCK y tras la infección se cultivan las células en cultivo celular en
condiciones que permiten una multiplicación de los virus y al mismo tiempo una
multiplicación adicional deliberada, en al menos un factor de 2, de las células mediante el
incremento del volumen total del cultivo (2). En las células MDCK se han multiplicado
experimentalmente, además del virus de la gripe, el virus de la estomatitis vesicular, el virus
de Coxsackie B5 (pero no el B3 o el B4), el reovirus tipo 2 y tipo 3, el adenovirus tipo 4 y
tipo 5, y virus de la viruela vacuna. (2)

Las líneas celulares MDCK tienen un valor en el mercado de 541.00 dólares

estadounidenses en el tamaño de 1 vial, este precio es segun la ATCC (5)

● Medio de cultivo celular: Deberá seleccionar un medio de cultivo celular

adecuado para su tipo de célula.

Para el correcto desarrollo del cultivo celular el medio de cultivo más adecuado es el MDCK
CD Medium es un medio químicamente definido, sin suero, sin proteínas y medio libre de
componentes animales formulado para maximizar la producción de vacunas.
 ● Suero fetal bovino (FBS): Se suele añadir a los medios de cultivo celular para
proporcionar nutrientes y factores de crecimiento a las células.

Las células del riñón canino (MDCK) son muy susceptibles a las infecciones virales en
especial la influenza y sus diversos serotipos, por lo tanto el medio para su respectivo
cultivo es el MDCK CD es un medio químicamente definido (CD), sin suero, sin proteínas,
sin componentes animales y sin hidrolizados, pues está diseñado para respaldar el
crecimiento de las células.

● Antibióticos: Los antibióticos como la penicilina/estreptomicina se añaden a

menudo a los medios de cultivo celular para evitar la contaminación.

Los antibióticos, se recomienda que no deben usarse de forma rutinaria ya que su uso
continuo fomenta el desarrollo de resistencia.
Normalmente los antibióticos Zeocin™, higromicina B, puromicina y blasticidina son los más
utilizados para el uso de células estables

● Tripsina/EDTA: Se utiliza para separar las células de las placas de cultivo para
su paso.
● Solución salina tamponada con fosfato (PBS): Se utiliza para lavar las células
y para otras aplicaciones como la dilución de reactivos.

● Ensamblaje y mantenimiento

Retirar las células congeladas del embalaje de hielo seco y colocarlas inmediatamente a
una temperatura inferior a -130 °C, preferiblemente en vapor de nitrógeno líquido, hasta que
estén listas para su uso.

● Procedimiento de manipulación

Para asegurar el nivel más alto de viabilidad, hay que descongelar el vial e iniciar el cultivo
lo antes posible al recibirlo. Si a su llegada es necesario seguir almacenando el cultivo
congelado, debe almacenarse en fase de vapor de nitrógeno líquido y no a -70°C. El
almacenamiento a -70°C provocará la pérdida de viabilidad.

1. Descongelar el vial agitándolo suavemente en un baño de agua a 37°C. Para reducir

la posibilidad de contaminación, mantenga la junta tórica y la tapa fuera del agua. La
descongelación debe ser rápida (aproximadamente 2 minutos).
2. Retirar el vial del baño de agua tan pronto como se descongele el contenido y
descontaminar sumergiéndolo o rociándolo con etanol al 70%. Todas las
operaciones a partir de este momento deben realizarse bajo estrictas condiciones de
asepsia.
3. Transferir el contenido del vial a un tubo de centrífuga que contenga 9,0 ml de medio
de cultivo completo y gire a aproximadamente 125 xg durante 5 a 7 minutos.
Descartar el sobrenadante.
 4. Resuspender el sedimento celular con el medio completo recomendado y
dispensarlo en un matraz de cultivo de 25 cm2 . Es importante evitar una alcalinidad
excesiva del medio durante la recuperación de las células. Se sugiere que, antes de
agregar el contenido del vial, el recipiente de cultivo que contiene el medio de
crecimiento completo se coloque en la incubadora durante al menos 15 minutos para
permitir que el medio alcance su pH normal (7,0 a 7,6).
5. Incubar el cultivo a 37°C en una incubadora adecuada. Se recomienda una
atmósfera de aire con un 5% de CO2 si se utiliza el medio descrito en esta ficha de
producto.

● Procedimiento de subcultivo

Los volúmenes se dan para un matraz de 75 cm2.

● Retirar y desechar el medio de cultivo.
● Enjuagar la capa de células dos veces con tripsina al 0,25% (p/v) - solución de EDTA
0,53 mM para eliminar todos los rastros de suero que contiene inhibidor de tripsina.
● Agregar de 2,0 a 3,0 ml de solución de tripsina-EDTA al matraz y observar las
células bajo un microscopio invertido hasta que la capa de células se disperse
(generalmente dentro de 5 a 15 minutos).
Nota: Para evitar la formación de grumos, no agite las células golpeando o agitando
el matraz mientras espera que las células se desprendan. Las células que sean
difíciles de desprender se pueden colocar a 37°C para facilitar la dispersión.
● Agregar de 6,0 a 8,0 ml de medio de crecimiento completo y aspirar las células
pipeteando suavemente.
● Agregar alícuotas apropiadas de la suspensión celular a nuevos recipientes de
cultivo.
● Incubar los cultivos a 37°C. (5)

● Fijadores: Reactivos como el formaldehído o el paraformaldehído se utilizan

para fijar células para inmunotinción u otros ensayos.
En los cultivos celulares MDCK, como en muchos otros tipos de cultivos celulares, el uso de
fijadores como formaldehído o paraformaldehído generalmente se reserva para estudios
posteriores, como análisis de inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, microscopía y
preparaciones histológica.

● Anticuerpos primarios y secundarios: Se utilizan para la inmunotinción y la

detección de proteínas específicas.
Anticuerpos primarios: Estos anticuerpos son específicos para la proteína de interés que
desea detectar. Se incuban con las células MDCK después de la fijación y la
permeabilización celular. El anticuerpo primario se une a la proteína diana en las células.
Por ejemplo, si está interesado en detectar una proteína de membrana en las células
MDCK, el anticuerpo primario se seleccionaría para reconocer esa proteína en particular.

Anticuerpos secundarios: Los anticuerpos secundarios son específicos para el anticuerpo

primario. Estos anticuerpos secundarios están conjugados con una etiqueta fluorescente o
enzimática que permite la detección de la unión del anticuerpo primario a la proteína diana.
El anticuerpo secundario se une al anticuerpo primario y, por lo tanto, amplifica la señal, lo
que facilita la detección.

● Colorantes fluorescentes: Los colorantes fluorescentes como Hoechst o el

yoduro de propidio pueden utilizarse para etiquetar células para microscopía o
citometría de flujo. para marcar células para microscopía o citometría de flujo.
Tinción: Los microtúbulos se tiñen mediante inmunofluorescencia tratando un cultivo fijado y
permeabilizado de células MDCK con anticuerpos primarios anti- alfa -tubulina de ratón
seguido de anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con Alexa Fluor 568. Los núcleos se
tiñen con SYTOX Green. (4)

● Ensayos de viabilidad celular: Pueden utilizarse reactivos como el azul tripán o

el yoduro de propidio para evaluar la viabilidad celular.
Las NPsZnO (nanopartículas de óxido de zinc) y NPsCuO (nanopartículas de óxido de
cobre) reducen la viabilidad de las células de riñón MDCK e inducen cambios en la
morfología. Las NPsCuO inducen muerte dependiente de autofagia en las células de riñón
MDCK. Las NPsZnO y NPsCuO inducen estrés oxidativo, despolarización de la membrana
mitocondrial y arresto en los estadios del ciclo celular en ambas líneas celulares. Además,
los iones Zn 2+participan en la reducción de la viabilidad de las células MDCK y los iones Cu
2+
reducen la viabilidad de las células MDCK. (6)
La tinción celular con Ioduro de Propidio (IP) permite evaluar la viabilidad mediante la
apreciación de la integridad de la membrana plasmática y nuclear, siendo evaluada la etapa
final de la muerte celular.
● Reactivos de biología molecular: Dependiendo de sus necesidades de
investigación, puede necesitar reactivos adicionales como kits de extracción
de ADN, reactivos PCR o siRNA.

En investigaciones que involucran cultivos celulares MDCK y biología molecular, es posible

que necesite varios reactivos de biología molecular según sus objetivos de investigación.

Kits de Extracción de ADN: Si su investigación implica la extracción de ADN de las células

MDCK, necesitará un kit de extracción de ADN que incluya reactivos como proteasas,
tampones de lisis celular y columnas de purificación.

Reactivos de RT-PCR: Para el análisis de expresión génica o la detección de ARN

mensajero (ARNm), necesitará reactivos para la transcripción inversa y la reacción en
cadena de la polimerasa (RT-PCR). Esto puede incluir enzimas de transcripción inversa,
primers específicos y reactivos de PCR.

Reactivos de PCR en Tiempo Real (qPCR): Si planea cuantificar la expresión génica, los
reactivos de qPCR son esenciales. Estos reactivos incluyen sondas fluorescentes o
colorantes que se unen al ADN amplificado durante la PCR en tiempo real.

Reactivos de Western Blot: Para analizar la expresión y la función de proteínas,

necesitará reactivos de Western blot, que incluyen geles de electroforesis, anticuerpos
específicos para proteínas y reactivos de revelado.
Reactivos de Transfección o siRNA: Si su investigación implica la manipulación genética
de las células MDCK, necesitará reactivos de transfección para introducir genes, ARN de
interferencia (siRNA) u otros oligonucleótidos en las células.

Enzimas de Restricción y Ligasas: Si está realizando análisis de ADN recombinante,

como clonación, necesitará enzimas de restricción y ligasas para manipular fragmentos de
ADN.

Enzimas de Digestión de Proteínas: Para estudios de proteómica o purificación de

proteínas, puede necesitar enzimas de digestión de proteínas, como tripsina.
Marcadores Moleculares y Ladders: Estos reactivos se utilizan como referencias para la
estimación de tamaños de fragmentos en geles de agarosa o poliacrilamida.

Bufferes y Soluciones Estándar: Varios bufferes y soluciones, como solución salina

tamponada (PBS), tampón Tris-HCl, tampón de lisis celular, tampón de electroforesis, etc.,
son fundamentales para diferentes pasos de la investigación.

● Enzimas y sustratos: Si su laboratorio va a realizar ensayos enzimáticos,

puede que necesite enzimas y sustratos específicos para sus experimentos.
El uso de enzimas y sustratos específicos en cultivos celulares MDCK depende de los
objetivos de investigación y los experimentos que esté llevando a cabo. En general, las
células MDCK se cultivan para estudiar diversos aspectos de la biología celular y molecular,
y en algunos casos, pueden requerir el uso de enzimas y sustratos.

Estudios Metabólicos: Si está interesado en estudiar procesos metabólicos específicos en

las células MDCK, es posible que necesite enzimas y sustratos relacionados con esos
procesos. Por ejemplo, si investiga el metabolismo de lípidos, podría usar lipasas y
sustratos relacionados.

Análisis de Expresión Génica y Proteica: En el caso de estudios de expresión génica o

proteica, podría utilizar enzimas y sustratos para la extracción de ácidos nucleicos, la
síntesis de ADN complementario (cDNA), la amplificación de ADN o la cuantificación de
proteínas.

Estudios de Actividad Enzimática: Si está interesado en medir la actividad enzimática en

las células MDCK, necesitará enzimas y sustratos específicos para realizar ensayos
enzimáticos.

Marcadores Bioquímicos y Ensayos Clínicos: En algunas investigaciones clínicas o

biomédicas, podría ser necesario utilizar enzimas y sustratos para evaluar la salud y la
función celular, como en pruebas de función hepática o renal.

● Factores de crecimiento y citoquinas: Dependiendo del tipo de células con las

que células con las que vaya a trabajar, puede que necesite añadir factores de
crecimiento o citoquinas para promover el crecimiento y la diferenciación
celular.
Factores de Crecimiento: Los factores de crecimiento son proteínas o moléculas
señalizadoras que estimulan el crecimiento y la proliferación celular. Pueden ser necesarios
para mantener la viabilidad y el crecimiento de ciertas líneas celulares, incluyendo MDCK.
Por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento
transformante beta (TGF-β) son ejemplos de factores de crecimiento utilizados en cultivos
celulares.

Citoquinas: Las citoquinas son proteínas de señalización celular que desempeñan un papel
crucial en la comunicación entre las células del sistema inmunológico y también pueden ser
relevantes en cultivos celulares de otros tipos celulares, como las células epiteliales MDCK.
Algunas citoquinas, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o el interferón gamma
(IFN-γ), se utilizan en investigaciones para simular respuestas inmunitarias o inflamatorias
en cultivos celulares.

● Reactivos de lisis celular y extracción de proteínas: Estos reactivos se utilizan

para extraer proteínas de las células para su análisis.
Los reactivos utilizados en la lisis celular y extracción de proteínas en cultivos celulares
MDCK son similares a los reactivos utilizados en otros tipos de cultivos celulares.

-Buffer de Lisis Celular: Este buffer suele contener detergentes para romper la membrana
celular y solubilizar las proteínas intracelulares. Los buffers de lisis comunes incluyen RIPA
(Radioimmunoprecipitation assay) y NP-40.

-Proteasas e Inhibidores de Proteasas: Se utilizan proteasas para evitar la degradación

de proteínas durante el proceso de extracción. Los inhibidores de proteasas se agregan
para proteger las proteínas de la degradación.

-Detergentes No Iónicos: Los detergentes, como Tritón X-100 o Nonidet P-40, ayudan a
romper las membranas celulares y mantener las proteínas en solución.

-Agentes Reductores: Dithiothreitol (DTT) o β-mercaptoetanol se utilizan para evitar la

formación de enlaces disulfuro y mantener las proteínas en su estado reducido.

-Agentes Quelantes de Metales: EDTA o EGTA se utilizan para quelar metales que
pueden afectar la estabilidad de las proteínas.

-Buffers: Los buffers, como el buffer Tris-HCl o el buffer fosfato, se utilizan para mantener el
pH adecuado durante el proceso de lisis.

-Ultrasonido o Agitación Mecánica: Se utilizan equipos de ultrasonido o agitadores

mecánicos para romper las células y las membranas de manera efectiva durante el proceso
de lisis.

-Centrífugas: Las centrífugas se utilizan para separar los componentes celulares sólidos de
las proteínas en el sobrenadante.
 ● Reactivos de electroforesis: Incluyen geles de agarosa, tampones de carga y
tampones de para la electroforesis de ADN y proteínas.

Los reactivos de electroforesis son esenciales en la investigación de cultivos celulares,

incluyendo los cultivos de células MDCK, cuando se realizan análisis de ácidos nucleicos
(ADN y ARN) y proteínas. Estos reactivos permiten separar y analizar moléculas biológicas
en función de su tamaño y carga eléctrica. Los reactivos de electroforesis comunes que se
utilizan en los cultivos celulares MDCK incluyen:

Geles de Agarosa: Los geles de agarosa son utilizados para la separación de ácidos
nucleicos, como ADN y ARN. La concentración de agarosa se elige según el rango de
tamaños de las moléculas que se desean separar.

Tampones de Electroforesis: Los tampones de electroforesis proporcionan el medio

conductor para la migración de las moléculas a través del gel. Los tampones más comunes
para geles de agarosa incluyen el tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA) y el tampón TBE
(Tris-Borato-EDTA).

Tampones de Carga: Los tampones de carga se utilizan para mezclar con las muestras
antes de cargarlas en el gel de agarosa. Contienen colorantes y agentes que permiten el
seguimiento de las muestras durante la electroforesis.

Marcadores de Peso Molecular: Los marcadores de peso molecular son utilizados como
referencia para estimar el tamaño de las moléculas separadas. Estos marcadores consisten
en fragmentos de ADN de tamaños conocidos y se cargan en un carril del gel.

Geles de Poliacrilamida: En lugar de geles de agarosa, los geles de poliacrilamida se

utilizan para la separación de proteínas en electroforesis de proteínas. Los geles de
poliacrilamida son capaces de separar proteínas en función de su tamaño y se utilizan
comúnmente en Western blot y técnicas similares.

Tampones de Electroforesis de Proteínas: Para la electroforesis de proteínas, se utilizan

tampones específicos que proporcionan las condiciones adecuadas para separar proteínas
en función de su tamaño y carga.

● Reactivos de transfección celular: Estos reactivos se utilizan para introducir

ácidos nucleicos u otras moléculas en células para estudios de expresión
génica u otros experimentos.

-Reactivos de Transfección Química: Estos reactivos se utilizan en la transfección

mediante la formación de complejos con el material genético o las moléculas de interés
antes de su introducción en las células. Algunos ejemplos de reactivos de transfección
química incluyen liposomas, polímeros catiónicos y reactivos comerciales como
Lipofectamine y PolyJet.
-Reactivos de Electroporación: La electroporación es un método que utiliza pulsos
eléctricos para introducir material genético en las células. Los reactivos comunes en este
caso incluyen soluciones salinas o tampones especiales para mejorar la eficiencia de la
electroporación
.
-Virus de Transfección: En la transfección viral, se utilizan virus modificados para entregar
material genético o genes de interés a las células. Los virus de transfección se producen en
el laboratorio y se utilizan para infectar las células MDCK.

-Plásmidos o Fragmentos de ADN: En muchos casos, el material genético o los genes de

interés se encuentran en plásmidos o fragmentos de ADN que se preparan previamente
para su uso en la transfección.

● Suministros para microscopía:

-Microscopio: El microscopio es el equipo principal necesario para observar y analizar las

células MDCK. Puede ser un microscopio óptico o uno de fluorescencia, dependiendo de los
detalles de su investigación.

-Placas de Cultivo Celular: Las placas de cultivo celular se utilizan para mantener y
cultivar las células MDCK antes de la observación microscópica. Pueden ser placas de
cultivo de fondo de vidrio o de plástico, dependiendo de sus necesidades.

-Medios de cultivo: Los medios de cultivo son esenciales para mantener las células vivas
durante el crecimiento y para preparar las muestras para la microscopía. Asegúrese de usar
medios apropiados para células MDCK.

-Sistema de Montaje de Muestras: Para preparar las muestras en el microscopio,

necesitará un sistema de montaje que puede incluir cubreobjetos, láminas portaobjetos y
medios de montaje como el montaje con glicerol.

-Pipetas y Tips: Las pipetas son esenciales para manipular y transferir muestras, medios y
reactivos durante la preparación de las muestras.

-Soluciones de Tinción: Si necesita realizar tinciones para resaltar estructuras específicas

en las células MDCK, requerirá soluciones de tinción adecuadas, como azul de metileno,
hematoxilina, eosina, entre otras.

-Filtros de fluorescencia: Si está utilizando microscopía de fluorescencia, necesitará filtros

de excitación y emisión específicos para las etiquetas de fluorescencia que está utilizando.
Micro Pipetas y Jeringas: Estos instrumentos son útiles para aplicar con precisión reactivos
o soluciones sobre las muestras.

-Incubadora de Microscopio: Si planea mantener las células MDCK en condiciones

controladas durante la observación, una incubadora de microscopio es útil para mantener la
temperatura, la humedad y la concentración de CO2 adecuadas.
 ● Material estéril:

Pipetas y Tips Estériles: Las pipetas y las puntas de pipetas deben ser estériles para
manipular medios de cultivo, reactivos y muestras de células sin contaminar el cultivo.

Placas de Cultivo Estériles: Las placas de cultivo celulares deben ser estériles y libres de
endotoxinas. Puede utilizar placas de cultivo de fondo de vidrio o de plástico, dependiendo
de sus necesidades.

Láminas Portaobjetos y Cubreobjetos Estériles: Si va a realizar observaciones

microscópicas, es importante utilizar láminas portaobjetos y cubreobjetos estériles para
preparar muestras.

Medios de Cultivo Estériles: Los medios de cultivo deben ser estériles para proporcionar
un ambiente limpio para el crecimiento celular.

Agua Estéril: El agua utilizada en la preparación de medios de cultivo, soluciones y

reactivos debe ser estéril y libre de contaminantes.

Bolsas o Contenedores Estériles: Para la eliminación de desechos de cultivos celulares,

como puntas de pipetas usadas o medios de cultivo desechados.

Guantes Estériles: Los guantes estériles se utilizan para manipular las células y evitar la
contaminación cruzada.

Instrumentos Estériles: Si es necesario utilizar instrumentos como bisturís, tijeras o pinzas

en la manipulación de las células, estos deben estar esterilizados antes de su uso.

Desinfectantes Estériles: Los desinfectantes estériles se utilizan para limpiar áreas de

trabajo, superficies y equipos antes de realizar procedimientos celulares.

Microscopios y Objetivos Estériles: Si se realiza observación microscópica en

condiciones de cultivo celular, asegúrese de que el microscopio y los objetivos estén limpios
y estériles.

● Suministros para la eliminación de residuos

La eliminación de residuos de cultivos celulares MDCK y otros materiales biológicos

utilizados en el laboratorio debe realizarse de manera segura y siguiendo las regulaciones y
pautas de gestión de residuos biológicos.

Bolsas de Residuos Peligrosos Biológicos: Estas bolsas, también conocidas como

bolsas rojas o bolsas de residuos peligrosos, están diseñadas específicamente para la
eliminación de residuos biológicos. Los materiales biológicos, cultivos celulares descartados
y otros desechos peligrosos se deben desechar en estas bolsas.

Contenedores de Recogida de Agujas y Material Cortante: Si ha utilizado agujas,

bisturís u otros objetos cortantes en sus procedimientos, debe depositarlos en contenedores
de recogida de material cortante. Estos contenedores están diseñados para prevenir
lesiones y proporcionar una eliminación segura.

Autoclave o Incineración: En algunos casos, los residuos biológicos pueden ser

autoclavados o incinerados para su desinfección y eliminación segura. Esto suele ser
necesario para los materiales que han estado en contacto con agentes patógenos.

Deshidratadores de Residuos Líquidos: Si tiene residuos líquidos que no pueden

verterse por el desagüe, los deshidratadores de residuos líquidos pueden utilizarse para
convertir los líquidos en sólidos antes de su eliminación.

Reactivos Desinfectantes: Los reactivos desinfectantes, como el hipoclorito de sodio

(lejía), pueden utilizarse para desinfectar las superficies y el equipo que haya estado en
contacto con los residuos biológicos antes de su eliminación.

Documentación y Registro: Es importante llevar un registro de la eliminación de residuos

biológicos y cumplir con las regulaciones locales y estatales que rigen la gestión de residuos
biológicos. Esto puede incluir la documentación de la eliminación segura y el seguimiento de
los procedimientos de eliminación.

Procedimientos de Eliminación Segura: Asegúrese de seguir los procedimientos de

eliminación segura recomendados en su laboratorio y cumplir con todas las regulaciones
aplicables. Esto incluye etiquetar adecuadamente los contenedores, separar los residuos y
seguir pautas para la manipulación segura.

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