CROMATOGRAFIA Y

ELECTROFORESIS
Química Biológica – Flor Perez Isa
CROMATOGRAFIA: ‘’GRAFICO CON COLORES’’
• Es un método en el cual los componentes de una mezcla de solutos (ó analítos) son separados en una columna
adsorbente dentro de un sistema fluyente. Los compuestos a separar se distribuyen en dos fases:
• 1) Inmóvil → Fase estacionaria: Contenida en una columna de vidrio, soporte de acero inoxidable o aluminio.
Es donde se van a retener los componentes de la mezcla a separar. Compuesta por materiales porosos con
afinidad por los componentes (interactúan con la mezcla). DEBE SER INERTE, NO DEBE REACCIONAR
QUIMICAMENTE CON LOS ANALITOS.
• 2) Móvil → Es un fluido (solvente o mezcla de solventes) que contiene la mezcla de productos a separar y que
fluye a través de la fase estacionaria.
La separación se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos, que se establece al ser
arrastrados por la fase móvil a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria.
La separación entre dos sustancias empieza cuando una de ellas es retenida con más fuerza por la fase
estacionaria, mientras que la otra tiende a desplazarse mas rápidamente con la fase móvil
La retención de los analitos puede tener su origen
por fenómenos de adsorción, cuando la especie
química es retenida por puntos activos de la
superficie de un sólido, o bien de absorción, cuando
la especie química es retenida por toda la masa o
volumen del sólido y puede formar una mezcla con la
primera (absorción pura) o a reaccionar
químicamente con la misma (absorción con reacción
química)
ABSORCION Y ADSORCION
La retención tiene su origen en fenómenos de:
• Adsorción: Delimitado a la superficie que separa las fases. Proceso superficial
• Absorción: Retención de especie química por parte de una masa, fenómeno masico. Hay transferencia de
masa y volumen

• ‘’Sorción’’: Proceso físico o químico donde una sustancia queda agregada o unida a otra sustancia

ACUMULACION DE PARTICULAS
EN LA SUPERFICIE
TIPOS DE CROMATOFRAFIA
- Fase estacionaria sólida:
❖ Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que
inicialmente estaba en fase móvil líquida o gaseosa (operan
principalmente fuerzas de Van der Waals).

❖ Cromatografía de intercambio iónico: el sólido es un

intercambiador de iones (actúan fuerzas electrostáticas).
❖ Cromatografía de exclusión (o de geles): el sólido es un
gel formado por polímeros no iónicos porosos que
❖ Cromatografía de afinidad: es un tipo especial de
retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.
cromatografía de adsorción, utilizada
especialmente en bioquímica para la separación
de proteínas, en la que un sólido tiene enlazado
un ligando de afinidad que puede ser por
ejemplo, un anticuerpo o una lectina
(fitohemoaglutinina).
• Fase estacionaria líquida: En ese caso el líquido se encuentra soportado en un sólido
inerte, se trata de la cromatografía de partición. El soluto se reparte entre la fase móvil
(líquido o gas) y la fase estacionaria líquida

Según la naturaleza de la fase móvil, la técnica cromatográfica correspondiente recibe el

nombre de dicha fase móvil:
- Fase móvil líquida o cromatografía líquida, se puede distinguir:
❖Cromatografía líquido-líquido (CLL), en la que ambas fases son líquidas y, por tanto, se
trata de una cromatografía de partición.
❖Cromatografía líquido-sólido (CLS), en la que la fase estacionaria es sólida (adsorción,
intercambio iónico, exclusión, afinidad).

- Fase móvil gaseosa o cromatografía de gases, puede ser:

❖Cromatografía gas-liquido (CGL), que es una cromatografía de partición.
❖Cromatografía gas-sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.
RESUMEN
Fase estacionaria Fase móvil Técnica cromatográfica Proceso cromatográfico

Solida Liquida Capa fina (TLC) Adsorción

Columna Intercambio iónico
Exclusión molecular

Gas Columna Adsorción

Liquida Liquida Papel Partición

Capa fina
Columna

Columna Partición
Gas

Partición: Los analitos se van a

repartir entre la fase estacionaria y
las respectivas fases móviles.
TECNICAS: CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
• Cromatografía en columna: se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se
coloca la fase estacionaria y a través de ella se hace pasar la fase móvil. El
flujo de la fase móvil (líquido o gas) a través de la fase estacionaria se
consigue por: presión, capilaridad, gravedad.

PROCESO DINAMICO
TECNICAS: CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Fase móvil: Se va
agregando en esa
columna

Fase estacionaria

Tapones: Con lana de

vidrio o algodón que no
permite que la fase
estacionaria se diluya
FASES ESTACIONARIAS MAS COMUNES (CC)
Silicagel (SiO₂): Sustancia porosa y amorfa. Interacciona con el analito
mediante puente hidrogeno.
Alúmina, también conocido como florisil: Interacciona con el analito
mediante fuerzas electrostáticas
Sephadex: gel de dextrano, sus moléculas están unidas entre si con enlaces
cruzados.
Sepharose: Forma de reticulada de agarosa en forma de perlas, polímero de
polisacáridos extraído de algas marinas.
Selección de la fase estacionaria se realiza teniendo en cuenta:
• El analito que quiero separar
• La fase sea inerte o sea q no produzca cambios en el analito, que
solo interacciones intermoleculares o fuerzas electrostaticas
TECNICAS: CROMATOGRAFIA PLANA
• Cromatografía plana: en este caso la fase estacionaria está sobre una superficie plana
de un material sólido. Se divide en dos tipos generales:
❖Cromatografía en papel: en la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria,
habitualmente agua (cromatografía de partición).
❖Cromatografía en capa fina o delgada (TLC): en la que un sólido (adsorbente) actúa
como fase estacionaria (cromatografía de adsorción), que se extiende en una capa
delgada de silica gel o celulosa sobre una placa, generalmente de vidrio o aluminio.
Además, en estos casos el flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos formas:
✔ Por capilaridad (cromatografía horizontal y ascendente).
✔ Por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente).

PROCESO ESTATICO
IMPORTANTE:
DISTANCIA RECORRIDA POR EL COMPUESTO
• Factor de retención (Rf)=
DISTANCIA RECORRIDA POR EL DISOLVENTE

Frente de
Solventes mas utilizados:
corrida
• Hexano
• CCl₄
• Cloroformo
• Cloruro de metileno
• Acetato de etilo
• Dioxano
Origen • Acetonitrilo
(lugar de • Isopropanol
siembra) • Metanol
• Agua
 PLANA COLUMNA
Tipo de sistema Abierto Cerrado
Separación Distancia Tiempo o volumen
Tiempo Hasta que el frente de Cada soluto debe
solvente llegue a un atravesar toda la
punto del lecho columna. El tiempo de
cromatográfico separación aumenta, por
lo que tarda la elución del
compuesto.
Separación de muestras Simultáneamente Secuencialmente (cada
muestra indivualmente)
Detección Proceso estático Proceso dinámico

Cromatografía plana: Objetivos analíticos

Cromatografía en columna: Objetivos de aislamiento, separación y purificación
CONDICIONES ISOCRATICAS
• Estos términos aplican estrictamente a la fase móvil empleada como
eluyente.
• Cuando se trata de un proceso isocrático, las condiciones cromatográficas
permanecen constantes durante toda la separación, es decir se emplea
siempre el mismo solvente o mezcla de solventes en una proporción
definida.
CONDICIONES EN GRANDIENTE
• Las características de la elución se van modificando durante la separación, de esta
manera se consigue una mejor separación de mezclas complejas. La composición de la
fase móvil es variable, es decir que la mezcla que conforma el eluyente va cambiando en
cuanto a la proporción de los componentes de la mezcla
APLICACIONES
• Se pueden emplear para la separación, aislamiento, purificación e
identificación de diversos compuestos (orgánicos, inorgánicos o
biomoléculas) de diversos tamaños o pesos moleculares. Por ejemplo
para la separación de proteínas.
• Utilizamos:
1. Cromatografia de intercambio ionico
2. Cromatografia por exclusión o en gel
3. Cromatografia de afinidad y de inmunoafinidad
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

De acuerdo al buffer que utilice puedo producir

que las proteínas a separar se carguen positiva o
negativamente y de esa manera permitir que
eluyan toda la mezcla de proteínas a separar.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

Las moléculas pequeñas penetran en los poros de las

esferas de gel, donde la velocidad de flujo de solvente es
menor.
Las moléculas grandes no pueden penetrar los poros del
gel se mueven entre las esferas, donde la velocidad de
flujo de solvente es superior
Como consecuencia las moléculas de mayor peso
molecular eluyen antes que las de menor peso molecular

Se utiliza para determinar el peso molecular de

proteínas desconocidas
Sephadex o Sepharosa
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Y DE INMUNOAFINIDAD
Las esferas del gel están recubiertas de un ligando por el que tiene
afinidad algunas de las proteínas a aislar.

Al pasar la mezcla compleja a través de la columna la proteína es

retenida en la superficie de la esfera, separándose de las demás. La
separación esta dada por el ligando que tengo en la fase
estacionaria y que puede ser por ej un anticuerpo.

Para eluir la proteína retenida por afinidad se suele aumentar la

fuerza iónica de la solución de solvente o incluir en la fase móvil, el
ligando soluble a alta concentración de forma que compita con el
que esta unido a las esferas de gel por la unión a la proteína
ELECTROFORESIS
• La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de
estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente la separa por
tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.
• El sentido en que se mueven las moléculas depende de la pH de la solución. La molécula
cargada en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de:
carga eléctrica, tamaño, intensidad del campo eléctrico , temperatura del medio
• Es una técnica muy útil como método analítico. Nos permite conocer:
❖El numero de proteínas en una mezcla
❖La pureza de una preparación proteica
❖La masa de la proteína de interés
CONDICIONES DESNATURALIZANTES
• Para la preparación de la muestra de proteína se realiza una reacción
fisicoquímica, en la que se rompen enlaces peptídicos y puentes disulfuro, por
acción de detergentes iónicos (SDS), reactivos reductores (betamercaptoetanol) y
temperaturas elevadas (95°C) (desnaturalizar la proteína hasta su estructura
primaria)
PREPARACION DEL GEL
ARMADO DE LA CUBA
SIEMBRA DE LA MUESTRA
REVELADO DEL GEL
DETERMINACION DEL PM
Migracion de la proteina
• Rf=Movilidad relativa=
Migracion del colorante del frente