EXAMEN BBM:
1. Ssu72 es una fosfatasa. TF11H es una kinasa en S5 de CTD de la RNA-
Pol II (GST-CTD fosforilasa de CTD)
a) Cuál es el objetivo general del ensallo?
Medir la actividad fosfatasa a diferentes concentraciones de
productos químicos y observar como afectan en la elongación.
b) Expliaca como se ha realizado este ensayo contestanto las
siguientes cuestiones:
Ssu72 cataliza la defosforilacion de GST – CTDo. El sustrato GST –
CTDo es fosforilado en S5 por TFIIH. Las cantidades indicadas de
GST – Ssu72 inactivan GT-Ssu72 – C155, o GST es añadido solo en
esta reacción.
Los productos fueron detectados por Wester blot usando el
cariotipo (H14), que si hay desfosforilacion no se une, no hay
banda. En cada carril aparecen 3 bandas, porque GST – CTDo
viene de la fosforilacion de la kinasa. Esta le añade los grupos
fosfato, lo que lo hace que haya diferencias de tamaño.
Los carriles 1,8,9 son controles. Se deduce que GST (se añade
porque las proteínas recombinantes llevan la fosfatasa unida a
este) no afecta a la defosforilación. En los carrieles 2, 3, y 4 se
añaden cantidades crecientes de Ssu72. A mayor cantidad de
este producto, se observa la desaparición de la banda. Esta es la
fosfatasa y provoca la defosforilacion de GST- CTDo.
En los carrieles 5, 6 y 7 debido a la mutación (GST – Ssu72 – c155)
se pierde la capacidad de defosforilar ya que las bandad son
iguales a las del primer carril. Una mutacion puntual de este tipo
alterna la estructura y actividad de una proteína.
I)Que lleva cada una de las muestras?
Tubo 1: Ssu-72 sin tratamiento
Tubo 2: GST-Ssu72: fosfatasa, [ ]= 0,2
Tubo 3: GST-Ssu72: fosfatasa, [ ]= 2
Tubo 4: GST-Ssu72: fosfatasa, [ ]= 4
Tubo 5: Ssu72 [ ]= 0,2
Tubo 6: Ssu72 [ ]= 2
Tubo 7: Ssu72 [ ]= 4
Tubo 8: GST: control [ ]=0,2
Tubo 9: GST: control [ ]= 4
II) Que técnica se ha aplicado para detectar los productos de la
reacción? WESTERN BLUT (in vitro)
III) A que corresponden las bandas 3 que aparecen en la figura??
Al control GST
IV) Que significado tienen las muestras 1, 8 y 9 de la figura?
Ssu-72 sin tratamiento
GST control 0,2
GST control 4
V) Quales es la diferencia entre las fosfatasas GST-Ssu 72 y GST-
Ssu72-C15S? GST-Ssu72 salvaje
GST-Ssu72-C15S mutante. Se ha cambiado una serina por una
cisteina.
VI) Que resultado de observa en la figura consecuencia de esa
diferencia entre las fosfatasas? Que en las muestras 2,3,4 de 0,2
microgramos de [ ]. van desapareciendo las bandas, ya que al
no eliminarse los fosfatos, los plot no se unan al anticuerpo,
mientras que en 5,6 y 7 si se unen a los anticuerpos, por que hay
actividad fosfatasa.
VII) De que modo puede afectar una mutacion puntual en un
mRNA al polipeptido resultante – dicho mensajero?
Dependiendo de la mutacion en este caso modifica el centro
activo del polipeptido.
TEST:
2. El mecanismo de transduccion de receptores con actividad quinasa
nos permite...
a. La activacion directa del sitio catalitico lo que conduce a la
fosforilacion de las proteinas.
3. Es falso que la ruta de señalizacion Jack-Stat
a. Esta inicializadapor receptores con actividad tirosina quinasa
intrínseca
4. Es cierto que los receptores serin-treonin-quinasa:
a. Tienen como ligando el factor de crecimiento y transformacion
activinas y proteinas morfogenicas del nucleo?.
5. Los efectos principales de la señalización por receptores
guanilatociclasa pueden ser:
a. Vasodilatación
6. El ligando principal de lasguanilatociclasas citosólicas es:
a. cGMP
7. El sidenaff o viagra es:
a. Una fosfodiesterasa
8. La terminación de la señal mediada por incremento de calcio
citosólico se debe a:
a. Bombeo de calcio mediante bombas Ca/ATPasas del exterior
y hacia los reservorios.
9. Indica la diferencia entre hablar de promotor basal y promotor
general
Se entiende como promotor cualquier región del DNA capaz de
marcar el inicio de la transcripción a RNA; por otro lado, el promotor
basal, mínimo o core, es la región de DNA que contiene la caja TATA
(-30 nt) y el elemento iniciador INR (+1 nt).
10. Indica dos tipos de dominios de unión a DNA dando al menos dos
características estructurales.
•Hélice-giro-hélice (HLH o HLT): un bucle no helicoidal de 4
aminoácidos (giro β) de la cadena polipeptídica separa dos regiones
de hélice α. La región N-terminal contiene residuos básicos que
interaccionan con el DNA y está separada de la región C-terminal por
una zona intermedia en bucle. La región C-terminal tiene aminoácidos
hidrofóbicos espaciados a intervalos regulares, característicos de una
hélice anfipática.
•Dedo de zinc (zinc-finger): requiere un ión metálico de zinc para
cohesionar las dos regiones de la proteína y aunque fue descubierto
inicialmente en dominios de fijación al DNA, se sabe que también
aparece en proteínas que no se unen al DNA. Existen varios tipos de
dedos de zinc que unen el átomo de zinc de formas particulares; por
ejemplo, los dedos de zinc del tipo C2H2 fijan el átomo de zinc a través
de las dos cadenas laterales de cisteína y las dos cadenas laterales de
histidina, provocando el pliegue de la cadena polipeptídica para
formar un dominio compacto que puede insertar su hélice α en el surco
mayor del DNA. Los dedos de zinc son uno de los motivos de fijación al
DNA más comunes entre los factores de transcripción eucariontes.
•Homeodominio: secuencia muy conservada de 60 aminoácidos que
se encuentra en todas las proteínas codificadas por genes homeóticos,
que codifican proteínas que regulan la expresión génica.
•Hélices aladas: también se conoce como motivo en lengüeta de
flecha y, al igual que las proteínas con dedos de zinc C2H2, las proteínas
con hélices aladas suelen unirse al DNA como monómeros.
•Ring-finger: tiene una estructura cíclica.
•Cremallera de leucinas (b-Zip): en los primeros factores de
transcripción de este tipo que se descubrieron, había un residuo del
aminoácido hidrófobo leucina cada siete aminoácidos de la cadena
polipeptídica, en la región C-terminal de sus dominios de fijación al DNA.
Más tarde se identificaron proteínas adicionales con otros aminoácidos
hidrófobos en estas posiciones; por este motivo, hoy en día se suele
utilizar la denominación de cremallera básica (b-Zip) para referirse a las
proteínas con este tipo de estructura (dos hélices α extendidas que
agarran la molécula de DNA en dos surcos mayores adyacentes; las
porciones de las hélices que contactan con el DNA son los lugares en los
que se encuentran los aminoácidos básicos espaciados de forma
regular, es decir, son hélices anfipáticas). Muchos factores de
transcripción con cremallera básica son heterodímeros de dos cadenas
polipeptídicas diferentes, cada una con un dominio de cremallera
básica. Una proteína típica que contiene cremalleras de leucina es
Gnc4 de levadura, que forma dímeros mediante interacciones
hidrófobas entre las regiones C-terminales de las hélices α y origina una
estructura superenrollada.
TEST:
11. Cuál de las siguientes afirmaciones es correcta respecto a la
regulación granscripcional de los genes GAL:
a. Gal80 es un represor de los genes GAL
12. Durante el proceso de elongación transcripcional:
a. Se añaden sucesivos ribonucleótidos a velocidad constante
13. Durante el proceso de inicio transcripcional:
a. TBP es un factor de inicio común a las tres polimerasas
eucariotas. (gloria)
14. El “código de histonas” se refiere a:
a. Variaciones en las modificaciones de histonas dependiendo
del estado de la cromatina (activo/inactivo).
15. Cita las reacciones que tienen lugar en el procesamiento 3’ y 5’ de
los pre-mRNAs. Nombra dos componentes de la maquinaria de
procesamiento 3’.
El proceso 3’ es el corte y poliadenilación del RNA, y en el proceso 5’ la
adición de la caperuza 5’ o CAP, mediante la formación de un enlace
trifosfato a una guanina.
Los componentes de la maquinaria 3’ son los elementos CIS (secuencias
de corte y poliadenilación AAUAAA de 10-30 nt upstream del punto de
corte seguido de una región rica en U ó UG de 30 nt); los elementos
TRANS son CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specific Factor), CstF
(Cleavage Stimulation Specific Factor), CFI y CFII (Cleavage Factors),
PAP (PolyAPolimerase) y PABP (PolyA Binding Protein).
16. Explica en máximo 4 líneas cómo se consigue relajar la estructura de
los nucleosomas para el paso de la RNA polimerasa.
Se basa en acetilación, metilación y fosforilación de las histonas H3 y H4,
previas modificaciones (ubiquitinización y ADP ribosilación) de las
histonas H2A y H2B para poder acceder a las primeras. Al acetilar un
residuo de lisina (por ejemplo), disminuye el carácter básico de la
histona y su afinidad por el ADN, relajando la estructura de la cromatina.
17. ¿Qué proceso se conoce como edición de RNA? Cita una enzima
implicada.
El splicing alternativo y la poliadenilación alternativa son mecanismos
para la generación de variantes de los transcritos de RNA. La edición
del RNA contribuye a esta variación y consiste en la modificación de la
secuencia del RNA mediante desaminaciones específicas de sitio
(modificaciones nucleotídicas) y inserciones-deleciones de uracilo
dirigidas por gRNA, de forma que la secuencia del mRNA maduro difiere
de los exones que lo codifican en el DNA genómico. Es un proceso muy
difundido en las mitocondrias de protozoos y vegetales, y en los
cloroplastos; en los eucariotas superiores es menos frecuente y no tan
espectacular.
18. Cita dos razones por las que es necesaria la presencia del extremo
5’Cap en los mRNAs.
Proteger a la molécula de la acción de exonucleasas inespecíficas
Marcar el hnRNA como sustrato de otras reacciones de procesamiento
en el núcleo. Ayudar a los ribosomas a reconocer el mRNA para inidicar
la traducción
Ayudar al desalojo del promotor en el comienzo de la elongación, es
decir, a la eliminación de los factores de iniciación que no se necesitan
en la elongación. MARCA el paso de iniciación a elongación.
Ayuda a procesar el primer intrón del transcrito.
19. Relaciona cada molécula con su número correspondiente:
Adenilatociclasa , Ca2+ , CaM, AMP Fosfodiesterasa, Na+, Odorante ,
CNG (canal por nucleótido cíclico) , GPCR , G(alfa)-off…
20. Cita tres pasos de la fase de elongación en la síntesis de proteínas.
DESCODIFICACIÓN: Reconocimiento del codón que se encuentra en el
sitio A.
TRANSPEPTIDACIÓN: Transferencia del péptido en síntesis del sitio P al A.
TRANSLOCACIÓN: Desplazamiento del ribosoma a lo largo del mRNA
por una distancia equivalente a la de un codón.
21. Cuál es el método general de regulación de la traducción?
La complementariedad entre la secuencia de shine-Dalgarno y el
ARNribosomico. Y en eucariots la unión o la complementariedad de la
cola poliA y el extremo 5´ al ribosoma..
22. Explique brevemente el papel de las chaperoninas en la síntesis de
las proteínas.
Las chaperoninas son un grupo de proteínas que pertenecen a las
chaperonas, proteínas muy conservadas. Son las Hsp60, y son necesarias
para las proteínas que se importan a la matriz mitocondrial en su forma
desplegada. Las más conocidas son GroEL y GroES. GroEL es un
complejo con forma de barril formado por 14 subunidades idénticas, y
GorES es la que va a cubrir sus extremos, ayudándola en su función. En
ausencia de ATP GroEL está en conformación cerrada, guardando las
proteínas desplegadas, y la unión del ATP provoca un cambio
conformacional en GroEl que la abre y permite la liberación de la
proteína correctamente plegada.
TEST:
23. Ejemplos de señalización paracrina pueden ser los establecidos
entre:
a. Un ________(Correcta) (Si ponía NO y CO)
b. a. El ligando Fas y _______ESTA NO ES
c. La insulina y un receptor especifico. NO
24. Una función fundamental de las proteínas de membrana es:
a. Ambas funciones pueden ser realizadas por proteínas de
membrana.
25. Las uniones gap son dinámicas y por ello:
a. Se cierran cuando se produce una bajada de pH y un
incremento de Ca+.
26. La principal molécula de adhesión y de interacción célula-matriz
puede ser:
a. Integrina
b. …proteoglucanos transmembrana
27. Los transportadores de la familia ABC:
a. Son _______impulsados por ATP.
28. Los ionóforos:
a. Pueden formar poros a través de las membranas.
29. En las cascadas de fosforilación, la adición de un grupo fosfato a una
proteína puede modificar:
o Su actividad y/o función
o Su sublocalización celular.
o Su capacidad de interaccionar y/o ser regulada por otras
proteínas
o Todas ellas son ciertas.
30. Teniendo en cuenta la actividad del P13-K:
PTEN sería un regulador negativo de su ruta de señalización que
conduce a la proliferación celular.
31. Es cierto que:
Las ciclinas específicas de la transición G1/S son las ciclinas E y D
32. El apoptosoma:
Se activa por unión al citocromo c
33. Explicar muy brevemente por qué cuando se bloquea la bomba de
Na+/K+- ATPasa se acumula calcio en el citosol de las células
cardíacas si podría salir a través del intercambiador Na+/Ca2+.
Al bloquear la bomba de Na+/K+ se no entraría el Na+ al interior celular,
produciéndose la acumulación de Ca2+ y Na+, ya que este bloqueo
provoca una disminución en la eficacia del intercambiador Na+/Ca2+.
34. Los lipid-drafts o balsas lipídicas:
Son regiones especializadas de la membrana que se encuentran
enriquecidas con colesterol, glicolípidos, esfingolípidos y fosfolípidos
saturados, lo que permite distinguirlas al microscopio por su textura
característica. Es común que contengan proteínas con anclaje GPI y
proteínas aciladas (como las quinasas de la familia Src). Son estructuras
dinámicas que se mueven a través de la membrana y que varían en
tamaño y composición (por ejemplo, algunas proteínas migran a las
balsas lipídicas cuando son oligomerizadas por la unión del ligando, de
manera que estas balsas suelen actuar como sitios de clusterización).
35. Se muestra una auto-radiografía de un experimento de transcripción
in vitro. En el apartado A se muestra un esquema del ADN molde
utilizado:
A). Porqué consideramos que este
experimento de transcripción in vitro está
diseñado para el estudio de la elongación
transcripcional.
Se incuba en molde de DNA con estractos
de cepa salvajes (control) y de cepa
mutante dutante varios periodos de tiempo
distintos para que se produzcan la
elongación y luego se someten los
productos a una digestión con
nucleasa( ribonucleasa T1). Se necesitan
que el molde de DNA sea lineal (aportando
A) ya que tenemos que controlar donde
acaba el experimento. Se linealiza
mediante una digestión
b) Podríamos establecer las mismas conclusiones si el molde para la
trasncripción acabase a los 130 nucleótidos.
No, ya que no observamos la migración completa ya que el
mutante 2 acaba en los 377 nucleotidos.
C) Tras la digesión con la ribonucleasa T1 (degrada RNA en posiciones
con G) y electroforoesis, ¿En qué banda de la autoradiografía B nos
tenemos que fijar para sacar conclusiones de elongación?
En la más superior, la última en migrar
D) En el resultado “figurado” del apartado C, qué conclusión podrías
extraer de las mutaciones 1 y 2 respecto a la cepa salvaje (wt) en el
proceso de elongación y por qué.
En la mutante 2, el resultado de la electroforesis nos indica que
disminuye el producto obtenido dando una señal más tenue y que
tendrá más tiempo en ser apreciable (la banda de mayor tamaño
aparece mas tarde porque el RNA pol no es capaz de alongar el
transito correctamente). Esto indica que el mutante 2 afecta a un factor
implicado en la elongación generando problemas en la misma. En
cuanto el mutante 1, no se observa ninguna banda, lo que indica que
el RNA pol no es capaz de elongar el tránscrito, por tanto puede que
sea un inhibidos de la elongación
CUESTIONES GRUPOS REDUCIDOS.
36. Defina e indique alguna de las funciones del miRNA.
Los RNAm de animales reprimen la expresión genética bloqueando
la traducción de los RNAm => evitando la síntesis de proteínas.
37. ¿Qué ocurre con cada una de las hebras del miRNA dúplex?
Una de las hebras permanece en el miRISC, y la otra se dirige hacia el
mRNA que se busca silenciar, se acompla a este, y se reprime la
transcripción.
38. Qué tipos de mecanismos de acción presentan los miRNA?
Bloquean la traducción del mRNA en animales, lo que hace que este no
sea degradado. Las células lo usan de aviso de ET y virus.
