SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN

SUPERIOR TECNOLÓGICA
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ

IQUISSA ASESORES QUÍMICOS

“VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE PRUEBA (CCAYAC-M-

004/11) PARA LA ESTIMACIÓN MICROBIANA POR LA
TÉCNICA DEL NUMERO MÁS PROBABLE (NMP),
DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES
FECALES Y Escherichia coli EN PRODUCTOS LÁCTEOS”

RESIDENTE: BALCÁZAR SIMUTA MÓNICA CRISTELL

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Dra. Patricia Sanchez Iturbe Ing. Humberto Torres Jiménez

ASESOR INTERNO ASESOR EXTERNO

TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS, ENERO 2017

1
ÌNDICE

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 5
2. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 8
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 10
3.1 Objetivo general .............................................................................................................. 10
3.2 Objetivos específicos ..................................................................................................... 10
4. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA EN QUE PARTICIPÓ ................................... 11
3.3 Localización ..................................................................................................................... 11
4.2 Misión ................................................................................................................................... 12
4.3 Visión .................................................................................................................................... 13
4.4 Áreas de IQUISSA .............................................................................................................. 13
5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA A RESOLVER ....................................... 14
6. ALCANCE Y LIMITACIONES .............................................................................. 17
7. FUNDAMENTO TEÓRICO ................................................................................... 18
7.1 ¿Qué es validación? ............................................................................................................ 18
7.2 Diferencia entre una validación y una verificación ......................................................... 19
7.3 Necesidad de una validación ............................................................................................. 20
7.4 ¿Cuándo realizar una validación? ..................................................................................... 21
7.5 ¿Cómo realizar la validación?............................................................................................ 22
Clasificación de los métodos analíticos ............................................................................ 22
a) Métodos estándar o normalizados .................................................................................. 22
b) Métodos desarrollados por el laboratorio ....................................................................... 23
c) Métodos no normalizados ................................................................................................. 23
Clasificación de métodos (según su categoría)............................................................... 24
7.6 Decisión del grado de validación requerido............................................................... 27
7.7 Parámetros de desempeño del método de validación ............................................ 27
La selectividad o especificidad ........................................................................................ 28
Límite de detección.............................................................................................................. 28
Intervalo de trabajo e intervalo lineal .............................................................................. 29
Exactitud ................................................................................................................................. 30
Componentes de la incertidumbre .................................................................................. 33
Sensibilidad ........................................................................................................................... 33

2
 Robustez ................................................................................................................................. 34
Recuperación ........................................................................................................................ 34
Exactitud relativa o recuperación .................................................................................... 34
Reproducibilidad .................................................................................................................. 35
Repetibilidad .......................................................................................................................... 35
7.7 MICROORGANISMOS DE INTERÉS .............................................................................. 36
8. PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS 38
8.1. Matriz, equipos, materiales, reactivos, medios de cultivo y cepa ....................................... 38
8.1.1 Selección de la matriz .............................................................................................. 38
Generalidades del queso panela .................................................................................. 39
Definición de queso ......................................................................................................... 39
8.1.2 Equipo ........................................................................................................................... 41
8.1.3 Materiales ..................................................................................................................... 42
8.1.4 Reactivos ...................................................................................................................... 43
8.1.5 Medios de cultivo ....................................................................................................... 44
8.2 Determinación de la fase estacionaria ......................................................................... 46
PLAN DE ACTVIDADES 1 .................................................................................................... 48
8.3.1 Prueba presuntiva ...................................................................................................... 51
8.3.2 Prueba confirmativa .................................................................................................. 52
8.5 Determinación del volumen de inóculo para la fortificación de la matriz .......... 56
8.6. Parámetros de desempeño ............................................................................................ 57
8.6.1. Repetibilidad............................................................................................................... 57
8.6.2 Reproducibilidad ........................................................................................................ 58
8.6.3 incertidumbre .............................................................................................................. 58
8.7 Análisis estadístico ........................................................................................................... 58
8.8 Criterios de aceptación (métodos cualitativos) ......................................................... 60
9. RESULTADOS ...................................................................................................... 61
a) Resultados de repetibilidad ........................................................................................... 68
b) Resultados de reproducibilidad ................................................................................... 70
c) Incertidumbre .................................................................................................................... 70
d) Incertidumbre combinada .............................................................................................. 71
10. CONCLUSIONES ............................................................................................... 72
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 73
3
ANEXOS .................................................................................................................... 74

4
 1. INTRODUCCIÓN

En la actualidad se llevan a cabo millones de pruebas, mediciones y exámenes en

miles de laboratorios de todo el mundo, prácticamente todos los aspectos de la
sociedad se apoyan, de alguna manera, en el trabajo analítico. Por ello es de
suma importancia la validación de los mismos. La validación de un método se ha
convertido en un requisito de las políticas de calidad, porque brindan mayor
seguridad y confianza en los resultados analíticos.

Si el resultado de un análisis no genera confianza, entonces tiene poco valor y el

análisis puede mejor no llevarse a cabo. Cuando los clientes solicitan trabajos
analíticos a un laboratorio, éstos esperan confiar en los resultados, así, el
laboratorio y su personal tienen la responsabilidad de brindar confianza al cliente,
proporcionando una respuesta correcta a la parte analítica del problema, en otras
palabras, demostrar la ‘adecuación al uso’.

Implícitamente los ensayos llevados a cabo son apropiados para responder a la

parte analítica del problema que se desea resolver, y el informe final presenta los
datos analíticos de tal manera que se pueda comprender fácilmente y sacar las
conclusiones pertinentes.

La validación del método permite demostrar que un método es 'adecuado para el

uso previsto’. Para un resultado analítico, ser apto para su uso implica que éste
debe ser lo suficientemente fiable para que cualquier decisión basada en él, pueda
ser tomada con confianza. Debe validarse el desempeño de un método y estimar
la incertidumbre del resultado, para un determinado nivel de confianza.

La validación de un método es la necesidad analítica de confirmar que el método

en cuestión tiene capacidades de desempeño consistentes con las que requiere la
aplicación. Un método debe validarse cuando sea necesario verificar que sus
parámetros de desempeño son los adecuados para el uso de un problema
analítico (Holcombe, H. 1998)

5
Hoy en día las enfermedades transmitidas por los alimentos suponen una
importante carga para la salud. Millones de personas enferman y muchas mueren
por consumir alimentos insalubres. Es por ello que la seguridad alimentaria se ha
convertido en una de las principales preocupaciones entre la sociedad.

Las enfermedades transmitidas por los alimentos son generalmente de carácter

infeccioso o tóxico y son causadas por bacterias, virus, parásitos o sustancias
químicas que penetran en el organismo a través del agua o los alimentos
contaminados.

La calidad microbiológica de los alimentos es fundamental porque influye en su

conservación y vida de anaquel y, sobre todo, porque los microorganismos
presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por
alimentos ó ETA’s

Las normas en materia de alimentos, generalmente establecen la calidad

microbiológica en términos de microorganismos indicadores. Éstos son
organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o
contaminación que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos
patógenos en alimentos. Además de que su detección en el laboratorio es más
sencilla, rápida y/o económica, los microorganismos indicadores permiten un
enfoque de prevención de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o
contaminación.

El presente documento muestra el trabajo realizado para la validación del

“MÉTODO DE PRUEBA (CCAYAC-M-004/11) PARA LA ESTIMACIÓN DE LA
DENSIDAD MICROBIANA POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
(NMP), DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y
Escherichia coli”. (Especialmente en queso panela), documento expedido por la
Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC) que forma
parte de la Comisión Federal Para la Protección Contra Riesgos Sanitarios
(COFEPRIS).

Dicha comisión es una organización certificada por el Instituto Mexicano de

Normalización y Certificación A. C. (IMNC) bajo la norma NMX-CC-9001-IMNC-
6
2008 “Sistemas de gestión de la calidad-requisitos” y acreditada ante la Entidad
Mexicana de Acreditación (EMA) bajo la norma NMX-EC-17025-IMNC-2006
“Requisitos generales para los laboratorios de ensayo y calibración”.

El método analítico a validar mediante este trabajo utiliza a la bacteria E. coli como
indicador de contaminación fecal reciente o condiciones higiénicas inadecuadas
en la elaboración o procesamiento de los alimentos a través del método del
número más probable que consiste en una prueba presuntiva y confirmativa. Se
basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los
tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución mayor
sean negativos. El resultado positivo se demuestra por la presencia de gas,
crecimiento microbiano (turbidez) y florescencia dentro de las 48 horas de
incubación a 35 ± 0.5ºC.

7
 2. JUSTIFICACIÓN

IQUISSA Asesores Químicos es una empresa que se dedica a realizar análisis

fisicoquímicos y microbiológicos de agua y alimentos, uno de sus principales
objetivos, es generar confianza en sus clientes a través de los resultados emitidos
en sus pruebas, es por ello que busca el aseguramiento de la calidad en sus
análisis a través de la validación de sus métodos.

La validación de métodos analíticos es un requisito importante en la práctica de los

análisis químicos y microbiológicos, porque utiliza un procedimiento que permite
demostrar si al aplicar un método analítico, bajo las condiciones de operación de
un laboratorio, se obtienen resultados confiables. Siendo así, una herramienta de
control de calidad de gran relevancia y que se está adaptando en diferentes
campos de trabajo en donde se necesite respaldar mediante la documentación y
determinación de parámetros estadísticos que el método que se utiliza es el
correcto para cumplir con los objetivos propuestos del mismo, garantizando la
calidad del proceso y asegurando productos o servicios confiables obteniendo
resultados técnicamente válidos.

“Un laboratorio debe validar sus métodos normalizados, los métodos que se
aplican en las determinaciones basadas en normas estandarizadas para confirmar
que los resultados que se obtienen conforme a norma son aptos y con resultados
confiables” (ISO/IEC-17025:2005).

La presencia de contaminaciones alimenticias y las enfermedades transmitidas por

los alimentos que se presentan en países desarrollados y subdesarrollados, se
han convertido en una problemática actual, derivándose problemas de salud
debido a brotes de toxiinfecciones alimentarias y enfermedades gastrointestinales,
por ello es de suma importancia realizar la validación del método de análisis
microbiológico para la estimación de la densidad microbiana por la técnica del
número más probable (NMP), para la detección de microorganismos coliformes y

8
de la bacteria E. coli, ya que son organismos indicadores de riesgo sanitario al
consumir un alimento.

Para comprobar que los resultados de un método de análisis microbiológicos son

técnicamente válidos, se debe realizar la validación del método. Este
planteamiento constituye la justificación de este trabajo.

9
3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

 Validar el MÉTODO DE PRUEBA (CCAYAC-M-004/11) PARA LA

ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA TÉCNICA DEL
NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP), DETECCIÓN DE COLIFORMES
TOTALES, COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli, usando queso
panela como matriz, en las instalaciones de IQUISSA Asesores Químicos,
con la finalidad de demostrar que se obtienen resultados confiables al hacer
los análisis correspondientes en productos lácteos, aplicando dicha norma
como requisito para que IQUISSA Asesores Químicos sea reconocida como
laboratorio tercer autorizado en dichas pruebas por la SSA.

3.2 Objetivos específicos

 Analizar el proceso de validación propuesto por COFEPRIS mediante el

documento expedido por CCAYAC
 Demostrar que se obtienen resultados confiables al utilizar el método de
prueba (CCAYAC-M004/11) en productos lácteos, aplicando el proceso de
validación.

10
4. CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA EN QUE PARTICIPÓ

El laboratorio de pruebas IQUISSA “Asesores Químicos” fue creada el 6 de enero

de 1980 como laboratorio auxiliar a la industria alimentaria para efectuar análisis
fisicoquímicos y microbiológicos a alimentos y bebidas, turnando solicitud de
licencia sanitaria correspondiente y de reconocimiento del laboratorio a la
Secretaria de Salubridad y Asistencia (actual Secretaria de Salud) a través de los
servicios coordinados de salud pública en el estado.

Con la finalidad de cumplir siempre con la normatividad, para el análisis de agua y

alimentos con base a las normas oficiales mexicanas vigentes (NOM y NMX), se
ha establecido un sistema de gestión acorde a sus actividades siguiendo los
lineamientos de la norma NMX-EC-17025-2006.

3.3 Localización
Este laboratorio se encuentra ubicado actualmente en la ciudad de Tuxtla
Gutiérrez, Chiapas, en la avenida 12ª sur entre 7ª y 8ª poniente número 826-Altos
A.

Coordenadas:

Norte 16º45´11´´
Oeste 93º06´56´´
Altitud 522 msnm

11
4.2 Misión

Proporcionar servicios de análisis físicos, químicos y microbiológicos de agua y

alimentos a empresas, dependencias reguladoras y público en general para crear
y mejorar productos y procesos, así como generar confianza en nuestros clientes,
cumpliendo con las expectativas normativas y logrando resultados técnicamente
válidos con base en un sistema de gestión.

12
4.3 Visión

Ser un laboratorio de pruebas físicas, químicas y microbiológicas de agua y

alimentos, líder en el sureste del país y que además ofrezca un servicio integral
para el desarrollo industrial alimentario.

4.4 Áreas de IQUISSA

IQUISSA cuenta con:

1. Área de muestra

2. Área de recepción

3. Área administrativa

4. Área de almacenamiento

5. Área de cursos y asesorías

13
5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA A RESOLVER

Actualmente, la carga que las enfermedades de transmisión alimentaria (ETA)

imponen a la salud pública, se ha subestimado a menudo debido a la mala
información y la dificultad para establecer una relación de causalidad entre las
contaminaciones de alimentos y las enfermedades o muertes provocadas por
ellas.

Las enfermedades gastrointestinales son una de las primeras causas de consulta

médica y también una de las primeras causas de muerte en México y en el mundo.
Por ello, se las considera un problema de salud pública a nivel mundial, que afecta
a personas de cualquier edad y condición social, aunque los grupos más
vulnerables son los niños y los ancianos.

Las enfermedades gastrointestinales infecciosas son causadas en su mayoría por

bacterias (principalmente Escherichia coli, Salmonella y Shigella), al consumir
alimentos y agua contaminados con materia fecal.

Entre las enfermedades del tracto gastrointestinal más frecuentes se encuentran

las diarreas. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que cada año
tienen lugar 1,500 millones de episodios en países en vías de desarrollo, de los
cuales se estima que el 70% son el resultado directo de la contaminación que
presentan algunos de los alimentos que se comercializan. La incidencia de
enfermedades infecciosas como la salmonelosis, la campilobacterosis y las
infecciones causadas por Escherichia coli asociadas a la contaminación de los
alimentos está aumentando en los países industrializados.

En México, un estudio gubernamental realizado en 2003, reportó 4 556 decesos

causados por infecciones intestinales. En 2001, la Secretaría de Salud (SSA)
informó que las enfermedades gastrointestinales, ocasionadas por bacterias o
parásitos, ocupaban la decimocuarta causa de fallecimientos a nivel nacional, y

14
que los estados con mayor incidencia eran: Chiapas, Oaxaca, Guanajuato,
Veracruz, Puebla, y el Distrito Federal.

La contaminación de los alimentos en México constituye un problema de salud

pública que requiere mucha atención, ya que afecta significativamente a sus
habitantes, lo cual se muestra con las elevadas cifras informadas en los casos de
gastroenteritis y otras enfermedades diarreicas del país.

Debido al incremento en estos casos vinculados directamente a los problemas

sanitarios, la exigencia a las autoridades correspondientes, están volviéndose más
rigurosas en cuanto al control de la calidad e inocuidad de los alimentos.

Es por ello que la validación de métodos ha sido objeto de atención por ser
requerida en normas sobre sistemas de gestión de la calidad. La mayor severidad
de las normas y el aumento de las acciones de inspección indican que la situación
de los productos alimenticios, tanto en los mercados nacionales como
internacionales, debe ser objeto de esfuerzos sostenidos para lograr que todos los
países cuenten con sistemas efectivos de control de calidad e inocuidad.

Muchas veces evitar la contaminación de los alimentos se vuelve imposible,

debido a que las bacterias y sus toxinas son inodoras e insípidas en una
contaminación reciente, además de no ser posible su detección a simple vista, sin
embargo, estos casos de enfermedades alimentarias, se pueden disminuir
sensiblemente aplicando en los centros de producción de alimentos sistemas de
gestión de la inocuidad (ISO 22,000), que cuenta con herramientas tales como
buenas prácticas de higiene y sanidad (BHP), y un sistema de aseguramiento de
la calidad e inocuidad HACCP (Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos),
que ayude en el sistema de gestión de la calidad en cada etapa de proceso en la
industria alimentaria.

Después de aplicar los sistemas para el aseguramiento de la calidad de un

producto, se hace un seguimiento (comprobación) del cumplimiento de los
mismos, para esto, se emplean métodos de pruebas rápidas que permitan
monitorear los puntos críticos de control en el proceso de la producción de
alimentos.
15
Para que el control sea eficaz, los resultados obtenidos al aplicar los métodos
microbiológicos deben ser confiables, técnicamente válidos, lo cuales se obtienen
con la validación del método.

Tomando en cuenta la problemática planteada se considera de gran importancia

contar con métodos que ayuden a la detección de bacterias coliformes y
especialmente Escherichia coli, los cuales nos permitan obtener resultados
confiables para conocer la calidad del alimento.

16
6. ALCANCE Y LIMITACIONES

Alcance

El presente proyecto de validación es de suma importancia para la empresa

IQUISSA Asesores Químicos, ya que su finalidad es tener una serie de métodos
validados, entre los cuales se encuentra el “MÉTODO DE PRUEBA (CCAYAC-
M-004/11) PARA LA ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA
TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) , DETECCIÓN DE
COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli”, en
productos lácteos, con el propósito de demostrar que se obtienen resultados
analíticos técnicamente válidos, al emplear el método; elevar la calidad de los
trabajos realizados por la empresa, aumentar la confianza en los clientes y cumplir
con requerimientos legales que sustenten el reconocimiento de “LABORATORIO
TERCERO AUTORIZADO”, distintivo que otorga la “COFEPRIS”, organismo
perteneciente a la Secretaría de Salud (SSA).

Limitaciones

Durante el desarrollo de este trabajo se presentaron diversos inconvenientes, tales

como, requerir hacer más repeticiones en la determinación de la fase estacionaria
y consecuentemente en la estandarización del tamaño de inóculo, puesto que
pequeños cambios en las condiciones de trabajo (Ej. tiempo de homogeneización)
entre cada repetición ocasionaban grandes variaciones en el número de
microorganismos esperado conforme a tiempo, dilución y volumen definidos,
dichas variaciones se fueron estandarizando con cada vez que se reproducía esta
etapa del método. La falta de agitadoras (para airear y mezclar el medio de
cultivo), también complicó el desarrollo de esta etapa. Sin embargo los resultados
obtenidos en el trabajo cumplieron con los criterios establecidos para la validación
del método.

17
7. FUNDAMENTO TEÓRICO

7.1 ¿Qué es validación?

La validación del método es un proceso que es una parte importante del programa
de garantía de la calidad mediante el cual los atributos de figuras de mérito de un
método se determinan y se evalúan de forma objetiva (McCully y col., 1980). Otra
forma de decir esto es que la validación del método es un proceso mediante el
cual se establece que si el método se realiza correctamente, produce resultados
que son de calidad aceptable.

Validación: es la confirmación por examen y la provisión de evidencia objetiva de

que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico propuesto
(NMXEC-17025-IMNC-2000).

En particular para mediciones analíticas, se define a la validación de métodos,

como el proceso de establecer las características de desempeño y las limitaciones
de un método y la identificación de las influencias que pueden cambiar esas
características, y en qué medida. Como alternativa, establece que la validación de
métodos es el proceso de verificar que un método es apropiado para un propósito
dado, es decir, para usarse en la solución de un problema analítico particular.

Es el proceso que establece, mediante estudios de laboratorio, si las

características de desempeño de un método, satisfacen los requisitos para su
aplicación analítica.

Validación parcial (confirmación del método); evidencias objetivas para demostrar

que al aplicar un método normalizado, se cumple con las especificaciones del
mismo y se cuenta con la competencia técnica para realizarlo adecuadamente
tomando en consideración sus propias instalaciones, equipos, personal.

18
Existen varias formas de llevar a cabo una validación, de acuerdo a sus objetivos y
alcances, los cuales depende del analista, del laboratorio y del uso que se haga
del método; además el analista debe conocer los resultados esperados y definir el
nivel de confianza. El laboratorio que desarrolla o aplica el método es el
responsable del proceso de validación (Holcombe, H. 1998).

La validación del método consiste en determinar los parámetros Estadísticos de un

método para decidir si el método es adecuado para un propósito específico.
Muchos métodos son validados por las organizaciones de normas de consenso.

7.2 Diferencia entre una validación y una verificación

La ISO 9000 [9] define verificación como “confirmación, a través de la aportación

de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos especificados”. Esta es
muy similar a la definición de validación que ofrece la ISO/IEC 17025. El VIM [7]
establece que la verificación es “la aportación de evidencia objetiva de que un
elemento dado satisface los requisitos especificados” y que validación es una
“verificación, donde los requisitos especificados son adecuados para un uso
previsto”.

Un laboratorio puede adoptar un procedimiento validado que, por ejemplo, ha sido

publicado como una norma, o adquirir un sistema de medida completo y emplearlo
para una aplicación específica a partir de un desarrollo comercial. En ambos casos
el trabajo de validación básica se ha realizado, pero el laboratorio debe confirmar
su capacidad para aplicar el método. Esta es la verificación. Esto implica que debe
realizarse algún trabajo experimental para demostrar que el método funciona
adecuadamente en el laboratorio.

19
7.3 Necesidad de una validación

¿Por qué es necesario validar un método?

Existen diversas razones que hacen necesaria una validación, para el caso
específico de análisis microbiológicos existen principalmente dos, una de ellas es
una cuestión de carácter científico y técnico, mientras que la otra está relacionada
con la aplicación de la normativa vigente, el comercio y la protección de los
consumidores.

En primer lugar, en el último decenio ha quedado cada vez más claro que la
fiabilidad de los análisis de alimentos no es tan grande como se creía. Indicios en
este sentido se encuentran en varias fuentes, como por ejemplo los diversos
estudios sobre garantía de la calidad realizados por la OMS en relación con
laboratorios que facilitan datos para el Sistema Mundial de Vigilancia del Medio
Ambiente/Alimentos (SIMUVIMA/Alimentos).

La recopilación más amplia de datos es tal vez la correspondiente al Plan de

evaluación de los resultados de análisis de alimentos realizados en el Reino
Unido. Más de 200 laboratorios participan en este Plan, en el que se evalúan los
resultados de laboratorios que trabajan en uno o más de los ocho ámbitos
representativos del análisis de alimentos.

En segundo lugar, el rápido incremento de la legislación nacional sobre control de

los alimentos y protección de los consumidores, así como los acuerdos sobre
comercio internacional basados en el reconocimiento mutuo de los resultados de
laboratorio, el cual ha de basarse a su vez en alguna prueba tangible, exigen una
confianza demostrable en los datos analíticos.

Además del compromiso profesional que tienen los laboratorios hacia sus clientes,
ya que estos esperan confiar en los resultados informados y generalmente los
cuestionan cuando aparece algún conflicto (aquí el analista debe demostrar que
ha informado la respuesta correcta para la parte analítica del problema del cliente
(la validación del método permite demostrar que “el método es apto para el
propósito”)

20
El objetivo general de realizar la validación de un método es demostrar que los
métodos son ‘adecuados al uso previsto’. Sin embargo, hay que reconocer que un
estudio de validación del método proporciona beneficios adicionales al laboratorio
que lo realiza. Proporciona un conocimiento sólido y experiencia en los detalles
prácticos para llevar a cabo el método, incluyendo el conocimiento de las etapas
críticas del proceso. La validación da al laboratorio y sus empleados una mayor
confianza en sus propios resultados.

7.4 ¿Cuándo realizar una validación?

Un método debe ser validado cuando es necesario demostrar que sus

características de desempeño son adecuadas para el uso previsto. La Norma
ISO/IEC 17025 menciona que el laboratorio debe validar:

• Métodos no normalizados

•Métodos diseñados/desarrollados por el laboratorio

•Métodos normalizados usados fuera de su ámbito de aplicación

•Ampliaciones o modificaciones de métodos normalizados.

La validación debe ser tan amplia como sea necesaria para cumplir con los
requisitos en relación con el uso dado o la aplicación [23].La extensión (‘alcance’)
de la validación dependerá de la aplicación, la naturaleza de los cambios
realizados y de las circunstancias en que el método se va a utilizar.

También debe validarse cuando es necesario demostrar la equivalencia de los

resultados obtenidos por dos métodos, por ejemplo, un método recientemente
desarrollado y un método normalizados existente.

21
Para los métodos normalizados, tales como los publicados en ISO o ASTM, no es
necesario validar el método utilizado por el laboratorio. Sin embargo, el laboratorio
necesita verificar el desempeño del método como se detalla en la norma ISO/IEC
17025 (...El laboratorio debe confirmar que puede operar adecuadamente los
métodos normalizados antes de introducir los ensayos o calibraciones).

También es necesaria la verificación cuando hay cambios importantes, como el

uso de un equipo nuevo (pero similar), traslado de equipos, entre otros.

La ISO 15189 [2] hace hincapié en que los procedimientos de examen usados sin
modificaciones deben estar sujetos a una verificación independiente antes de ser
usados como métodos de rutina. También puede tenerse en cuenta la
actualización del software de un equipo, o cuando los resultados de control de
calidad indica que el desempeño del método cambia con el tiempo.

7.5 ¿Cómo realizar la validación?

Una vez finalizado el desarrollo inicial del método, el laboratorio debe documentar
en detalle el procedimiento de medición. Este procedimiento documentado es el
que se toma para la validación formal del método.

Clasificación de los métodos analíticos

a) Métodos estándar o normalizados

Los métodos normalizados son aquellos publicados por organizaciones
internacionales, o nacionales; por organizaciones técnicas reconocidas;
referencias legales; métodos publicados por la FDA (Food and Drug
Administration), etc, y que se ejecutan tal y como se describen en la norma
(CENAM, 2004).

22
Muchas veces se prefiere usar los métodos normalizados, sin embargo es
necesario la verificación de la capacidad analítica dentro de los laboratorios en los
cuales son usados (CENAM, 2004).

b) Métodos desarrollados por el laboratorio

En ocasiones cada laboratorio elabora sus propios manuales de métodos, esto

puede deberse a que el análisis es muy específico o simplemente para simplificar
la obtención del resultado y la elaboración del análisis o prueba analítica, por
ejemplo, cierta matriz especifica que solo interesa al laboratorio; o que debido a
restricciones de tipo comercial no se puede disponer de métodos análogos usados
en otras empresas o compañías. El laboratorio, por consiguiente, debe evaluar la
capacidad de los analistas, equipos y otros recursos relacionados con la ejecución
del método en cuestión. Dichos métodos deben estar debidamente validados,
documentados y autorizados, para la evaluación de la capacidad del método se
sugiere realizar comparaciones con métodos normalizados, preferentemente que
tengan similitud con el método propuesto por el laboratorio. En lo posible se debe
usar materiales de referencia, estándares o muestras fortificadas (CENAM, 2004).

c) Métodos no normalizados

Los métodos no normalizados son aquellos que no han sido publicados por
fuentes autorizadas y/o validadas. Es muy probable que estos métodos sin
normalización no dispongan de datos de validación o estudios corroborativos
fiables o suficientes, por esto se recomienda realizar una validación del método
cuanto sea posible. Si el método sufre cambios se requerirá una re-validación del
método.

23
La validación examina las características de desempeño de un método para
identificar y establecer cualquier limitación que pueda esperarse del método
cuando se aplique a un tipo específico de muestra. (CENAM, 2004)

Clasificación de métodos (según su categoría)

 Categoría I: para la cuantificación de materia prima o principio activo en
producto terminado.
 Categoría II: para determinar impurezas en materia prima o compuestos de
degradación en producto terminado; o para análisis de residuos en material
biológico o alimentos.
 Categoría III: para determinar las características de funcionamiento como
disolución o liberación de droga en el organismo.

Los parámetros recomendados para la validación total o completa de un método

de ensayo (prueba) no normalizado que incluye mediciones analíticas son:

1. Recuperación

2. Sensibilidad

3. Selectividad

4. Robustez

5. Límite de detección

6. Límite de cuantificación

7. Intervalo lineal y de trabajo

8. Reproducibilidad

9. Repetibilidad

10. Sesgo

11. Incertidumbre

24
Los parámetros para realizar una validación parcial para un método normalizado
son:

1. Recuperación

2. Límite de cuantificación

3. Intervalo de trabajo

4. Reproducibilidad

5. Repetibilidad

6. Sesgo

7. Incertidumbre

Los parámetros para realizar una validación parcial para un método microbiológico
cualitativo normalizado son:

1. Verificación del tamaño de inóculo

2. Verificación de la muestra

3. Verificación del límite de detección

4. Falsos positivos

5. Incertidumbre

Los parámetros para realizar una validación parcial para un método microbiológico
cuantitativo normalizado son:

1. Repetibilidad

2. Reproducibilidad

3. Recuperación

25
4. Sesgo

5. Incertidumbre

Para propósito de acreditación de un método ante la EMA (Entidad Mexicana de

Acreditación), se resumen en la siguiente tabla los requisitos que el evaluador
deberá solicitar respecto a la validación de los métodos de ensayo a acreditar.

Tabla 1. Requisitos de la validación de los métodos de ensayo a acreditar

Situación Grado de validación o revalidación

requerida
Desarrollo de un método para un Completo
problema en particular
Existe un método evaluado para Completo
aplicarlo en un problema particular
Un método establecido, realizar una Parcial o completo
revisión para incorporar innovaciones
Un método establecido, extenderlo o Parcial o completo
adaptarlo a un problema nuevo
Cuando el control de calidad indica que Completo
un método establecido cambia con el
tiempo
Establecer un método en un laboratorio Completo
diferente
Establecer un método con diferente Completo
instrumentación
Establecer un método con diferente Completo
analista u operador

26
El evaluador debe solicitar al laboratorio la validación de todos los métodos (ya
sea parcial o completa), que son empleados en estas técnicas de medición, aun
cuando estos sean normalizados (CENAM, 2004).

7.6 Decisión del grado de validación requerido

El laboratorio debe decidir cuál de los parámetros para la evaluación del

desempeño de un método se necesita caracterizar, y así lograr una validación
acertada que cumpla las expectativas requeridas. Los factores que definen el
alcance de una validación son:

 Frecuencia de uso en el laboratorio: rutina diaria, esporádica, etc.

 Sector de uso del método (categoría del método)
 La existencia de validaciones previas realizadas por organizaciones para la
estandarización del método, como la AOAC International.

 Restricciones de tiempo y costo.

Los lineamientos para la validación usados en un método deben ser acordes con
el sector sobre el cual actúa, por ejemplo, la validación de un método de análisis
en alimentos debe ser consistente con la estrategia de validación usada por la
AOAC International. (CENAM, 2004).

7.7 Parámetros de desempeño del método de validación

Las técnicas estadísticas son esenciales para agrupar los datos obtenidos y
realizar un análisis objetivo de las diferencias entre conjuntos de datos (pruebas
de significación).

27
La selectividad o especificidad

Es la capacidad de un método analítico para determinar exactamente y

específicamente el analito de interés en la presencia de otros componentes en la
matriz bajo condiciones de prueba establecidas (CENAM, 2004).

Límite de detección

El límite de detección se define como la concentración más baja del analito que
puede detectarse con un grado especificado de certeza aplicando un determinado
método de análisis (CENAM, 2004).

“Para una apropiada validación y selección de un procedimiento o método

analítico, es importante tener la información del menor límite al cual el analito
puede ser detectado o determinado con suficiente confianza” (CENAM, 2004).

Es un parámetro de mérito que nos proporciona información acerca de la

presencia de un analito en una muestra dada. Se define como la menor
concentración de un analito que puede ser detectado pero no necesariamente
cuantificada, con un dado nivel de confianza (generalmente 95%). (Spiegel M.
1991)

Holcombe, H. (1998) define al límite de detección como: “El menor contenido del
analito, si está presente, que será detectado y que puede ser identificado”.

28
Límite de cuantificación

Es la concentración más baja a la cual el analito puede cuantificarse con una

precisión y veracidad aceptables bajo condiciones experimentales establecidas
(CENAM, 2004).

La concentración menor del analito que puede cuantificarse con un grado

especificado de certeza aplicando un determinado método de análisis (CENAM,
2004).

“El límite de cuantificación, también conocido como límite de determinación,

estrictamente es la concentración más baja del analito que puede ser determinada
con un nivel aceptable de precisión, de repetibilidad y veracidad” (Holcombe, H.
1998).

Es un parámetro que nos informa acerca de la menor cantidad de analito que

puede ser determinada, en una muestra con un nivel de incertidumbre aceptable,
a un dado nivel de confianza (generalmente 95%) (Spiegel M. 1991).

Intervalo de trabajo e intervalo lineal

Intervalo de trabajo: intervalo comprendido entre las concentraciones superior e

inferior (incluyendo dichas concentraciones) y para las que se ha demostrado que
el analito es cuantificado con un nivel satisfactorio de repetibilidad, recuperación y
linealidad (Holcombe, H. 1998).

Intervalo lineal: es la capacidad de un método analítico para dar resultados que

son directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de un
intervalo dado (Holcombe, H. 1998).

29
Para cualquier método cuantitativo es necesario determinar el intervalo de
concentraciones del analito o los valores de la propiedad relacionada, sobre los
cuales el método puede aplicarse.

Dentro del intervalo de trabajo puede existir un intervalo de respuesta lineal.

Dentro de este intervalo lineal la señal de respuesta tendrá una relación lineal con
la concentración del analito o la propiedad relacionada (Holcombe, H. 1998).

Exactitud

La exactitud expresa la cercanía de un resultado al valor verdadero. Normalmente

la exactitud se estudia en dos componentes. “la veracidad” y “la precisión”

La veracidad de un método es una expresión de que tan cercana se encuentra la

media de un conjunto de resultados respecto del valor lineal.

La veracidad se determina en contra de un valor de referencia, los materiales de

referencia para una validación puede ser:

 Preparados por adición de materiales típicos con materiales de referencia

de pureza certificada.
 Materiales típicos bien caracterizados de estabilidad verificada
internamente y conservados para control de calidad interno.

Normalmente la veracidad se expresa en términos de sesgo. Existen dos

componentes del sesgo:

Sesgo del método; surge de los errores sistemáticos inherentes al método

cualquiera que sea el laboratorio que lo usa.

Sesgo del laboratorio: surge de errores sistemáticos adicionales característicos del

laboratorio y de la interpretación que este hace el método.

30
La precisión es una medida de que tan cercanos están los resultados unos con
respecto de otros y por lo general se expresa mediante medidas tal como la
desviación estándar la cual describe la dispersión de los resultados.

La precisión se define en términos simples como el grado de concordancia mutua

entre los datos que se han obtenido de una misma forma. La precisión constituye
una medida de error aleatorio (Holcombe, H. 1998).

Adicionalmente, una expresión cada vez más común de exactitud es la

“incertidumbre de medición”, la cual proporciona una figura única de expresión de
la exactitud. “La precisión depende sólo de la distribución de los errores aleatorios
y no se relaciona con el valor verdadero o valor de referencia” (Holcombe, H.
1998).

Las medidas de precisión más comunes son la repetibilidad y la reproducibilidad.

La repetibilidad es la cercanía entre sí de las medidas obtenidas con el mismo
método, sobre idéntico material o muestra, en las mismas condiciones (operador,
laboratorio, instrumentación, etc.) y en un intervalo de tiempo pequeño, y puede
medirse solamente dentro del laboratorio; mientras que la reproducibilidad, es la
cercanía entre sí de las medidas obtenidas por el mismo método sobre idéntico
material, bajo condiciones diferentes, y sólo puede medirse en estudios
interlaboratoriales (Holcombe, H. 1998).

31
Incertidumbre de medición

Estimación que caracteriza el intervalo de valores, dentro de los cuales se

encuentra el valor convencionalmente verdadero de la magnitud medida.

La incertidumbre de medición, es un parámetro asociado con el resultado de una

medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser
razonablemente atribuidos al mensurando (Holcombe, H. 1998).

La estimación de la incertidumbre de una medición se realiza en las siguientes

etapas:

 Expresar el modelo matemático del mensurando

 Identificar fuentes de incertidumbre
 Cuantificar la incertidumbre de cada componente

 Combinar las incertidumbres estándares

 Calcular la incertidumbre expandida y definir expresión de los resultados.

Fuentes de incertidumbre

En la práctica la Incertidumbre puede ser el resultado de varias fuentes, como por

ejemplo interferencias, muestreo, condiciones de almacenamiento, efectos
instrumentales, pureza de los reactivos, condiciones ambientales, incertidumbre
en el peso y volumen de reactivos, aproximaciones y suposiciones incorporadas al
método de análisis y a procedimientos, y variaciones aleatorias (Holcombe, H.
1998).

32
Componentes de la incertidumbre

En la estimación de la incertidumbre puede ser necesario tomar cada fuente de

incertidumbre y tratarla por separado para obtener la contribución de esa fuente.

Cada una de estas contribuciones a la incertidumbre, se entiende como un

componente de la incertidumbre.

1. Incertidumbre estándar. Este componente está expresado como una desviación

estándar.

2. Incertidumbre estándar combinada (u (y) c). Para un resultado de la medición

(y), la incertidumbre total o incertidumbre estándar combinada es una estimación
de la desviación estándar igual a la raíz cuadrada positiva del total de la varianza
obtenida por la combinación de todos los componentes de la incertidumbre.

3. Incertidumbre expandida (U). Provee un intervalo dentro del cual el valor del
analito es dado con un alto nivel de confianza. La incertidumbre expandida se
obtiene multiplicando la incertidumbre estándar combinada por un factor k. La
elección del factor k es en el nivel de confianza deseado (para un nivel de
confianza del 95%, k es igual a 2). (Infante G. y Zárate de L. 1990.)

Sensibilidad

Es el cambio en la respuesta del instrumento que corresponde a un cambio en la

concentración del analito. Es la pendiente del intervalo de trabajo y cuanto mayor
sea esta, mayor es la sensibilidad del método (Holcombe, H. 1998).

La sensibilidad es la capacidad del instrumento para discriminar pequeñas

diferencias en la concentración del analito. Dos factores limitan la sensibilidad: la
pendiente de la curva de calibración, y la precisión (Holcombe, H. 1998).

33
La IUPAC define la sensibilidad como la pendiente de la línea de calibrado. A
veces se emplea erróneamente como sinónimo de límite de detección.

La sensibilidad se entendería como la pendiente de la curva de respuesta, es

decir, el cambio en la respuesta de la medición que corresponde a un cambio en la
concentración del analito. Cuando se ha establecido que la respuesta es lineal con
respecto a la concentración (dentro del rango de trabajo del método) y se ha
determinado la intercepción de la línea de regresión, la sensibilidad es un
parámetro útil para calcular y usar en fórmulas de cuantificación.

Robustez

Es la medida de la capacidad del método analítico de permanecer inalterado por

pequeñas, pero deliberadas variaciones (efecto de cambio en las condiciones) en
los parámetros del mismo, proporcionando un índice de confiabilidad durante su
uso normal (Holcombe, H. 1998).

Recuperación

Cantidad del analito recuperada en la porción de muestra o muestra adicionada

cuando esta es conducida a través del método analítico completo, y que permite
evaluar la eficiencia de la extracción, proceso de preparación e interferencias que
puedan existir al aplicarlo, se expresa en términos de porcentaje (CENAM, 2004).

Exactitud relativa o recuperación

Es la aproximación entre un resultado de la prueba y el valor de referencia

aceptado. Para el propósito de este trabajo, se expresa como: la cantidad de
microorganismo recuperado entre la cantidad de microorganismo inoculado o nivel
de fortificación. (CCAYAC-CR-01/1, 2016).
34
Reproducibilidad

Grado de concordancia entre resultados analíticos individuales, cuando el

procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de una muestra
homogénea por dos analistas o instrumentos diferentes, usando el mismo método
en diferentes días (CCAYAC-CR-01/1, 2016).

Repetibilidad

Grado de concordancia entre resultados analíticos individuales, cuando el

procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de una muestra
homogénea por un solo analista, usando los mismos instrumentos y método en
intervalos cortos de tiempo (CCAYAC-CR-01/1, 2016).

35
7.7 MICROORGANISMOS DE INTERÉS

Escherichia coli y Coliformes (Bacterias del grupo coli-aerogenes)

Escherichia coli es huésped constante del intestino del hombre y de los animales
de sangre caliente. Por su especificidad está considerado como un buen índice de
contaminación fecal. Tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el ambiente
extraentérico, por lo que su presencia en los alimentos indica contaminación
reciente.

Escherichia coli es la bacteria más constantemente encontrada en las materias

fecales del hombre y de muchas especies animales. Su nicho ecológico natural es
el intestino delgado y grueso, forma parte de la flora nativa intestinal.

E. coli es un bacilo gramnegativo, con una sola cadena espiral de ADN, móvil,
aerobio y aerobio facultativo, con flagelos perítricos. La mayoría forma fimbrias y
pilis, muchas cepas producen una pequeña microcápsula, y muy pocas elaboran
macrocápsulas, y no fabrican esporas. En las pruebas bioquímicas es positiva a
Indol, descarboxilasa de lisina, fermentación de manitol y gas a partir de la
glucosa; además es lactosa positiva en el 90% de las cepas con citrato negativo.

Es común la determinación de gérmenes coliformes, que incluyen E. coli, en

pruebas preliminares. Si de estas pruebas iniciales se deduce la posibilidad de
contaminación fecal, los coliformes se someten a otros ensayos para determinar si
entre ellos está presente E. coli. El término general coliformes comprende E. coli y
especies de otros géneros de la familia Enterobacteraceas (Thatcher, F. S. y
Clark, D. S. 1972).

36
En los alimentos, E. coli es por lo general el indicador preferido para significar una
contaminación de origen fecal relativamente creciente o a partir de un substrato en
el cual ha tenido lugar la proliferación de E. coli. Por lo que se refiere a la garantía
del alimento, es decir, al riesgo que se pueda producir en una enfermedad en el
consumidor, la presencia de E. coli es mucho más indicativa que la de otros
coliformes.

37
8. PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES
REALIZADAS

8.1. Matriz, equipos, materiales, reactivos, medios de cultivo y cepa

8.1.1 Selección de la matriz

De acuerdo con la guía para la evaluación del desempeño de métodos de prueba
microbiológicos por la técnica del número más probable CCAYAC-CR-01/1 (2016),
cada método de prueba debe contar con la evaluación del desempeño, en al
menos una matriz. Cada método de prueba a validar debe evaluarse para
demostrar que es adecuado para el análisis en cada uno de los grupos de interés,
evaluando al menos una de las matrices que lo conforman.

Tabla 2. Matrices propuestas por la CCAYAC-CR-01/1(2016), para cada grupo de

interés.

Grupos de Cárnicos Aves Productos Frutas y Productos

interés de la pesca vegetales lácteos

Tipos de Crudos Crudos Crudos Crudos Crudos

alimentos: Procesados Procesados Procesados Procesados Procesados
Congelados Congelados Congelados Congelados Congelados
Otros Otros Secos Secos Secos
Otros Otros Otros

Ejemplos Carne Pollo Moluscos Mango Leche

de matriz: molida Nugets pescado Coctel Queso
Guisados Milanesas de Filete Leche en
Carne pollo Camarón polvo
congelada Congelado

38
Se tomó como ejemplo de matriz; queso panela, considerando que en esta matriz
se encuentra potencialmente el analito de interés, además constituye el producto
que más se recibe en el laboratorio, y es representativo de los productos lácteos.

Se recomienda utilizar muestras libres del analito en cuestión, en algunos casos

se pueden producir artificialmente por métodos de esterilización que causen
mínima modificación en la composición de la matriz (CCAYAC-P-062, 2015).

Generalidades del queso panela

El queso es un alimento de amplio consumo a nivel mundial, cuyas características

nutritivas, funcionales, texturales y sensoriales difieren entre cada tipo. Se estiman
más de 2000 variedades de queso (Gunasekaran y Ak, 2003), entre maduros,
semi-madurados y frescos. No obstante en nuestro país predomina el consumo de
quesos frescos, mismos que forman parte de una enorme variedad de platillos que
constituyen nuestro legado gastronómico.

Definición de queso

Según la Reglamentación Técnico-Sanitaria de la leche y productos lácteos, el

queso es el producto obtenido por coagulación enzimática de la leche y/o
determinados productos lácteos, con previa o posterior separación de al menos
parte del agua, lactosa y sales minerales, seguida o no de maduración.

La organización internacional FAO (Food and Agricultural Organization) define el

queso como el producto fresco o madurado obtenido por coagulación de la leche u
otros productos lácteos (nata, leche parcialmente desnatada, nata de suero o la
mezcla de varios de ellos), con separación del suero.

39
Desde el punto de vista fisicoquímico, el queso se define como un sistema
tridimensional tipo gel, formado básicamente por la caseína integrada en un
complejo caseinato fosfato cálcico, el cual por coagulación, engloba glóbulos de
grasa, agua, lactosa, albúminas, globulinas, minerales, vitaminas y otras
sustancias menores de la leche, las cuales permanecen adsorbidas en el sistema
o se mantienen en la fase acuosa retenida (Walstra et al., 2006).

40
8.1.2 Equipo

Tabla 3. Descripción de equipos a utilizar en el procedimiento de validación.

Equipo Características Calibración Verificación

Baño de agua Con recirculación
continua, tapa de dos
aguas y termostato que Aplica NA
evite variaciones
mayores a 0.1ºC
Lámpara de luz De longitud de onda
UV (365nm) de 4 Watts NA NA
Incubadora con Con control de
termostato temperatura de 35ºC ± Aplica NA
0.5ºC
Balanza granataria Con precisión de 1 mg.
Aplica Aplica
Contador de Con luz adecuada, placa
colonias de campo de cristal cuadriculada y NA NA
oscuro lente amplificador.
Motor de licuadora Motor eléctrico, carcaza
de metal o plástico, NA NA
potencia de 200 W.
Potenciómetro Con sensibilidad de 0.1 Aplica Aplica
de unidad pH
Mecheros Bunsen Con conexión para el NA NA
suministro de gas,
válvula de ajuste para
regular el flujo de gas
Autoclave Intervalo de trabajo:
121ºC. Con termómetro NA Aplica
y manómetro.
Micropipeta* Capaz de distribuir 1 mL Aplica Aplica
NA: No aplica.

*Opcional

41
8.1.3 Materiales

Tabla 4. Descripción de materiales de uso general a utilizar en la validación.

Material Cantidad Características

Pipeta bacteriológica 100 Capacidad de 1 mL, con tapón
de algodón. Las pipetas
pueden ser graduadas en
volúmenes iguales. Vidrio.
Frasco de dilución 50 De boca ancha con capacidad
mínima de 200 mL con tapón a
rosca. Vidrio.
Tubo de cultivo 100 De 16x150 mm con tapón a
rosca. Vidrio
Matraz Erlenmeyer 20 Con capacidad de 250 mL con
tapón de algodón. Vidrio.
Cajas Petri 100 Con área de 65 cm2. Vidrio.
Mechero Fischer 2 __
Puntas para micropipeta 100 Con capacidades para 0.5 y 1
mL
Utensilios esterilizables --- Cucharas de acero inoxidable,
para la obtención de espátulas de acero inoxidable
muestras para uso de laboratorio, asas
de platino calibradas de 10µL,
algodón, etc.
Material de uso personal --- Cofia, cubre boca, bata,
guantes, zapatos cerrados;
deben utilizarse con base en
las buenas prácticas de higiene
y sanidad.

Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo
estudio debe esterilizarse mediante: horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a
180°C; o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C (NOM-
113-SSA1-1994).

Para comprobar que en los trabajos realizados se alcanzaron las condiciones de

esterilización se empleó cinta testigo.
42
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las
esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte (NOM-113-
SSA11994).

8.1.4 Reactivos

Los reactivos y medios de cultivo deben cumplir con las características adecuadas
para obtener resultados confiables al emplearlos en el método.

Tabla 5. Descripción de reactivos a utilizar en la validación.

Reactivos Características
Solución diluyente reguladora de En escamas, granular, polvo o perlas.
fosfatos (solución concentrada) Marca: J.T. BAKER® Lote:
E51C13 Grado: analítico Pureza: 98%
Solución de Hidróxido de sodio 1.0 N En escamas, granular, polvo o perlas.
Marca: J.T. BAKER® Lote:
G41C74 Grado: analítico Pureza: 97%
Agua destilada pH: 6,8 Conductividad: µS/cm a 25ºC: 4,0
Reactivo de Kovacs ρ-dimetilaminobenzaldehído
Alcohol amílico
HCl concentrado
Reactivo de Voges-Proskauer Alfa-naftol
Alcohol absoluto
Hidróxido de potasio
Agua destilada
Indicador rojo de metilo Rojo de metilo
Etanol al 95%
Agua destilada
Reactivos para la coloración de Gram Cristal violeta
Etanol al 95%
Oxalato de amonio
Agua destilada
Iodo
Ioduro de potasio (KI)
Safranina
Etanol al 95%
43
8.1.5 Medios de cultivo

Medios de cultivo: Se pueden utilizar medios comerciales que cumplan con las
características deseadas.

Se prepararon cajas Petri controles con cada uno de los medios de cultivo que se
describen a continuación, esto para verificar su esterilidad en cada etapa del
proceso experimental.

Tabla 6. Descripción de medios de cultivo a utilizar en la validación.

Medios de cultivo Características

Agar Bilis y Rojo Violeta Marca: BD DIFCO TM Fecha de caducidad:
Base para el aislamiento y la 2019-01-31 Lote: 3084024
diferenciación de microorganismos
entéricos.
Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) Marca: BD BIOXON® Fecha de caducidad:
Para el cultivo de microorganismos 2019-04-03 Lote: 1174040
exigentes.
Agar Base Sangre (BAS) Aislamiento, Marca: BD BIOXON® Fecha de caducidad:
cultivo y actividad hemolítica de 2018-04-20 Lote: 0169244
gérmenes difíciles por adición con
sangre.
Lauril Sulfato-MUG Marca: BBL TM Fecha de caducidad: 2019-
Base para la detección de organismos 05-31 Lote: 5163712
coliformes
Caldo lauril triptosa Marca: DIFCOTM Fecha de caducidad:
Base para la detección de organismos 2021-02-29 Lote: 6118809
coliformes
Agar eosina azul de metileno de Levin Marca: BBL TM Fecha de caducidad: 2020-
(EMB-L) 01-31 Lote: 6174865
Base para la detección de coliformes y
otros bacilos entéricos
Caldo triptona al 1% (triptófano) Marca: DIFCO TM Fecha de caducidad:
Base para el cultivo de Brucella y otros 2020-07-31 Lote: 5243653
microorganismos difíciles
Caldo MR-VP Marca: BD BIOXON® Fecha de caducidad:
2019-03-29 Lote: 4281941
Condiciones de almacenamiento: todos los medios de cultivos son conservados en
refrigeración a 4°C
44
8.1.6 Cepa

“Las cepas empleadas deberán proceder de colecciones nacionales o

internacionales certificadas o en su defecto, cepas aisladas en el laboratorio
siempre que se demuestre su identidad, pureza y viabilidad”, (CCAYAC-P-062,
2015).

“Deben usarse cepas control positivo las cuales son aquellas de propósito de
interés del método y controles negativos que serán aquellas indicadas en el
método de prueba o en su defecto las que puedan mencionarse como biota
acompañante o que se puedan considerar como interferentes de microorganismos
control positivo”. (CCAYAC-CR-01/1, 2016).

Para la evaluación del desempeño de este método se consideró emplear la

bacteria Escherichia coli con clave ATCC 25922 como control positivo y a
Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control negativo.

45
8.2 Determinación de la fase estacionaria

1. Se tomó una azada de la cepa pura preservada y se realizó la siembra por

estría cruzada en una placa Petri con medio de agar base sangre (BAS), se incubó
la caja por 24 horas a 35±2 °C. En forma paralela se incubó una placa testigo.

2. Posteriormente se transfirió con una asa una colonia característica crecida en

BAS (con un diámetro aproximado de 0.3 cm) a un tubo con 9 mL de caldo
infusión cerebro corazón (BHI); se incubó el tubo por 24 horas a 35±2 °C. Se
incubó también un testigo.

3. Del tubo anterior, se inoculó 0.5 mL de cultivo a cada matraz que contenía 45
mL de caldo BHI estéril, se repitió este procedimiento hasta tener una serie de
matraces, los cuales variaron en número, dependiendo de las diferentes horas
monitoreadas. Los matraces se incubaron a 35±2 °C con su respectivo testigo, a
diferentes periodos de tiempo.

4. Transcurrido el tiempo de incubación del cultivo en matraz para cada hora que
se decidió monitorear la cinética microbiana, se realizaron las inoculaciones por
vaciado en placa, para lo cual, se prepararon diluciones decimales, agregando 1
mL de inóculo en 9 mL de diluyente, agitando la mezcla manualmente con 25
movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7
segundos, tal como se indica en la NOM 110-SSA1-1994, “Preparación y Dilución
de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”, para obtener placas
con colonias contables.

5. De las respectivas diluciones seleccionadas, se agregó 1 mL a placas Petri por

duplicado utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

6. Se vertió de 15 a 20 mL del medio agar bilis y rojo violeta (RVBA) fundido y

mantenido a 45±1 °C en baño de agua.

46
7. Se mezcló cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de
derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj,
seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de
atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada (NOM-113SSA1-1994).

8. Se preparó una placa control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad.

9. Después de que estuvo el medio completamente solidificado en la caja, se

vertió aproximadamente 4 mL del medio RVBA a 45±1 °C en la superficie del
medio inoculado. Se dejó solidificar.

10. Se invirtieron las placas y se colocaron en la incubadora a 35±2 °C, durante 24

horas.

11. Finalmente se contaron las colonias crecidas en el medio, en un rango de 15-

150 UFC/mL como menciona la NOM-113-SSA1-1994 “Método para cuenta de
microorganismos coliformes totales en placa”, y se eligió el periodo de incubación
en el que las cuentas eran similares (inóculo constante); identificándola como la
fase estacionaria. Se graficaron los resultados.

El procedimiento anterior se realizó 3 veces para asegurarse de que los resultados

obtenidos de la cinética microbiana son válidos y reproducibles tal como menciona
la guía de la (CCAYAC-P-062, 2012)

A continuación, se mencionan los procedimientos realizados para determinar la

fase estacionaria de Escherichia coli (ATCC 25922).

47
PLAN DE ACTVIDADES 1

Fecha de prueba: 25 al 28 de octubre de 2016.

Se realizó una cinética microbiana para conocer la fase estacionaria de

Escherichia coli (ATCC 25922), se realizaron los pasos mencionados en el
apartado 8.2. (plan general), inoculando los matraces que fueron incubados de
acuerdo a la tabla siguiente; transcurrido el tiempo de incubación correspondiente
a cada matraz, se hicieron las diluciones indicadas para cada uno con la finalidad
de poder hacer el conteo de colonias. El procedimiento se repitió 3 veces (plan de
actividades 2 y 3).

Tabla 7. Tiempos de monitoreo para la determinación de la fase estacionaria (plan

de actividades 1).

Número de matraces Horas de incubación Diluciones sembradas

1 0 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
2 2 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
3 4 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8
4 6 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8
5 8 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
6 10 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
7 12 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
8 14 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
9 16 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
10 18 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
11 20 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
12 22 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
13 24 10-6, 10-7, 10-8, 10-9

48
PLAN DE ACTIVIDADES 2

Fecha de prueba: 1 al 4 de noviembre de 2016

Tabla 8. Tiempos de monitoreo para la determinación de la fase estacionaria (plan

de actividades 2).

Número de matraces Horas de incubación Diluciones sembradas

1 0 10-5, 10-6, 10-7
2 2 10-5, 10-6, 10-7
3 4 10-6, 10-7, 10-8
4 6 10-6, 10-7, 10-8
5 8 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
6 10 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
7 12 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
8 14 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
9 16 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
10 18 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
11 20 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
12 22 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
13 24 10-6, 10-7, 10-8, 10-9

49
PLAN DE ACTIVIDADES 3

Fecha de prueba: 7 al 10 de noviembre de 2016

Tabla 9. Tiempos de monitoreo para la determinación de la fase estacionaria (plan

de actividades 3).

Número de matraces Horas de incubación Diluciones sembradas

1 0 10-5, 10-6, 10-7
2 2 10-5, 10-6, 10-7
3 4 10-6, 10-7, 10-8
4 6 10-6, 10-7, 10-8
5 8 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
6 10 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
7 12 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
8 14 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
9 16 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
10 18 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
11 20 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
12 22 10-6, 10-7, 10-8, 10-9
13 24 10-6, 10-7, 10-8, 10-9

50
PLAN DE ACTIVIDADES 4

Se aplicó la “Prueba para detectar E. coli en alimentos refrigerados o congelados

excepto moluscos bivalvos” que indica el documento “MÉTODO DE PRUEBA
(CCAYAC-M-004/11) PARA LA ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD MICROBIANA
POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP), DETECCIÓN DE
COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli”, mediante
la técnica del número más probable como prueba presuntiva y la identificación
bioquímica como prueba confirmativa para E. coli., en queso panela.

8.3 Prueba para detectar E. coli en alimentos refrigerados o congelados

excepto moluscos bivalvos

8.3.1 Prueba presuntiva

1. Se pesó 25 gramos de queso panela (muestra fortificada) en 225 mL de

solución reguladora de fosfatos y se homogenizó durante 2 minutos en licuadora.

2. Se prepararon diluciones decimales con regulador de fosfatos, agregando 1 mL

de la disolución en 9 mL de diluyente, agitando la mezcla manualmente 25 veces
en un arco de 30 cm por 7 segundos.

3. Se transfirió 1 mL de cada dilución a 3 tubos con 10 mL de caldo lauril con

MUG. Posteriormente se incubaron los tubos con caldo lauril + MUG a 35 ± 0.5 ºC
durante 24 h.

4. Se adicionó un tubo control positivo (E. coli ATCC 25922) y un tubo control
negativo (Staphylococcus aureus ATCC 25923) para facilitar la diferenciación
entre los tubos que presenten sólo crecimiento y crecimiento con fluorescencia.

5. Se calculó el NMP de E. coli basada en la confirmación de tubos en las 3

diluciones consecutivas.

51
8.3.2 Prueba confirmativa

Prueba confirmativa para Escherichia coli (por identificación bioquímica)

1. Se tomaron tubos positivos y se estriaron cada uno en cajas con agar con EMB-
L para su aislamiento. Se incubaron las placas invertidas a 35ºC durante 18-24
horas.

2. Se seleccionaron dos colonias de cada placa con la siguiente morfología

colonial: colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico y se sembraron
en cajas con agar cuenta estándar, para realizar las pruebas de morfología
microscópica y pruebas bioquímicas. Posteriormente se incubaron las cajas a
35ºC por 18-24 horas.

3. Se realizó un frotis tomando una azada de la muestra y se fijó con calor

moderado en un portaobjetos, se adicionó la solución de cristal violeta y se dejó
actuar por un minuto, se lavó con agua y se escurrió, después se agregó etanol al
95% hasta que la coloración azul dejó de fluir, inmediatamente después se
enjuagó con agua destilada y se escurrió nuevamente, posteriormente se aplicó la
coloración de contraste (safranina) durante 30 segundos, se escurrió y dejó secar
al aire. Se observó al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos
Gram-negativos.

52
PRUEBAS BIOQUIMICAS

Se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas: Indol, Rojo de metilo, Voges

Proskauer, Citrato (IMViC).

1. Producción de Indol: se inoculó un tubo con caldo triptona, se incubó a 35º±0.5

C por 24 horas. Se adicionó 0.3 mL de reactivo de Kovacs

2. Rojo de metilo: se inoculó un tubo con caldo MR-VP y se incubó a 35º±0.5 C

durante 48 ±2 horas, se adicionó 5 gotas de solución de rojo de metilo.

3. Voges Proskauer: se inoculó un tubo con caldo MR-VP y se incubó a 35º±0.5 C

durante 48 ±2 horas, se transfirió 1 mL a un tubo de ensaye y se adicionó 0.6 mL
de solución de alfa naftol y 0.2 mL de hidróxido de potasio al 40%, se agitó la
solución.

4. Citrato de Simmons: se preparó un tubo con agar inclinado de citrato de

Simmons y se inoculó por estría, posteriormente se incubó a 35º±0.5 C durante 48
horas.

53
8.4 Preparación y análisis de la matriz

Verificación de la presencia o ausencia del microorganismo de interés en la matriz.

La preparación de la muestra se hizo de acuerdo a lo establecido en la NOM-

110SSA1-1994 “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis
Microbiológico”.

Como la matriz fue queso panela se analizaron ciertas características que

pudieran interferir en su fortificación, optando por esterilizar la muestra. Para ello,
se realizó una dilución primaria (10-1) adicionando 225 mL de diluyente estéril a
25 g de queso panela LALA®, se homogenizó la mezcla durante dos minutos en
un vaso de licuadora estéril y se vació la mezcla en un frasco para esterilizar la
muestra durante 2 min a 121ºC.

Se analizó la muestra de la siguiente manera para verificar su esterilidad:

1. Se colocó en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra homogenizada

(dilución primaria) utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

2. Se vertió de 15 a 20 mL del medio agar bilis y rojo violeta (RVBA) fundido y

mantenido a 45±1 °C en baño de agua.

3. Se mezcló cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de

derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj,
seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de
atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada.

4. Se preparó una placa control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad

del medio.

5. Después de que estuvo el medio completamente solidificado en la caja, se

vertió aproximadamente 4 mL del medio RVBA a 45±1 °C en la superficie del
medio inoculado. Se dejó solidificar.

54
6. Se invirtieron las placas y se colocaron en la incubadora a 35±2 °C, durante 24
horas.

7. Transcurrido el tiempo de incubación, se corroboró la ausencia del

microorganismo de interés con la ayuda de un contador de colonias.

55
8.5 Determinación del volumen de inóculo para la fortificación de la matriz

De acuerdo con la guía para la evaluación del desempeño de métodos de prueba

microbiológicos por la técnica del número más probable (CCAYAC-CR-01/1, 2016)
se deben usar dos niveles de inóculo:

 Muestra sin inocular: Verificación de la muestra

 Muestra inoculada con aproximadamente 1000 UFC/mL

Con los resultados obtenidos previamente de la cinética de crecimiento de

Escherichia coli ATCC 25922 se eligió el periodo de la fase estacionaria y se
estandarizó el volumen (tamaño de inóculo) a utilizar en la fortificación de la matriz
(muestra no contaminada). Para esto, se seleccionó una dilución de trabajo que
permitiera cumplir con las siguientes características:

 La dilución primaria 1:10 (25 g de muestra + 225 mL de diluyente) deberá

aproximarse a 1000 UFC/mL
 La dilución 10-1 entre 10 y 100 UFC/mL
 La dilución 10-2 entre 1 y 10 UFC/mL
 La dilución 10-3 entre 1 y 0 UFC/mL

Para esto, se calculó el volumen del inóculo, correspondiente al volumen de matriz

requerido de la siguiente manera:

En el estudio de cinética de crecimiento, se encontró que la disolución 10 -7 con 8

horas de incubación, tiene en promedio, 105 UFC/mL, por lo tanto tenemos que:
en la dilución 10-6 obtenemos 1050 UFC/mL y en la dilución 10-5 se hallan 10,500
UFC/mL

Entonces, se preparó la disolución de 25 gramos de queso en 211.2 mL de

diluyente y se inoculó con 23.8 mL de la dilución 10 -5 obteniendo así 1000 UFC/mL
en la dilución primaria.

56
8.6. Parámetros de desempeño

8.6.1. Repetibilidad

Se separaron 10 porciones de la muestra (dilución primaria) fortificada y se

procedió como se indica a continuación.

1. De las 10 alícuotas fortificadas, se prepararon diluciones decimales con

regulador de fosfatos (10-1-10-5), agregando 1 mL de la disolución en 9 mL de
diluyente, agitando la mezcla manualmente 25 veces en un arco de 30 cm por 7
segundos.

2. Se verificó el inóculo por sextuplicado, transfiriendo 1 mL de la fase estacionaria

(8 horas) de la dilución 10-7 a placas Petri, encontrando el promedio de 105 UFC
por mL que sirvieron como referencia para los cálculos posteriores.

3. Se transfirió 1 mL de cada dilución a 3 tubos con 10 mL de caldo lauril con

MUG. Posteriormente se incubaron los tubos con caldo lauril + MUG a 35 ± 0.5 ºC
durante 24 h.

4. Se calculó el NMP de E. coli basada en la confirmación de tubos en las 3

diluciones consecutivas mediante la formación de gas, turbidez y fluorescencia.

5. Se adicionó un tubo control positivo (E. coli ATCC 25922) y un tubo control
negativo (Staphylococcus aureus ATCC 25923) para facilitar la diferenciación
entre los tubos que presenten sólo crecimiento y crecimiento con fluorescencia.

6. Se prepararon placas controles, de la muestra matriz (estéril), de la solución

diluyente, del caldo de enriquecimiento BHI y del medio RVBA para verificar la
esterilidad en cada paso del desarrollo experimental.

Para los resultados de reproducibilidad se realizó el procedimiento anterior por el

mismo analista en días diferentes (CCAYAC-CR-01/1, 2016).

57
8.6.2 Reproducibilidad

Los datos para la reproducibilidad se basan en los resultados obtenidos de las

repeticiones realizadas por el analista, en las mismas condiciones, en la misma
matriz, en diferente tiempo.

8.6.3 incertidumbre

Utilizar la información obtenida en el proceso de evaluación de desempeño del

método para listar e identificar las fuentes de incertidumbre.

8.7 Análisis estadístico

Repetibilidad

Calcular el logaritmo del resultado de número más probable, obtenido en las tablas
correspondientes. Calcular en seguida el promedio que se expresa como la suma
de los logaritmos entre el número total de muestras:

∑ 𝑙𝑜𝑔
=
𝑛

Calcular la Desviación estándar 𝜎 para obtener el coeficiente de variación:

𝜎
𝐶. 𝑉 =
𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜

Utilizando los valores anteriores, considerar la aplicación de la siguiente fórmula:

𝑟 = 𝐶. 𝑉 ∗ 2.8

58
Reproducibilidad

Utilizando el método de referencia, al menos dos analistas en momentos

diferentes procederán como se describió antes, considerando la aplicación de la
siguiente fórmula:

𝑅 = 𝐶. 𝑉 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜𝑠 ∗ 2.8

Incertidumbre

Mencionar las fuentes de incertidumbre y calcular la incertidumbre combinada con

la siguiente fórmula:

𝑈¢ = √𝑆𝑅2 + 𝑆𝑟 2

Donde 𝑈¢: es la raíz de las varianzas totales de repetibilidad y reproducibilidad

59
8.8 Criterios de aceptación (métodos cualitativos)

Los criterios de aceptación propuestos por la guía de “criterios para la evaluación

del desempeño de métodos de prueba microbiológicos por la técnica del número
más probable” (CCAYAC-CR-01/1, 2016) se detallan a continuación:

Tabla 10. Criterios para la evaluación del desempeño (CCAYAC-CR-01/1, 2016).

Parámetro Criterios
Verificación del tamaño del inóculo Inocular cajas Petri por sextuplicado
para la asegurar la estandarización del
inóculo
Verificación de la muestra Verificar que la matriz se encuentre
libre de carga microbiana
Coeficiente de Variación No debe ser mayor a un 15%
Repetibilidad Número de repeticiones: 10
Número de analistas: uno
Resultado: r<32%
Reproducibilidad Número de repeticiones: 10 por analista
Número de analistas: dos
Resultado: R<32%
Incertidumbre a) Enlistar los factores de
incertidumbre en el método
b) Realizar cálculos para la
incertidumbre combinada

60
9. RESULTADOS

Tabla 11. Registro de los resultados de la determinación de la fase estacionaria

(PLAN DE ACTIVIDADES 1)

Validación del método: (CCAYAC-M-004/11) “Método de prueba para la

estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable
(NMP), detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli”.
Analista: Mónica Balcázar Fecha:
Nombre del microorganismo: Procedimiento usado en la FE:
Escherichia coli ATCC 35922 Cuenta en placa, CCAYAC-P-062
Temperatura y tiempo total de Caldo y Volumen de caldo usado:
incubación: 24 horas, 35±2 °C Infusión Cerebro Corazón, 45 mL
Horas Dilución Volumen CUENTA CUENTA Promedio Log de S
del del UFC/mL UFC/mL cuentas promedio
inóculo inóculo placa 1 placa 2 UFC/mL cuentas
en placa
0 10 -5 1 mL 63 68 66 6.82 ±3.54
2 10 -6 1 mL 57 49 53 7.72 ±5.66
4 10 -7 1 mL 91 89 90 8.95 ±1.41
6 10 -7 1 mL 103 104 104 9.01 ±0.71
8 10 -7 1 mL 100 97 99 8.99 ±2.12
10 10 -7 1 mL 98 98 98 8.99 ±0.00
12 10-7 1 mL 94 92 93 8.97 ±1.41
14 10 -7 1 mL 81 78 80 8.90 ±2.12
16 10 -7 1 mL 78 80 79 8.90 ±1.41
18 10 -7 1 mL 84 79 82 8.91 ±3.54
20 10 -7 1 mL 85 80 83 8.92 ±3.54
22 10 -7 1 mL 82 87 85 8.93 ±3.54
24 10 -7 1 mL 76 87 82 8.91 ±7.78

61
 1.20E+09
Crecimiento microbiano (UFC/mL)
1.00E+09

8.00E+08

6.00E+08

4.00E+08

2.00E+08

0.00E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)

62
Tabla 12. Registro de los resultados de la determinación de la fase estacionaria
(PLAN DE ACTIVIDADES 2)

Validación del método: (CCAYAC-M-004/11) “Método de prueba para la

estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable
(NMP), detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli”.
Analista: Mónica Balcázar Fecha:
Nombre del microorganismo: Procedimiento usado en la FE:
Escherichia coli ATCC 35922 Cuenta en placa, CCAYAC-P-062
Temperatura y tiempo total de Caldo y Volumen de caldo usado:
incubación: 24 horas, 35±2 °C Infusión Cerebro Corazón, 45 mL
Horas Dilución Volumen CUENTA CUENTA Promedio Log de S
del del UFC/mL UFC/mL cuentas promedio
inóculo inóculo placa 1 placa 2 UFC/mL cuentas
en placa
0 10 -5 1 mL 74x105 78x105 76x105 6.88 ±2.83
2 10 -6 1 mL 59x10 6 61x10 6 60x10 6 7.78 ±1.41
4 10 -7 1 mL 97x10 7 95x10 7 96x10 7 8.98 ±1.41
6 10 -7 1 mL 118x10 7 116x10 7 117x10 7 9.07 ±1.41
8 10 -7 1 mL 121x10 7 117x10 7 119x10 7 9.08 ±2.83
10 10 -7 1 mL 125x10 7 121x10 7 123x10 7 9.09 ±2.83
12 10 -7 1 mL 133x10 7 135x10 7 134x10 7 9.13 ±1.41
14 10 -7 1 mL 129x10 7 131x10 7 130x10 7 9.11 ±1.41
16 10 -7 1 mL 139x10 7 141x10 7 140x10 7 9.15 ±1.41
18 10-7 1 mL 134x107 128x107 131x107 9.12 ±4.24
20 10 -7 1 mL 122x10 7 126x10 7 124x10 7 9.09 ±2.83
22 10 -7 1 mL 128x10 7 131x10 7 130x10 7 9.11 ±2.12
24 10 -7 1 mL 117x10 7 121x10 7 119x10 7 9.08 ±2.83

63
 1.60E+09
Crecimiento microbiano (UFC/mL)
1.40E+09

1.20E+09

1.00E+09

8.00E+08

6.00E+08

4.00E+08

2.00E+08

0.00E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)

64
Tabla 13. Registro de los resultados de la determinación de la fase estacionaria
(PLAN DE ACTIVIDADES 3)

Validación del método: (CCAYAC-M-004/11) “Método de prueba para la

estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable
(NMP), detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli”.
Analista: Mónica Balcázar Fecha:
Nombre del microorganismo: Procedimiento usado en la FE:
Escherichia coli ATCC 35922 Cuenta en placa, CCAYAC-P-062
Temperatura y tiempo total de Caldo y Volumen de caldo usado:
incubación: 24 horas, 35±2 °C Infusión Cerebro Corazón, 45 mL
Horas Dilución Volumen CUENTA CUENTA Promedio Log de S
del del UFC/mL UFC/mL cuentas promedio
inóculo inóculo placa 1 placa 2 UFC/mL cuentas
en placa
0 10 -5 1 mL 101x105 98x105 100x105 7.00 ±2.12
2 10 -6 1 mL 89x10 6 93x10 6 91x10 6 7.96 ±2.83
4 10 -7 1 mL 106x10 7 109x10 7 108x10 7 9.03 ±2.12
6 10 -7 1 mL 110x10 7 113x10 7 112x10 7 9.05 ±2.12
8 10 -7 1 mL 108x10 7 110x10 7 109x10 7 9.04 ±1.41
10 10 -7 1 mL 106x10 7 107x10 7 107x10 7 9.03 ±0.71
12 10-7 1 mL 109x107 112x107 111x107 9.04 ±2.12
14 10 -7 1 mL 104x10 7 99x10 7 102x10 7 9.01 ±3.54
16 10 -7 1 mL 97x10 7 96x10 7 97x10 7 8.98 ±0.71
18 10-7 1 mL 97x107 89x107 93x107 8.97 ±5.66
20 10 -7 1 mL 85x10 7 87x10 7 86x10 7 8.93 ±1.41
22 10 -7 1 mL 85x10 7 86x10 7 86x10 7 8.93 ±0.71
24 10-7 1 mL 86x107 83x107 85x107 8.93 ±2.12

65
Crecimiento microbiano (UFC/mL) 1.40E+09

1.20E+09

1.00E+09

8.00E+08

6.00E+08

4.00E+08

2.00E+08

0.00E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (h)

66
Resultados de NMP/g de muestra, los resultados de NMP se tomaron de las tablas
correspondientes proporcionadas por el documento (CCAYAC-M-004/11)

Número de NMP NMP NMP NMP NMP

Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución
repeticiones
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
1 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3
2 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3
3 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3
4 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3
5 3/3 3/3 2/3 1/3 0/3
6 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3
7 3/3 3/3 2/3 1/3 0/3
8 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3
9 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3
10 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3

Número de Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución

repeticiones 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
1 3/3 3/3 2/3 1/3 0/3

2 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3

3 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3

4 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3

5 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3

6 3/3 3/3 2/3 1/3 0/3

7 3/3 3/3 2/3 1/3 0/3

8 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3

9 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3

10 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3

67
 a) Resultados de repetibilidad

Coeficiente
Repetición Resultado Logaritmo Promedio Desviación Varianza
de
NMP del NMP estándar Variación
%
1 2100 3.3222
2 930 2.9684

3 930 2.9684

4 930 2.9684
5 1500 3.1760
3.0806 0.1529 0.0233 4.9633
6 930 2.9684

7 1500 3.1760

8 930 2.9684

9 2100 3.3222

10 930 2.9684

68
 Coeficiente
Repetición Resultado Logaritmo Promedio Desviación Varianza
de
NMP del NMP estándar Variación
%
1 1500 3.1760
2 930 2.9684

3 930 2.9684

4 930 2.9684
5 930 2.9684
3.0660 0.1329 0.0176 4.3346
6 1500 3.1760

7 1500 3.1760

8 930 2.9684

9 930 2.9684

10 2100 3.3222

Repetibilidad= C.V. x 2.8

1.- r= 13.89%

2.- r= 12.13%

69
 b) Resultados de reproducibilidad

Coeficiente
Desviación Promedio de variación
Analista Promedio Varianza de
estándar de de
promedios
promedios promedios %
A
3.0306
B 0.0249 0.0006 3.0483 0.8168
3.0660

Reproducibilidad= C.V. de promedios x 2.8

R= 2.28%

c) Incertidumbre
Fuentes de incertidumbre:

Preparación de la muestra Personal operativo Mediciones (pesada

o medición de muestra)
Homogeneización
Tamaño de la muestra Personal operativo Diluciones y
volúmenes Homogeneización
Diluciones adicionales Diluciones y volúmenes
Homogeneización
Incubación Tiempo hasta la incubación
Temperatura de incubación
Conteo de colonias Personal operativo
Calidad de los medios

70
 d) Incertidumbre combinada

Varianzas totales de Promedio de varianzas de

repetibilidad repetibilidad
0.0233 0.0176

0.0205
Varianza de
reproducibilidad
0.0006

𝑈¢ = √𝑆𝑅2 + 𝑆𝑟 2

U¢ = 0.0205

71
10. CONCLUSIONES

1. Los resultados obtenidos en el proceso de validación propuesto por la

COFEPRIS a través del documento “MÉTODO DE PRUEBA (CCAYAC-M-004/11)
PARA LA ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA TÉCNICA DEL
NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP), DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES,
COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli, para la repetibilidad y
reproducibilidad cumplen con los criterios de aceptación correspondientes.

2. Se logró validar el método (CCAYAC-M-004/11) bajo las condiciones de trabajo

empleadas en las instalaciones del laboratorio IQUISSA.

3. Se determinó la incertidumbre de la medición, los certificados analíticos futuros

del centro de trabajo, serán completos porque además de informar el valor
promedio del analito se podrá indicar su incertidumbre.

72
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Ashbolt, N.J., W.O.K. Grabow and M. Snozzi (2001). Indicators of microbial

water quality. In Fewtrell, L. and Bartram, J. (ed.), Water Quality: Guidelines,
Standards and Health. Risk assessment and management for water-related
infectious disease. IWA Publishing, London.
 Dux, J.P. (1986) Handbook of Quality Assurance for the Analytical Chemistry
Laboratory, Van Nostrand Reinhold Co., New York, NY
 Frederick M. Garfield, Eugene Klesta, Jerry Hirsch. (2000). Quality Assurance
Principles for Analytical Laboratories. Gaithersburg, Maryland, USA: AOAC
International.
 Holcombe, H. (1998). The fitness for purpose of analytical methods. A
Laboratory guide to method validation and related topics. EURACHEM Guide. 1-
54.
 ISO/IEC-17025:2005 “Requisitos generales para la competencias de
laboratorios de ensayo y calibración” *actualizada
 Raúl Romero Cabello. (1999). Microbiología y parasitología humana. México:
Médica Panamericana.
 McCully, K.A., Lee J. G. (1980) Optimizing Chemical Laboratory Performance
Trough the Application of Quality Assurance Principles, F.M. Garfield et al.
(Eds), Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, p. 73
 NMX-CC-9001-IMNC-2001 Sistemas de gestión de la calidad - Requisitos
 NMX-EC-17025-IMNC-2000 Requisitos generales para la competencia de los
laboratorios de ensayo y de calibración

73
ANEXOS

a) Determinación del tamaño del inóculo (fase estacionaria)

Hora Dilución Placa 1 Placa 2

6 10-7

8 10-7

10 10-7

b) Verificación del inóculo

74
 Placa 1 Placa 2

Placa 3 Placa 4

Placa 5 Placa 6

c) Pruebas bioquímicas
75
Producción de Indol Rojo de metilo

Voges Proskauer Citrato de Simmons

76