PRÁCTICA 5
EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA in silico
OBJETIVO
Encontrar las condiciones óptimas de pH y temperatura de la actividad enzimática
mediante ensayos in silico.
INTRODUCCIÓN
La enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC) hidroliza el enlace glucosídico del
sustrato utilizado para la simulación in silico, la hesperidina (Figura 1), un glucósido
natural formado por la unión de rutinosa 3.2.1.168con hesperetina. La rutinosa
que se libera es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa y tiene carácter reductor
(en el C1 de la glucosa).
Figura 1. Reacción catalizada por hesperidina 6-O-alfa-L-ramnosil-beta-D-
glucosidasa (3.2.1.168). Fuente: Base de datos BRENDA (2020).
La hesperidina se produce en limones y naranjas en altas concentraciones y
contribuye a la turbidez del jugo. La hidrólisis enzimática a través de la diglicosidasa
es útil para eliminar el sabor desagradable o para clarificar el jugo, una
desglicosilación (hidrólisis y transglicosilación) en un solo paso (Piñuel, 2011).
Además, la actividad hidrolítica y transglucosídica de la alfa-ramnosil-beta-
glucosidasa tienen un uso potencial para el procesamiento industrial de alimentos
de origen vegetal y los productos de transglucosilación podrían desempeñar un
papel como materiales de partida para el desarrollo de nuevos fármacos. La
inmovilización permite el control cinético del proceso (Mazzaferro, 2011). Para su
aplicación en procesos industriales es necesario investigar cómo afectan la
actividad de la enzima factores como el pH y la temperatura.
En esta actividad se aplica un ensayo in silico para detectar azúcares reductores
como la rutinosa. En esta simulación, la rutinosa se hará reaccionar con el
dinitrosalicilato (DNS). Este compuesto es de color amarillo en medio básico, se
reduce a 3-amino-5-nitrosalicitao, de color rojo ladrillo. Esto es porque el aldehído
del azúcar reductor (rutinosa) se oxida a ácido. Entonces es posible medir el color
rojo del producto por espectrofotometría a 540 nm (Random Experiments, 2017).
Figura 2. Reacción del DNS con el aldehído del azúcar reductor que se oxida a
ácido. Fuente: Herráez (2018).
Figura 3. El DNS es amarillo en medio básico y después de reaccionar con el
azúcar reductor produce un compuesto de color rojo ladrillo en su estado
reducido. Fuente: Herráez (2018).
PROCEDIMIENTO
Ingresar al simulador en http://biomodel.uah.es/lab/abs/activ_enz.htm#. La figura 4
muestra el área de ensayo.
Figura 4. Área de experimentación in silico para la actividad enzimática. Fuente:
Herráez (2018).
Pasos:
1. Desplazar los controles para elegir un pH y una temperatura para el ensayo.
2. Ir pulsando, en orden, los botones para añadir los componentes de la
reacción a la cubeta del ensayo.
3. El botón “añadir sustrato” vaciará antes la cubeta. El botón “añadir muestra”
iniciará la incubación.
4. El botón “añadir DNS” reaccionará desarrollando el color.
5. Pulsar en el espectrofotómetro el botón para medir la absorbancia y anota su
valor.
6. Modifica de forma sistemática el pH de 3 a 11 con incrementos de 2 y la
temperatura de 40 a 80 °C con incrementos de 10.
7. Anota cada valor de absorbancia en tu cuaderno de trabajo o en un archivo
de Excel como lo muestra el simulador o las Tabla 1 y 2 para poder obtener
las gráficas.
Tabla 1. Valores de absorbancia de actividad enzimática a diferentes valores de
pH a temperatura constante de la enzima hesperidina 6-O-alfa-L-ramnosil-beta-
D-glucosidasa.
Temperatura de incubación
pH 40 °C 50 °C 60 °C 70 °C 80 °C
3
5
7
9
11
Tabla 2. Valores de absorbancia de actividad enzimática a diferentes valores de
Temperatura a pH constante de la enzima hesperidina 6-O-alfa-L-ramnosil-beta-
D-glucosidasa.
pH
T °C 3 5 7 9 11
40
50
60
70
80
RESULTADOS
Generar las gráficas en un programa tipo Excel. Graficar pH vs actividad enzimática
a temperatura constante y hacer otras gráficas de las temperaturas vs actividad
enzimática (valores de absorbancia) a pH constante. Describir lo que significa la
forma que toman las gráficas contestando las preguntas ¿cómo se afecta la
actividad de la enzima en función del pH? ¿Cómo se afecta la actividad de la enzima
al variar la temperatura? Observando las gráficas, identificar cuáles serían los
valores óptimos de pH y temperatura donde se observa mayor actividad de esta
enzima y comentar en la descripción de los resultados.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRENDA EC 3.2.1.168. (2020). Information on EC 3.2.1.168 - hesperidin 6-O-alpha-
L-rhamnosyl-beta-D-glucosidase. Consultado en https://www.brenda-
enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.2.1.168#REACTION
Herráez, A. (2018). Ensayo de actividad enzimática. Biomodel. Consultado en
http://biomodel.uah.es/lab/abs/activ_enz.htm#
Mazzaferro, L. S., & Breccia, J. D. (2011). Functional and biotechnological insights
into diglycosidases. Biocatalysis and Biotransformation, 29(4), 103-112.
Piñuel, L., Mazzaferro, L. S., & Breccia, J. D. (2011). Operational stabilization of
fungal α-rhamnosyl-β-glucosidase by immobilization on chitosan
composites. Process Biochemistry, 46(12), 2330-2335.
Random Exériments. (2017). Testing for reducing compounds with 3,5-DNSA.
[video] Available at: https://www.youtube.com/watch?v=dnyX_EVnUcM.
[Accessed 09 Jul. 2020].
