Universidad Católica Santa María
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
FACULTAD DE OBSTETRICIA Y PUERICULTURA
CURSO : BIOQUIMICA PRÁCTICAS
DOCENTE: Jeaneth Marisol Medina Pérez
Participantes:
Yuliana Luz Taco Vásquez
Milevy Mariel Merlie
Huancapaza CarcaustoAngela
Daniela Maquito Velarde
Brigit Anny Ramos Soto
Yanira Apaza Chambilla
Arequipa-Perú
2022
PRACTICA Nº 8
Extraccion De Adn E Identificacion De Sus
Componentes
RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Extracción y purificación del DNA de un tejido animal
2. Identificación de desoxirribosa: Reacción de Dishe
3. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico
INTRODUCCION
Los ácidos nucleicos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada nucleótido, el
cual está constituido por:
a. - Una pentosa : ribosa o desoxirribosa
b. - Una base nitrogenada : púrica o pirimidínica
c. - Ácido fosfórico (Ácido ortofosfórico)
La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleósido. Finalmente, la
unión éster de un nucleósido con ácido fosfórico se conoce como nucleótido.
El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA esta
formado por dos cadenas polinucleotídicas, enrrolladas en espiral a lo largo de un eje común. Las
dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto azúcar fosfato de cada
una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hélice y las bases nitrogenadas
están en el interior. Las dos cadenas están unidas por puentes de hidrógeno establecidos entre las
bases, se constituyen dos puentes de hidrógeno entre los pares A-T y tres puentes de hidrógeno
entre los pares G-C.
La adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina. Los
puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos, obteniéndose un DNA
desnaturalizado.
El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar aprovechando su propiedad de
absorber luz a la longitud de onda de 260 nm.
Figura Nº 7.1. Estructura helicoidal del ADN
3.4 nm
( 10 pb )
OH
3’
5’ O-
- O–P =O
O O CH2
H 2C T A O
O
O = P - O-
O
O
-O–P=O O
CH2
O G C
H2C O
O
O = P - O-
O
O
- O–P=O O
CH2
O A T
H 2C O
O -
O=P-O 5’
3’ O-
OH
Figura Nº 7.2. Modelo de la molécula de ADN según Watson y Crick
OBJETIVOS
1. Obtención del DNA usando como fuente, timo de ternera
2. Identificación del componente desoxirribosa del DNA : Reacción de Dische
3. Desnaturalización del DNA: Observación del efecto hipercrómico
Procedimiento
1. Aislamiento del DNA
a) Homogenizar 2 g de timo de ternera en una licuadora en 25 ml de una solución salina
0,15 M más EDTA 0,1 M pH 8
b) Transferir el homogenizado anterior a una probeta de 100 ml y añadir 2 ml de
detergente aniónico (Lauril Sulfato al 25%, mezclar)
c) Colocar en baño maría a 60 oC durante 10 min.
d) Añadir 6,3 ml de NaCl 5 M; mezclar.
e) Añadir solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24 :1 v/v) en un volumen igual al
obtenido en la etapa anterior; aproximadamente 30 ml, agitar vigorosamente
f) Centrifugar a 10 000 rpm. por 15 minutos.
g) Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar que el DNA se desnaturalice y
colocarlo en una probeta de 100 ml. Agregar dos volúmenes de alcohol etílico al 95%. El
alcohol debe añadirse lentamente, mientras que con una varilla de vidrio se trata de
enrollar el DNA.
h) Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado en un tubo de prueba y disolverlo en 20
ml de solución salina citrato (0,015 - 0,0015 M). Dejar en reposo 30 min.
i) Añadir 2 ml de solución acetato de sodio 3 M a pH 7 la cual contiene 0,001 M de EDTA.
j) Mezclar con una varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota 9,5volúmenes
de isopropanol para precipitar selectivamente al DNA. Seguir mezclando con la varilla
de vidrio tratando de enrollar el DNA.
k) Disolver el DNA obtenido en 20 ml. de solución salina citrato.
1. Identificación de Desoxirribosa: Reacción de Dische
Fundamento:
Desoxirribosa reacciona en presencia de ácido acético y sulfúrico con difenilamina (DPA),
dando como resultado un color azul.
Se ha conseguido mayor sensibilidad adicionando a la reacción ácido perclórico y
acetaldehído y dejando que desarrolle el color por 17 horas a 30 ºC. El color azul producido por el
ADN, sólo mide los azúcares enlazados a purinas, ya que el reactivo DPA reacciona solamente con
las moléculas de desoxirribosa unidas a purinas.
Según Stacey y col., se ha identificado al intermediario responsable del desarrollo del color
azul, el cual corresponde a un compuesto llamado: Hidroxilevulínico aldehído.
H3C – CO – CH CH2 – COOH HOH2C – CO – CH CH2 – CHO
Ac. Levulínico OH levulínico aldehido
En cambio, las desoxirribosas enlazadas a pirimidinas pueden ser detectadas por el reactivo
Carbazol. Pruebas con varios tejidos usando los reactivos DPA y Carbazol, han mostrado que la
cantidad de ADN es la misma, sin considerar cual reacción se empleó para la determinación.Esto
indica por supuesto que el ADN de estos tejidos contienen iguales proporciones de nucleótidos
púricos y primidínicos, puesto que del apareamiento de bases según Watson-Crick,se asume que la
suma de A + G = T + C .
Procedimiento:
a) Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera:
X (Solución de DNA obtenido en la práctica) y C (Control)
b) En cada tubo medir lo siguiente:
C X
Solución de ADN obtenido ------ 2.0 ml.
-
Agua destilada 2.0 ml. ------
-
Reactivo difenilamina en 4.0 ml 4.0 ml.
solución ácida
c) Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.
d) Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de desoxirribosa se
revela por la aparición de un color azul
1. Identificación de fosfato.
Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato, luego se
identificará éste mediante una reacción de coloración.
a) Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la manera siguiente:
X (solución de DNA obtenida en la práctica) C (control)
b) Luego medir lo siguiente:
X C
Solución de DNA obtenida en la práctica 0.5 ml ----
-
Solución salina citrato ---- 0.5 ml
-
Acido perclórico 7.5 N 0.5 ml 0.5 ml
c) Colocar en cada tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio. Luego colocarlo en
baño hirviente durante 30 minutos.
d) Enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente manera:
C X
Contenido del tubo X después de la hidrólisis ácida. ---- 0.5 ml.
-
Contenido del tubo C después de la hidrólisis ácida. 0.5 ml. ----
-
Agua destilada 3.5 ml. 3.5 ml.
Molibdato de amonio al 2.5 % 0.5 ml. 0.5 ml.
Reactivo Reductor (ácido amino reductor naptol 0.5 ml. 0.5 ml.
sulfónico
e) Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo durante 5 minutos. Observar la
presencia de fosfato inorgánico que se manifiesta por la aparición de un color azul.
4. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico.
Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la constante dieléctrica
del medio, pH extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos como la urea y la formamida
pueden debilitar las fuerzas que unen las dos cadenas complementarias del ADN y rompen los
puentes de hidrógeno lo que origina que las dos cadenas se desenrollen y se separen, proceso
conocido como desnaturalización del DNA. En estas condiciones las bases nitrogenadas quedan
más expuestas que en su estado nativo y tienden a absorber mayor luz a
260nm, hecho que se conoce con el nombre de efecto hipercrómico. Cuando la temperatura
desnaturaliza el 50 % del ADN esta se le conoce como Tm o Temperatura de Fusión; esta es mayor
o menor según la proporción de pares de bases G, C o A,T respectivamente.
Calor Calor
DNA Nativo DNA Desnaturalizado
Figura Nº 7.3.- Esquema que explica el proceso de desnaturalización del DNA
Procedimiento.
a) Medir en un tubo 5 ml de la solución del DNA obtenida en la práctica. Colocar el tubo en
baño hirviente durante 15 min., enfriar.
b) Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm.
c) Si la solución del DNA es muy concentrada, diluirla con solución salina citrato y
determinar nuevamente la absorbancia, hasta que ésta arroje una absorbancia entre
0.5 y 1.0 .
d) Medir la absorbancia a varias longitudes de onda entre 230 y 320 nm.
e) Hacer lo propio con la solución de DNA nativo obtenida en la práctica
f) Comparar la absorbancia obtenida, con ambas soluciones de DNA.
Expresión de Resultados.
Realizando los mismos pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a la presente,
se obtuvieron los resultados que a continuación se muestran en el presente cuadro
Longitud de onda en Absorbancia del ADN Absorbancia del ADN
nm. Nativo desnaturalizado
320 0.00 0.020
5
310 0.019 0.026
300 0.025 0.038
290 0.062 0.125
280 0.135 0.33
5
270 0.205 0.520
260 0.283 0.650
250 0.235 0.600
240 0.175 0.420
230 0.140 0.35
0
En el siguiente espacio coloque el gráfico obtenido con los resultados anteriores, colocando en el eje
de las ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de abscisas las LONGITUDES DE ONDA tanto para el
DNA nativo como para el desnaturalizado en el mismo gráfico.
I NTERROGANTES
1. Que otros tejidos podrían ser utilizados para aislar DNA en la presente práctica.
Realmente el ADN se puede extraer de diferentes tejidos del ser humano, pero el que sería más
efectivo seria el tejido linfático.
2. Porqué razón se usan 6,3 ml de NaCl 5 M en una de las etapas de extracción del DNA
Para la precipitación de proteínas , el NaCl 5 M disminuirá la solubilidad de las proteínas y
formara un precipitado , a este fenómenos se le conoce como salting out
3. Si luego de la extracción del DNA realizada en la práctica al leer la absorbancia a 260 nm se
obtiene una lectura de 1,25 D.O. y al calentarla durante un tiempo considerable, en baño
hirviente la lectura es de 1,26 D.O. Que explicación daría Ud.
Se produce un efecto conocido como hipercrómico , pues se calienta durante un tiempo
considerable se provocando la desnaturalización del DNA, causando así el desenrollamiento de
las dos hebras, por lo que bases se encuentran más expuestas en su forma nativa, razón por la
cual existe una mayor absorbancia de luz.
4. Qué bases se encuentran comúnmente formando la molécula del DNA y RNA
5. Qué bases no comunes se encuentran también en las moléculas de los ácidos nucleicos y
particularmente cuál ?
• En el RNA transferente (RNAt) se encuentran a menudo bases como la N2-dimetilguanina,
la hipoxantina o el dihidroxiuracilo.
• En el DNA se puede encontrar 5-metilcitosina o 5-hidroximetilcitosina.
6. ¿Qué importancia cree Ud. que tiene el hecho de que en el DNA las bases queden en el
interior de la doble hélice?
Porque así se mantienen las dos hebras unidas a través de los puentes de hidrogeno y no se
rompen , por otra parte porque estas bases nitrogenadas son las que almacenan información
genética para la formación de codones en el código genético .
7. ¿Qué tipos de RNA conoce Ud. donde se encuentran localizados en la célula?
ARN RIBOSÓMICO (ARNr): Se encuentran en el ribosoma y son las más abundantes
Estructura: Formado por una sola cadena de nucleótidos, pero existe zonas en la cual puede
ocurrir un plegamiento en la cual va a formar una doble hélice en el interior de la cadena.
ARN MENSAJERO (ARNm): Se produce en el núcleo de la célula hacia el citoplasma.
Estructura: Cadena lineal de una sola hebra, que consta de tripletes de nucleótidos llamados
codones. puede formar horquillas en determinados tramos cuyas bases son complementarias.
ARN NUCLEOLAR (ARNn): Se encuentra unido a varias proteínas formando el nucleolo.
ARN DE TRANSFERENCIA (ARNt): Se encuentra disuelto en el citoplasma celular transporta y
adapta los aminoácidos durante la síntesis de proteínas.
Estructura: Parece un trébol con dos sectores, el N°1 sector es donde el ARN tiene su
aminoácido y el otro donde el ARN va a reconocer al ARNm (cada ARNt tiene un aminoácido).
8. ¿Cuáles son las funciones de los diferentes tipos de RNA?
ARN RIBOSÓMICO (ARNr): Su función principal es formar los ribosomas (diferente entre una
célula eucariota y procariota)
ARN MENSAJERO (ARNm): Es el de realizar el proceso de transcripción, en la que se traslada
la información genética del ADN a los ribosomas, para la síntesis de proteínas.
ARN NUCLEOLAR (ARNn): Llevar la información sobre la secuencia de aminoácidos de la
proteína desde el ADN, lugar en que está inscrita, hasta el ribosoma, lugar en que se sintetizan
las proteínas de la célula. Es una molécula intermediaria entre el ADN y la proteína.
ARN DE TRANSFERENCIA (ARNt): Es el de transportar aminoácidos específicos hasta los
ribosomas para conseguir completar ese proceso de traducción (de ARNm a aminoácidos que se
unen para formar proteínas) de que hablábamos anteriormente. sirve como vínculo (o
adaptador) entre la molécula de ARN mensajero (ARNm)y la cadena creciente de aminoácidos
que forman una proteína.
9. ¿Cuál es el fundamento de la reacción del DISCHE?
ADN reacciona con el ácido sulfúrico para así poder producir aldehído hidroxilevulinico
o 4- hidroxipental.
10. Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNAasa II
Se usó un agente quelante, ácido nitrilotriacético (NTA), éste tiende a tener una alta
afinidad por los iones, es decir que los atrapa desde el medio para evitar la activación
de la DNAasa II. Como se sabemos, si las DNAasas no se logran unir con estos iones
metálicos (magnesio) debido a que, éstos van a ser atrapados por agentes quelantes, las
DNAasa no activarán, por lo que tampoco cumplirán con su función de degradación
de DNA.
