TEMA 4: PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS. AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS.
DETERMINACIÓN DE CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DE LAS PROTEÍNAS.
Las proteínas se purifican para saber la secuencia de aa, para saber las relaciones evolutivas
(árboles filogenéticos, determinar las diferencias de las secuencias de los diferentes seres
vivos), funciones bioquímicas y para estudiar su estructura.
La separación y la purificación de las proteínas se basa en: solubilidad, tamaño, carga eléctrica,
densidad y afinidad por otras moléculas.
Primero se tiene que homogeneizar la muestra: en hielo para evitar la alteración de las
proteínas por el cambio de tª.
centrifugación: método de separación de orgánulos citosólicos. Es un procedimiento
de fraccionamiento celular, que rompe la membrana celular, pero respeta la integridad
de los orgánulos. La centrifugación es un método basado en la separación de los
componentes sometidos a un campo centrífugo. Estos componentes se acabarán
separando en función del tiempo sometido y la velocidad de giro (medida en unidades
de g). Las sustancias irán sedimentando en función de estos parámetros.
****si tras la centrifugación, centrifugamos de nuevo el
sobrenadante, obtendremos en el pellet, mitocondrias,
etc…
Si lo volvemos a centrifugar vemos en el pellet pequeñas
vesículas y así.
Hay dos tipos de centrifugación: DIFERENCIAL Y ZONAL O EN GRADIENTE.
-DIFERENCIAL: separa en diferentes fracciones a causa del diferente tamaño. Cuanto más
pequeño es el componente, mayor es la velocidad de sedimentación.
-ZONAL O EN GRADIENTE: separa en función de la densidad de las partículas. En esta
centrifugación se llena un tubo de centrífuga con una disolución, cuya densidad aumenta
desde la superficie hasta el fondo, para producir este gradiente se produce un soluto tal como
la sacarosa a diferentes concentraciones. Cuando se deposita una mezcla de orgánulos sobre
este gradiente de densidad y se centrifuga el tubo a alta velocidad, los orgánulos individuales
sedimentan hasta que su densidad se corresponde exactamente con la del gradiente, se puede
recoger cada capa por separado.
Los gradientes más usados en bioquímica suele ser: purificación de orgánulos en gradiente de
sacarosa.
Precipitación fraccionada de proteínas: a mayor ph los grupos polares están
desprotonados, tienen las cargas solubles hacia el exterior. La proteína es soluble.
A menor ph, la concentración de protones es muy alta, por lo que los grupos polares
están protonados, tienen carga positiva por fuera, son más solubles.
Cuando el ph=7, hay atracción entre las proteínas.
*satting-in: si el h2o tiene un poco de sal se sabe que las proteínas son más solubles.
*satting-out: si hay una gran cantidad de sal, las proteínas precipitan (precipitación por
salado)
Diálisis: procedimiento que separa las proteínas de los disolventes aprovechando el
mayor tamaño de las proteínas. El extracto parcialmente purificado se coloca en un
saco o tubo de membrana semipermeable. Cuando este se suspende en un volumen
mayor de solución tamponada de fuerza iónica apropiada, la membrana permite el
intercambio de sal y tampón, pero no de proteínas. De esta forma la diálisis retine las
proteínas grandes dentro del saco o tubo, mientras permite que la concentración de
los demás solutos en la preparación de proteínas cambia hasta llegar al equilibrio con
la solución del exterior de la membrana.
Cromatografías: según la causa por la que se separan los componentes de la muestra
(relacionado con las propiedades físicas de las biomoléculas): SOLUBILIDAD
(cromatografía de reparto), POLARIDAD (cromatografía de adsorción), CARGA (de
intercambio iónico), TAMAÑO (de exclusión molecular) y ESPECIFIFICIDAD BIOLÓGICA
(de afinidad).
Según la metodología utilizada para el desarrollo de la cromatografía (relacionado con
la fase estacionaria): FASE ESTACIONARIA (placa fina, o de columna), FASE MÓVIL
(líquido: cromatografía de líquidos, gas: cromatografía de gases).
*cromatografía en capa fina: rf= es característico para cada soluto para una
composición dada de fase móvil y
un determinado tipo de
superficie.
*cromatografía de intercambio iónico: normalmente es solo aplicada al intercambio
catiónico (carboximetil celulosa). En la cromatografía de intercambio catiónico, la matriz sólida
tiene grupos cargado negativamente. En la fase móvil, las proteínas con carga positiva neta
migran más lentamente a través de la fase estacionaria que aquellas con carga negativa neta,
puesto que las primeras interaccionan con la matriz sólida. La resolución entre los dos tipos de
proteínas con diferente carga neta suele mejorar a medida que se aumenta la longitud de la
columna. La separación puede optimizarse cambiando gradualmente el ph y/o la
concentración de sal de la fase móvil de forma que se cree un gradiente de ph o sal.
DEAE-celulosa: intercambio aniónico, intercambia cargas negativas. Resina de intercambio
catiónico (carga -, interxcambian [Link]: prot. +) o de intercambio aniónico (carga +,
intercambian aniones. Ej: prot. Carga -). INTERCAMBIADOR ANIÓNICO: DEAE-Celulosa,
INTERCAMBIADO CATIÓNICO: Celulosa-CM.
*cromatografía de filtración o exclusión: importante es el tamaño, peso molecular y
su forma espacial. Primero se rellena la columna con sephadex (solución salina o agua).
Después las que tengan un tamaño mayor que el poro del sephadex caerá. Luegoo, las de
tamos menor o igual que el sephadex irán entrando en este. Por eso van cayendo en sentido
descendiente de tamaño. Lo importante del sephadex es que no reacciona con las proteínas
que queremos separar. Sirve como técnica para averiguar el PM de proteínas que no
conocemos.
*cromatografía de afinidad: se separan las proteínas según su especificidad de unión. Las
proteínas retenidas en la columna son las que se unen específicamente a un ligando unido
covalentemente a las partículas. Una vez que se han lavado las proteínas que no se unen a
través de la columna, la proteína unida de interés se eluye por medio de una solución que
contiene ligando libre. (Por ejemplo: si la proteína es un Ac, el ligando anclado a la fase
estacionaria puede ser un determinado AG). Esta cromatografía es la más idónea porque
reduce el número de etapas y se obtiene la proteína con gran fuerza y alto rendimiento.
Control de calidad del fraccionamiento: centrifugación en gradiente para saber si está
purificada. Se miden las actividades enzimáticas de las enzimas marcadas. Se utilizan
enzimas específicas para identificar los orgánulos.
*electroforesis: estudia la migración de las partículas sometidas a un campo eléctrico. Separa
los diferentes elementos que componen una mezcla compleja en función de la carga eléctrica
de los mismos. Para ello se someten a las proteínas a un campo eléctrico, y se separarán según
su carga. La velocidad con la que se desplazan las partículas depende: carga de las partículas, la
intensidad del campo eléctrico y del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio.
-FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS:
1. Campo eléctrico: diferencia de potencial (V-voltios), intensidad (A-amperios),
Suelen ser resisitencia (R) determinada por el soporte y tampón de electroforesis, y la
ligeramente básicos, temperatura.
las proteínas están 2. Muestra: carga o densidad de carga (carga eléctrica/masa de la molécula),
cargadas – y van tamaño y forma (las formas globulares avanzan más).
hacia el polo +. 3. Tampón de electroforesis: ph (determina el grado de solvatación y la carga de
las moléculas generalmente es ligeramente básico -> moléculas -) y fuerza
iónica (generalmente 0.05 o 0.1M para que no interfiera)
4. Soporte : papel, acetato de celulosa o gel (almidón, poliacrilamida o agar para
el ADN)
Hay dos tipos de electroforesis
Libre: moléculas en disolución o suspensión, poco resolutiva.
De zona: soporte que retiene a las moléculas, elevado poder de resolución. Es un gel.
SDS: Este gel retrasa el desplazamiento de la proteína de una aproximadamente proporcional a
su cociente carga/masa. Se suelen utilizar colorantes como el azul de coomasie, que se fija a
las proteínas pero no al gel, para poder visualizarlas. Se suele utilizar para la estimación de la
pureza y la masa molecular. El SDS se une a la mayoría de las proteínas en una cantidad
aproximadamente proporcional a la masa Molecular de la proteína alrededor de una molécula
por cada dos aa. La electroforesis en presencia de SDS separa a las proteínas casi
exclusivamente en función de la masa molecular, de forma que los polipéptidos más pequeños
se desplazan más rápidamente.
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida, en condiciones desnaturalizantes. Las
proteínas cargadas con el gel PAGE-SDS (poliacrilamida + SDS) incorporan una carga neta
negativa que hace que migren hacia el polo positivo. Se introduce un reductor (β-
mercaptoetanol) para que se rompan los puentes disulfuro y obtener sus unidades. El SDS
rodea a las proteínas y las carga negativamente, de manera que sometidas a un campo
eléctrico éstas se separan en función de su peso molecular.
****bisacrilamida: lleva acrilamida y bisacrilamida. Es otro tipo de soporte que nos permite
hacer geles con poros más pequeños o más grandes.
RESULTADO FINAL:
SE TRASFIEREN LAS PROTEÍNAS DEL GEL A UN PAPEL RESISTENTE. LUEGO SE TRATAN CON UN
ANTICUERPO (WESTERN BLOT). El WESTERN BLOT es una técnica inmunológica que consiste en
la interacción proteína proteína (Ag-Ac). Consiste en detectar en una mezcla una proteína
concreta mediante el uso de anticuerpos específicos (muy sensible). Estos anticuerpos pueden
ser mono o policlonales.
