1. Compuestos que dan color a los vegetales.

Clorofila: Existen cinco categorías fundamentales de pigmentos fotosintéticos: a, b, c y d de

clorofila, además de una molécula afín hallada en procariontes conocida como bacterioclorofila.
En organismos vegetales, la clorofila a y la clorofila b representan los pigmentos fotosintéticos
preponderantes. Dichas moléculas captan longitudes de onda de color azul y rojo.

Carotenoides: Los carotenoides constituyen otro conjunto

fundamental de pigmentos que captan la luz violeta y azul
verdosa. En el proceso de fotosíntesis, los carotenoides
colaboran en la absorción de la luz, además de cumplir un rol
crucial en la disipación del exceso de energía lumínica. Estos
pigmentos en los cloroplastos contribuyen a absorber la
energía excedente y a transformarla en calor.

Antocianinas: son pigmentos rojos, morados y azules

localizados en vacuolas; dan color a flores, frutos y hojas;
además son los responsables en la coloración otoñal de las
hojas en muchos árboles.

2. Propiedades físicas, químicas y tóxicas de los pigmentos que se van a

extraer y de los disolventes empleados.
Clorofila:

Propiedades físicas:

 Color: La clorofila es un pigmento verde oscuro.

 Solubilidad: Es insoluble en agua, pero es soluble en solventes orgánicos como el
alcohol, éter, cloroformo y acetona.
 Peso molecular: Alrededor de 893.49 g/mol para la clorofila a y 907.43 g/mol para la
clorofila b.
 Punto de fusión y ebullición: No tiene un punto de fusión o ebullición específico ya
que se descompone antes de alcanzar estos estados.

Propiedades químicas:

 Composición química: La clorofila es una molécula compleja compuesta

principalmente por un anillo porfirínico con un átomo central de magnesio.
 Función biológica: Es esencial en la fotosíntesis para absorber la energía de la luz y
convertirla en energía química en forma de glucosa.
 Sensibilidad a pH: La clorofila es más estable en pH alcalino y se descompone en
medios ácidos.

Toxicidad: La clorofila no es tóxica para los seres humanos y es segura para el consumo en
las cantidades presentes en los alimentos.
Carotenoides:

Propiedades físicas:

 Variedad de colores: Los carotenoides pueden ser amarillos, an5aranjados o rojos

dependiendo de su estructura química.
 Solubilidad: Son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos como el éter,
cloroformo y hexano.
 Peso molecular: Varía según el tipo de carotenoide, pero en general están en el rango
de 500 a 600 g/mol.

Propiedades químicas:

 Composición química: Los carotenoides son compuestos liposolubles compuestos

principalmente por carbono e hidrógeno. Contienen dobles enlaces conjugados que les
otorgan su color característico.
 Función biológica: Actúan como pigmentos accesorios en la fotosíntesis y tienen
propiedades antioxidantes.

Toxicidad: En general, los carotenoides no son tóxicos y son seguros para el consumo
humano. Sin embargo, altas concentraciones de ciertos carotenoides pueden llevar a una
coloración amarilla de la piel (carotenemia), aunque esto es inofensivo.

Disolventes empleados:

 Alcohol etílico (etanol): Es un disolvente orgánico polar y se utiliza comúnmente para

extraer pigmentos, especialmente la clorofila.
 Éter etílico: Es un disolvente volátil que se utiliza para extraer pigmentos liposolubles
como los carotenoides.
 Cloroformo: Otro disolvente liposoluble que puede utilizarse para extraer tanto clorofila
como carotenoides.
 Acetona: Es un disolvente polar que se emplea para la extracción de pigmentos,
especialmente clorofila.
3. Extracción de pigmentos por maceración, extracción continua y
discontinua.
Maceración:

Proceso de extracción sólido-líquido, dónde la materia prima posee una serie de compuestos
solubles en el líquido de extracción que son los que se pretende extraer. El proceso de
maceración genera dos productos que pueden ser empleados dependiendo de las necesidades
de uso, el sólido ausente de esencias o el propio extracto. La naturaleza de los compuestos
extraídos depende de la materia prima empleada, así como del líquido de extracción. Existen
dos métodos de maceración de acuerdo con la temperatura; caliente y frío.

Extracción continua:

Proceso que se realiza de manera ininterrumpida a lo largo del tiempo; se mantiene un flujo
constante del material de partida y del solvente o medio de extracción a través del sistema.
Extracción discontinua:

Implica la adición de un disolvente adecuado a una muestra que contiene pigmentos, seguido
de una agitación o mezcla para permitir que los pigmentos se disuelvan en el disolvente.
Luego, se separa la fase líquida (que contiene los pigmentos disueltos) de la fase sólida (los
componentes no deseados que no se disuelven). El disolvente se separa de los pigmentos y se
evapora, dejando los pigmentos aislados en una forma concentrada y purificada que puede ser
posteriormente analizada o utilizada en aplicaciones específicas.

4. Métodos de concentración.
Evaporación al vacío: consiste en aplicar vacío para disminuir la presión y, por ende, la
temperatura de ebullición del disolvente acelera su evaporación.

Liofilización: separar el agua u otro solvente de una muestra o disolución mediante

congelación y posterior sublimación del hielo mediante un ligero calentamiento al vacío.

Evaporación con Flujo de Gas Inerte: se hace pasar un flujo de gas inerte (como
nitrógeno) sobre la muestra, lo que ayuda a eliminar el disolvente de manera más eficiente.
Precipitación y Reconstitución: se precipitan los analitos de la fase líquida y luego
reconstituirlos en un volumen menor de disolvente, lo que concentra la muestra.
Cromatografía en Columna de Precipitación: utiliza una columna de gel o resina que
retiene los analitos, luego se lava la columna y se eluyen los analitos concentrados.

5. Cromatografía.
a) Definición.

Es un método físico de separación en el que los componentes que se han de separar se

distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposos (fase estacionaria), mientras que
la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.

b) Fundamento teórico.

L a cromatografía se basa en la distribución diferencial de los componentes de una mezcla

entre dos fases: una fase móvil y una fase estacionaria.

En la fase estacionaria hay un material que se encuentra fijo en un soporte. Puede ser sólido
(gel de sílice o alúmina) o líquido (recubierto en una superficie sólida). Los componentes de la
muestra interactúan con esta fase.

Mientras que en la fase móvil el solvente que se muestra a través de la fase estacionaria,
arrastrando los componentes de la muestra. Puede ser líquida o gaseosa, dependiendo del tipo
de cromatografía.

El fundamento de la mayoría de las técnicas cromatográficas es un equilibrio de fases. El soluto

se distribuye entre una fase móvil y una fase estacionaria.
Donde Xm es el soluto en la fase móvil y Xs es el soluto en la fase estacionaria.

Existen diferentes tipos de cromatografía como: cromatografía de capa fina, de columna, de

gases y líquida.

Una vez que los componentes se han separado, se utilizan detectores (como UV,
espectrometría de masas, fluorescencia, etc.) para cuantificar y/o identificar los compuestos
individuales.

c) Clasificación de la cromatografía, dependiendo de la naturaleza de las

fases involucradas.

Cromatografía de líquidos (fase móvil líquida):

Fase estacionaria sólida: se trata de sólidos finamente divididos con gran superficie
específica.

Cromatografía de adsorción: la fase estacionaria sólida retiene a los solutos por un

doble efecto de adsorción física y química. Las interacciones implicadas son del tipo de fuerzas
de Van Der Waals.

Cromatografía de cambio iónico: el sólido retiene a los solutos gracias a atracciones

electrostáticas. La fase estacionaria sólida lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que
retienen contracciones móviles qué pueden intercambiarse por iones de la fase móvil.

Cromatografía de exclusión: la fase estacionaria es un material poroso, que retiene a las

moléculas en función de su tamaño. En ocasiones se denomina también cromatografía de
filtración sobre geles o de permeabilidad en geles (GPC).

Fase estacionaria líquida:

Cromatografía de reparto: la fase estacionaria es un líquido inmovilizado sobre un

material inerte sólido que sólo actúa de soporte.

Cromatografía de afinidad o de fases enlazadas: la fase estacionaria es generalmente

un polímero de tipo líquido inmovilizado sobre un sólido inerte por enlaces covalentes.

Cromatografía de gases (fase móvil gaseosa):

Cromatografía gas-sólido: la fase estacionaria es un sólido finamente dividido, retiene a

los solutos por adsorción.

Cromatografía de partición o reparto: la fase estacionaria es un líquido retenido por

impregnación o por el enlace sobre un sólido inerte. Se basa en equilibrios de distribución.

Cromatografía de fluidos supercríticos:

Un fluido supercrítico es un fluido calentado a t a y P superiores a las críticas. Posee algunas

características propias de un gas y algunas propias de un líquido. La fase estacionaria puede
ser líquida o sólida.

d) Clasificación de la cromatografía, dependiendo del fenómeno involucrado.

 Cromatografía en columna: la fase estacionaria se introduce en un tobo estrecho a
través de la cual se hace pasar la fase móvil. Esta se desplaza por capilaridad, gravedad o
presión. Puede emplearse fases móviles líquidas, gaseosas o fluidos supercríticos.

Cromatografía plana: la fase estacionaria se coloca en un soporte plano. En

cromatografía plana el flujo de fase móvil se consigue por capilaridad o por gravedad. Sólo
pueden emplearse líquidos como fases móviles. Existen:

Cromatografía en papel: la fase estacionaria está constituida por el agua retenida

en la celulosa. También existen papeles cambiadores de iones.

Cromatografía en capa fina: la fase estacionaria es un sólido adsorbente

finamente dividido o un líquido inmovilizado sobre un sólido colocado sobre una placa
plana.

e) Nombre de las técnicas.

Las técnicas de cromatografía pueden llevarse a cabo por diferentes mecanismos como:
absorción continua, adsorción, partición e intercambio iónico.

f) Adsorbentes ordenados de menor a mayor actividad, fórmulas,

características principales que intervienen en las propiedades del
adsorbente.
1. Sílice gel (SiO2): separa sustancias polares (alcoholes, aminas y ácidos carboxílicos).
2. Alúmina (Al2O3): la alúmina anhídrida se usa para separar compuestos apolares
(hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas).
3. Celulosa: se usa como adsorbente en cromatografía de papel.
4. Polímeros sintéticos (resinas de intercambio iónico): se utilizan para separaciones
en cromatografía de intercambio iónico, retiene o libera iones según su carga y tamaño.

El proceso se adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo o

enlaces de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las
sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de descomposición.

g) Eluyentes ordenados de menor a mayor polaridad, fórmulas.

1. Hexano C6H14
2. Tetraclorometano CCl4
3. Diclorometano CH2Cl2
4. Cloroformo CHCl3
5. Acetato de etilo C4H8O2
6. Acetona C3H6O
7. 2-propanol C3H8O
8. Metanol CH3OH
9. Agua H2O

h) Capacidad de adsorción de los grupos funcionales de los compuestos

orgánicos, ordenados de menor a mayor capacidad de adsorción.
Alcanos (C-C):

 Son hidrocarburos alifáticos no polares. Tienen una capacidad de adsorción

relativamente baja, ya que no tienen grupos funcionales polares que interactúen
fuertemente con la fase estacionaria.
Alquenos (C=C):

 Aunque tienen un enlace doble que introduce cierta polaridad, su capacidad de

adsorción es menor en comparación con grupos funcionales más polares.
Cetonas (C=O):

 Las cetonas tienen un grupo carbonilo polar. Tienen una capacidad de adsorción mayor
que los alquenos debido a la polaridad del grupo carbonilo.
Ésteres (C-O-C):

 Los ésteres también contienen un grupo carbonilo, pero están flanqueados por átomos
de oxígeno, lo que aumenta su capacidad de adsorción en comparación con las
cetonas.
Alcoholes (R-OH):

 Los alcoholes tienen un grupo hidroxilo (-OH) polar que puede interactuar fuertemente
con la fase estacionaria, lo que les otorga una capacidad de adsorción significativa.
Ácidos Carboxílicos (R-COOH):

 Los grupos carboxilo son altamente polares y pueden formar enlaces de hidrógeno, lo
que les confiere una alta capacidad de adsorción.
Aminas (R-NH2):

 Las aminas tienen un grupo amino (-NH 2) que es polar y puede formar enlaces de
hidrógeno. Esto les da una capacidad de adsorción similar a los ácidos carboxílicos.
Amidas (R-CONH2):

 Las amidas también tienen un grupo amino, pero están conectadas a través de un
enlace amida, lo que reduce ligeramente su capacidad de adsorción en comparación
con las aminas y ácidos carboxílicos.
Halógenos (F, Cl, Br, I):

 Los halógenos son átomos electronegativos que pueden interactuar con la fase
estacionaria, especialmente en cromatografía de intercambio iónico.

i) Interacciones de los compuestos con la fase estacionaria. (Pavia)

Si se agrega alúmina (o gel de sílice) en polvo o finamente molida a una solución que contiene
un compuesto orgánico, parte del compuesto orgánico se adsorberá o se adherirá a las
partículas finas de alúmina. Muchos tipos de fuerzas intermoleculares hacen que las moléculas
orgánicas se unan a la alúmina. Estas fuerzas varían en fuerza según su tipo. Los compuestos
no polares se unen a la alúmina utilizando únicamente fuerzas de Van der Waals. Estas son
fuerzas débiles, y las moléculas apolares no se unen fuertemente a menos que tengan pesos
moleculares extremadamente altos. Las interacciones más importantes son las típicas de los
compuestos orgánicos polares. O estas fuerzas son del tipo dipolo-dipolo o implican alguna
interacción directa (coordinación, enlaces de hidrógeno o formación de sales). Estos tipos de
interacciones se ilustran en la Figura 10-1, en la que, por conveniencia, sólo se muestra una
parte de la estructura de alúmina. Se producen interacciones similares con el gel de sílice. Las
fortalezas de tales interacciones varían en el orden aproximado.

Las fuerzas de interacción obedecen el siguiente orden:

Formación de sales >coordinación > puentes de hidrógeno > dipolo – dipolo > Van der Waals

Se puede utilizar la siguiente regla general: “Cuanto más polar sea el grupo funcional, más
fuerte será la unión a la alúmina (o al gel de sílice)”

j) Clasificación de reveladores físicos y químicos, destructivos y no; ejemplo

de cada uno en qué casos se emplean (ninhidrina, cloruro férrico, ácido
sulfúrico, 12, 2.4-dinitrofenihidrazina, etc.)

Métodos físicos: Muchas sustancias orgánicas absorben radiaciones de luz ultravioleta

tornándose fluorescentes. Cuando el papel es tratado con solución de fluoresceína,
frecuentemente destaca las manchas tornándolas amarillo-verdosas, blancas o azuladas,
mientras que las sustancias que absorben luz UV aparecen como manchas oscuras sobre un
fondo fluorescente azulado que, normalmente, corresponde al papel. Se pueden usar lámpara
UV de onda corta (240-260 nm) o de onda larga (360 nm).
Métodos químicos: El cromatograma obtenido se rocía con una solución reveladora, cuya
composición depende del tipo de sustancias a ser reveladas (aminoácidos, carbohidratos,
insecticidas, iones inorgánicos, etc.). Existe en la bibliografía información acerca de cuál debe
ser el agente cromogénico empleado, técnica de preparación y de conservación, sensibilidad y
tipo de sustancias detectadas por una determinada solución reveladora.
Otro método es la introducción de la placa en vapores de yodo.
k) Coeficiente de partición en cromatografía.

Determina la velocidad promedio de cada zona de soluto conforme la fase móvil avanza a lo
largo de la columna.

K= CS/CM

Donde CS y CM son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y móvil,

respectivamente. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos
fases.
 l) Polaridad en cromatografía.

La polaridad se refiere a la diferencia en electronegatividad y afinidad por los electrones entre

átomos en una molécula. Esta propiedad determina como interactúan los analitos con la fase
estacionaria y la móvil.
Interacción con la Fase Estacionaria: la fase estacionaria suele ser un material sólido o
recubierto en una superficie sólida (como sílice gel o alúmina). Los compuestos más polares
tienden a interactuar más fuertemente con esta fase, lo que ralentiza su movimiento a través de
la columna y permite una separación más efectiva.
Solubilidad en la Fase Móvil: los compuestos polares tienen una mayor afinidad por fases
móviles polares (como agua o mezclas acuosas), mientras que los compuestos no polares se
disolverán mejor en fases móviles menos polares (como disolventes orgánicos).
Elución de Componentes: los componentes de una muestra se eluyen en diferentes
momentos, lo que permite su separación. Los compuestos más polares tienden a eluir más
tarde, ya que interactúan más fuertemente con la fase estacionaria y requieren más tiempo
para moverse a través de la columna.
Selección de la Fase Estacionaria: la elección de la fase estacionaria es crucial y debe tener
en cuenta la polaridad de los analitos de interés. Por ejemplo, para separar compuestos
polares, se elegiría una fase estacionaria polar (como sílice gel). Para compuestos menos
polares, se podría optar por una fase estacionaria menos polar (como una columna de
alúmina).

6. Cromatografía en capa delgada (analítica y preparativa)

a) Equipo utilizado.
 Placas de vidrio recubiertas con capas de la fase estacionaria sólida, que se adhieren a
las placas, generalmente en virtud de un agente aglutinante, tal como sulfato de calcio,
que se incorpora. La capa delgada
preparada sobre vidrio a menudo se llama
placa cromática.
 Absorbente
 Cubeta cromatográfica o cámara de elusión
 Eluyente (fase móvil)
 Muestra
 Capilares
 Visor ultravioleta

b) Dimensiones de las placas o soporte.

En la cromatografía en capa fina (CCF), el nivel de elución de las sustancias está influenciado
tanto por su propia polaridad como por la polaridad del disolvente que se emplea como
eluyente. El agente adsorbente se dispone en forma de una fina capa adherida a un soporte
rígido, que puede consistir en placas de vidrio, aluminio o poliéster. Las dimensiones típicas de
las placas para CCF convencional son de 20 x 20, 10 x 20 y 5 x 2 cm.
 c) Limpieza del soporte.

Utilizar un hisopo o algodón humedecido con un disolvente adecuado (puede ser alcohol) para
limpiar suavemente la superficie del soporte y eliminar impurezas mecánicamente.

Verificar que el soporte esté seco antes de aplicar la muestra y realizar la cromatografía, esto
evita la presencia de humedad que podría interferir en la separación.

d) Preparación de la papilla: Disolvente(s) empleado(s) y proporción

'(adsorbente y disolvente).

Las capas compactas se preparan aplicando una papilla del medio elegido en un disolvente
adecuado, sobre las placas de vidrio. En la cromatografía de capa fina es posible emplearse
cualquier medio, habiendo discutido que factores influyen en la elección. Los más populares
son la celulosa microgranular o microcristalina, gel de sílice (sílica gel) en adsorción y reparto y
alúmina.
La elección del disolvente dependerá de la naturaleza del compuesto que se va a separar y del
material en que la separación va a llevarse a cabo. Una regla general para la elección del
disolvente es la comparación de la polaridad de este y de la sustancia que se va a separar, así
aplicamos el criterio en el cual se emplea un disolvente poderoso (activos) para sustancias no
polares y adsorbentes con menos actividad para sustancias más polares.
e) Preparación de las placas inmersión y revestimiento.
 Se deben limpiar meticulosamente las placas sumergiéndolas en una solución
sulfocrómica y luego enjuagarlas abundantemente con agua hasta que el líquido que
escurra no deje ninguna mancha visible en la superficie.
 Después, se deben secar completamente. El adsorbente, con o sin la adición de
reactivos como soluciones reguladoras o sustancias fluorescentes, debe ser suspendido
en agua o solventes orgánicos volátiles y agitado durante 30 segundos hasta obtener
una suspensión uniforme. Esta suspensión se extiende sobre una o varias placas, ya
sea manualmente o con la ayuda de un aplicador, hasta obtener una capa con un
espesor de 0,25 a 1 mm.
 A continuación, se deja reposar durante 5 minutos. Posteriormente, se procede a secar
a 105 °C durante 30 minutos y luego se enfrían en un desecador. Normalmente, 30
gramos de adsorbente y 60 mililitros de agua son suficientes para preparar cinco placas
de 20x20 cm.
 Una vez que las placas están secas y a temperatura ambiente, se verifica la uniformidad
de la distribución y la textura de la capa adsorbente, siendo que la luz transmitida debe
mostrar uniformidad en la distribución y la luz reflejada debe mostrar uniformidad en la
textura.
 Las placas cromatográficas deben ser almacenadas en un desecador y deben utilizarse
en un plazo de tres días después de su preparación.
f) Activación y almacenamiento de las placas.
Activación: antes de utilizar las placas deben ser calentadas para retirar el agua que actúa
como una impureza la cual evita una buena separación. Se deja secar la pasta que se aplique
(un absorbente) durante 30 minutos o más hasta que quede adherida, la capa formada se
activa por calentamiento en posición vertical a 100-110 °C durante una o varias horas.

Almacenamiento: las placas se conservan en un desecador.

g) Aglutinante o adhesivo empleado en los adsorbentes.

El aglutinante es una sustancia que permite que una sustancia la cual sus partículas son en
polvo o secas, en este caso sería el adsorbente; permanezcan juntas. Como el almidón, yeso,
harina de maíz, sulfato de calcio hidratado, etc.

Los absorbentes más utilizados son: gel de sílice, óxido de aluminio o alúmina, celulosa.

h) Cámara de elución.

Se utiliza para llevar a cabo el proceso de elución, que consiste en permitir que la fase móvil
(disolvente) se mueva a través de la fase estacionaria (capa fina de material adsorbente)
llevando consigo los componentes de la muestra y separándolos en función de sus
interacciones con la fase estacionaria.

Para realizar la cámara se usa un vaso de precipitados y un vidrio de reloj. Cortar un trozo de
papel filtro para que cuando se coloque la cámara, el papel filtro se ajuste dentro de la cámara
y quede plano en la parte inferior pero no oscurezca la vista del interior.

El papel filtro mantiene la cámara saturada de vapores por lo que cuando el eluyente sube
sobre la placa no se evapora fácilmente, sino que continúa subiendo y sometiéndose a la
cromatografía.

i) Cantidad de absorbente a utilizar con relación a la cantidad de muestra a

separar.

Cuando se selecciona el adsorbente, es importante considerar el tamaño de sus partículas.

Cuanto más finamente dividido esté, mejor se adherirá al soporte, aunque también es posible
agregar un agente adherente. Por ejemplo, si se está realizando una separación cromatográfica
en una muestra de 1.0 gramo, se recomendaría usar aproximadamente 15 gramos de gel de
sílice. Dado que el gel de sílice tiene una densidad aparente de alrededor de 0.3 gramos por
centímetro cúbico, esos 15 gramos ocuparían un volumen de aproximadamente 45-50
centímetros cúbicos (o mililitros). Este volumen se conoce como el "volumen de columna".

Si el objetivo es tener una columna con una altura de gel de sílice de 15 centímetros, se puede
calcular el diámetro interno necesario para la columna de cromatografía. Dado que el volumen
de la columna de gel de sílice es igual a πr^2h, y se sabe que el volumen es de 50 centímetros
cúbicos y la altura es de 15 centímetros, se puede calcular que el radio (r) es aproximadamente
1.0 centímetro. Por lo tanto, una columna de cromatografía con un diámetro interno de 2-2.5
centímetros sería adecuada.

Usualmente, se emplean alrededor de dos volúmenes de columna de disolvente de elución

para impulsar el líquido a través de la columna de gel de sílice en cromatografía líquida por
gravedad. Por lo tanto, para la separación cromatográfica de 10 gramos de material sobre gel
de sílice, sería apropiado utilizar una columna de vidrio con un diámetro de 2 centímetros y una
longitud de 40 centímetros. Tanto una columna de 2.5 centímetros de diámetro y 30
centímetros de longitud, como una columna de 1.9 centímetros de diámetro y 40 centímetros
de longitud serían adecuadas para la separación de una muestra de 1.0 gramo.

j) Precauciones al prepararlas y efectuarlas. parámetros que afectan la

preparación.

Precauciones:

 Preparación de las placas.

 Conservación de la placa en una solución concentrada de carbonato sódico,
enjuagándose en agua antes de su uso.
 Si el material llega a adherirse mal es necesario agregar una pequeña cantidad de
sulfato cálcico que es un agente aglomerante.
 Se debe activar las placas antes de usarlas.

Parámetros que afectan la preparación:

 La polaridad.
 Temperatura, a menor temperatura las sustancias absorben más en la fase estacionaria.
 No debe de haber corrientes de aire donde se lleve a cabo la cromatografía.
 Verificar la limpieza de las placas.
k) Definiciones de los términos de R! y Rx. qué ceso se usa cada uno
Reproducibilidad de 'los valores de Ejemplifique
en una cromatografía el de éstos.

La identificación de las manchas se realiza de acuerdo con su color

y su valor Rf (factor de retención), que es el registro de la relación
de distancias.

Mientras que el Rx, es la razón de la distancia recorrida entre una

sustancia problema y el compuesto de referencia.
 l) Aplicaciones de la cromatografía en capa delgada analítica y preparativa,
ejemplifique éstas.
 Identificar alguna sustancia conocida en una mezcla por su comparación con un patrón
de la sustancia pura.
 Medir el grado de pureza de una muestra. Si existen varias manchas en el cronograma
es indicativo de que existen más componentes en la muestra.
 Obtener una medida semicualitativa de algún componente. Si la mancha es grande, la
concentración de esa sustancia es mayor.
m) Cómo se lleva a cabo la cromatografía en placa preparativa.

El proceso se realiza generalmente en placas de dimensiones 5 cm x 20 cm o 20 cm x 20 cm.

Se crea una mezcla del adsorbente con un disolvente volátil y se vierte sobre la superficie de la
placa. Esta mezcla se distribuye uniformemente sobre la placa utilizando una espátula ancha o
haciendo rodar suavemente la placa. Posteriormente, la placa se coloca en un horno para su
secado. La muestra se deposita en la placa desde el extremo inferior usando una pipeta capilar
o una pipeta desechable, extendiéndola en una franja. Se debe tener precaución para evitar
raspar o dañar la superficie de la placa. Luego, se procede al desarrollo de la placa según lo
explicado previamente y se procede a recortar y retirar con cuidado las bandas que indican la
presencia de compuestos. El material extraído se disuelve en un disolvente adecuado para
recuperar el compuesto orgánico.

n) Ventajas y desventajas de la cromatografía en capa delgada analítica y

preparativa.

Ventajas Desventajas
 Realizar un análisis químico de  Las propiedades de la fase
materias orgánicas complejas. estacionaria pueden alterarse
 Separa e identifica compuestos o mediante la adición de disoluciones
mezclas. taponadoras para mantener el pH
 Identifica cantidades en orden de deseado.
microgramos.
 No se requieren cantidades grandes
de muestra.
 Los resultados son fácilmente
reproducibles.
 El tiempo para conseguir
separaciones es menor.

o) Cómo se lleva a cabo cromatografía de sustancias incoloras.

Se somete a una placa o tratamiento con una sustancia desarrolladora para poder determinar
la presencia de sustancias o de ser necesario se utiliza un visor ultravioleta.
 7. Cromatografía en columna.
a. Equipo utilizado.

Esta técnica permite aislar compuestos de una mezcla, se

realiza mediante el uso de un tubo cilíndrico vertical (columna
de vidrio), el cuál en su interior lleva un soporte sólido
adsorbente actuando de fase estacionaria y por donde pasa la
fase móvil. Para crear la fase estacionaria son utilizados el gel
de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3), y las sustancias que
atraviesan esta fase pasan por presión, por gravedad o por
capilaridad.

b. Relación diámetro longitud de columna.

Esta propiedad está determinada por la cantidad de sustancia que se desea separar, así como
el tipo y la cantidad de adsorbente que se empleará. Por lo general, en una separación
estándar, se requerirá de 10 a 20 veces más sílice gel en comparación con el peso del material
a separar. En cromatografía líquida con sílice gel, es común utilizar diámetros de columna de 1
a 2.5 cm.

c. Limpieza de material.

Se sugiere tener precaución al cambiar abruptamente a un solvente orgánico fuerte, ya que

esto puede causar problemas en el sistema de flujo. En su lugar, se recomienda comenzar
lavando la columna con una fase móvil sin tampón antes de pasar al solvente más fuerte. En
algunos casos, puede ser necesario usar un solvente aún más potente o una serie de solventes
para limpiar completamente la columna. Se aconseja verificar las recomendaciones de los
fabricantes de columnas. El proceso de lavado sigue un patrón en el que se aumenta
gradualmente la fuerza del solvente, terminando con uno no polar para solubilizar sustancias
como lípidos y aceites.
Cada solvente de la serie debe ser miscible con el siguiente. Al final del ciclo de lavado, se
sugiere retroceder a través de un solvente intermediamente miscible antes de volver al sistema
de fase móvil original. El uso de isopropanol como solvente intermedio es una buena opción,
pero se debe tener precaución con el caudal para evitar sobrepresión en la bomba. Además, se
aconseja evitar solventes que absorban en la región ultravioleta del espectro si se utiliza un
detector de UV. Finalmente, el tetrahidrofurano y mezclas de dimetilsulfóxido o
dimetilformamida con agua pueden usarse para limpiar columnas contaminadas.

d. Empaque por vía húmeda y vía seca.

Vía húmeda: asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil. A tal fin se introduce
como una papilla con el eluyente. Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de
disolvente puro. Luego de instalada la pasta en la columna, se elimina el exceso de disolvente.

Vía seca: consisten en colocar un elemento de sustentación del relleno; se toma el tubo con
una mano y se introduce una pequeña cantidad de material, es empujado hasta el otro extremo
hasta quedar apoyado en el elemento de sustentación, así se prosigue el rellenado con
pequeños incrementos en la sustancia en cuestión cuidando que la presión ejercida sea solo la
necesaria para dar firmeza en la columna, finalmente se estabiliza el relleno con un disco de
papel filtro o lana de vidrio.

e. Relación de Cantidad de muestra y adsorbente.

Se utilizan cantidades relativamente grandes de adsorbente el cual permite un flujo rápido de la

fase móvil. Estás pueden estar entre los 38 y 63 µm de sílice de gel.

f. Precauciones en la preparación y realización.

 No se debe secar la columna, cerrar la llave.
 La temperatura del entorno debe ser constante.
 Cuando se utilizan eluyentes con punto de ebullición bajo y cuando se cambian los
disolventes se suelen formar burbujas en las columnas (acanalamiento) evitando una
buena separación, se deben usar columnas en frío.
 El tamaño de partícula del adsorbente debe ser el adecuado para una rápida y uniforme
precolación. Las partículas no deben ser porosas.

g. Velocidad de flujo.

La rapidez con la que cada componente es transportado depende de su grado de adherencia a

la fase estacionaria y de su afinidad por la fase móvil. La velocidad de flujo está influenciada
por diversos factores; si las partículas del adsorbente son pequeñas, el paso del disolvente o
solución a través de la columna será más lento. Por lo tanto, el tamaño de las partículas del
adsorbente no debe ser extremadamente grande ni extremadamente pequeño; idealmente, el
diámetro medio debería ser de alrededor de 8-12 micras. Aplicar una leve succión o cierta
presión puede acelerar el movimiento del disolvente a través de la columna.
La velocidad a la que los componentes se separan en una mezcla en una columna está
directamente relacionada con la velocidad del flujo del disolvente. Si esta varía, podría resultar
en una separación ineficiente. Por lo tanto, se mantiene un flujo constante del disolvente,
manteniendo el nivel de solvente constante sobre la superficie de la columna.

h. Tipo de elución: simple, fraccionada por gradiente y análisis frontal.

Simple: la composición del eluyente no experimenta cambios significativos y no

necesariamente debe ser idéntica al solvente inicialmente utilizado para llenar la columna. Sin
embargo, es importante evitar una composición demasiado dispar que pudiera ocasionar el
agrietamiento de las partículas de resina de intercambio iónico.

Faccionada por gradiente: hay una polaridad diferente. Se usa una mezcla de solventes que
cambia por completo.

Análisis frontal: este proceso es exclusivo de la cromatografía por adsorción. En este método,
nunca se logra una separación total. En lugar de emplear un solvente como eluyente, la misma
mezcla se introduce de forma continua en la columna hasta que se satura. Esta técnica resulta
valiosa para determinar la cantidad de componentes en una mezcla y para detectar trazas de
impurezas en sustancias que, de otro modo, serían puras.

i. Recolección de fracciones en cromatografía en columna y placa

preparativa.

Recolección de fracciones:

El proceso consiste en retirar el adsorbente de la columna una vez que el disolvente se ha

evaporado por completo. La columna se corta en secciones, y cada una de ellas se somete a
una extracción con disolvente para luego analizar el compuesto obtenido (el extracto). Si los
compuestos no presentan coloración, se presiona una tira de papel contra ellos para absorber
un poco de disolvente antes de realizar el corte. El papel, una vez seco, se trata con un
revelador que señala la ubicación de cada uno de los compuestos. Luego, se vuelve a colocar
el papel junto a la columna para identificar qué componente se encuentra en cada sección de la
columna.

Cuando se trabaja con un gran número de fracciones, se recurre a un colector automático de

fracciones, que consta de un disco en el que se disponen una serie de tubos y que gira para
recolectar las muestras. Adicionalmente, se utiliza un contador de gotas, un dispositivo que
permite que las gotas del eluyente atraviesen un haz de luz, activando una célula fotoeléctrica.
Este aparato se puede ajustar para que pase un número específico de gotas antes de cambiar
de tubo. Los contadores de gotas resultan útiles para recolectar fracciones de pequeño
volumen.

Placa preparativa:

Las separaciones características en cromatografía en capa fina se llevan a cabo en placas de

vidrio o plástico recubiertas con una fina y adherente capa de partículas finamente trituradas,
que actúan como fase estacionaria. Estas partículas son similares a las utilizadas en
cromatografía en columna. Cuando se preparan sobre vidrio, se les conoce como
cromatoplacas o simplemente placas.

j. Cómo se lleva a cabo la cromatografía en columna de sustancias incoloras.

A pesar de que ciertos compuestos que carecen de color pueden generar bandas claramente
definidas en una columna de absorción, se requiere de técnicas particulares para identificar las
bandas de los productos adsorbidos. Para este propósito, se recurre al uso de lámparas
ultravioletas en el caso de compuestos que muestran fluorescencia, así como a la utilización de
reactivos que generen coloración con los compuestos adsorbidos. Estas técnicas permiten
marcar una banda en la columna.

8. Defina los siguientes conceptos:

a) Adsorción.

Fenómeno físico, en donde un compuesto en fase líquida o gaseosa entra en contacto con un
sólido adsorbente y se adhiere a la superficie del mismo, mediante una fuerza física (fuerza de
dispersión de London)

b) Absorción.

Fenómeno físico que implica la difusión de masa en el que uno o más componentes de una
mezcla gaseosa se disuelven en un líquido. No implica cambios químicos, por lo que es
reversible.

c) Eluyente.

Disolvente utilizado en técnicas de cromatografía para extraer un componente que se quiere

separar de otra fase.
d) Eluato.

Cada una de las sustancias que migran a través del

lecho de la fase estacionaria (impulsadas por la fase
móvil) dentro de un sistema de separación
cromatográfico.

e) Fase estacionaria y móvil.

Fase estacionaria: consiste en un sólido

adsorbente empaquetado en una columna de vidrio.

Fase móvil: esta fase consiste en un disolvente o

mezcla de disolventes, seleccionado en base a su
polaridad con el fin de optimizar la separación de los componentes de la muestra en la
columna.

f) Grado de resolución.
Es la distancia entre los picos de las bandas (o centros) dividida entre el ancho promedio de las
bandas. Si la retención y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo, como en la
Fig. 2.3, la resolución está dada por: Rs = (t´R,2 - t´R,1) /(0.5·(W2+W1))

g) Velocidad de flujo.

Se refiere a la rapidez con la que el eluyente (solvente o gas portador) se desplaza a través de
la fase estacionaria y, por ende, a través de la columna cromatográfica. La velocidad de flujo es
controlada principalmente por el caudal del eluyente, que se mide en mililitros por minuto en
cromatografía líquida y en mililitros por minuto a mililitros por segundo (mL/min a mL/s) en
cromatografía de gases.

h) KD en cromatografía.

Se basa en la diferencia de solubilidad de los componentes de la muestra en la fase

estacionaria (cromatografía de gases), o en las diferentes solubilidades de los componentes en
las fases móviles y estacionarias (cromatografía líquida). Se utiliza para la separación de
mezclas de compuestos de polaridad media y alta.

i) Partición.

Técnica de separación de los componentes presentes en la mezcla en dos fases líquidas que
son el solvente original y el solvente de recubrimiento utilizado en la columna.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Furniss B S. Vogel´s Textbook of Practical Organic Chemistry. 5ª ed. Longman Scientific

& Technical; 1989.
2. Pavia D. Introduction to Organic Laboratory Techniques. 3ª ed. Thomson Brooks. 2005.
3. Keese. R. Métodos de laboratorio para química orgánica. Editorial Limusa. 1990