“Año de la unidad, paz y desarrollo”

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Profesional de Genética y Biotecnología

ESPECTOFOTOMETRÍA

DOCENTES:
CARMEN AMELIA PANTIGOSO FLORES DE DURAND
GIOVANNA ELIZABETH SOTIL CAYCHO
LEYDA GERALDINE CABRERA CÓRDOVA
PATRICIA GLORIA WOLL TOSO

CURSO: BIOQUÍMICA GENERAL

INTEGRANTES:

Bernal Paulet, Antony Jhoan -22100047

Huanca Jimenez, José Luis -22100122
Justino Chavez, Alem Grimaldi -22100048
Romero Sanabria, Elías Rodrigo -22100041
Valverde Vilcherrez, Ana Karla -22100138
Ushñahua Santos, Dariel Abner - 22100044
Ramos Huerta, Cristhofer Brayan - 21100110

CICLO: 2023 - I
INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

Índice
1. Objetivos 2

2. Resultados 2
2.1. Experiencia 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2.2. Experiencia 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.3. Experiencia 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3. Cuestionario 9
3.1. Investigue por qué se pueden producir desviaciones en la Ley de Lambert-Beer. ¿En qué
rango de concentración molar se trabajan las mediciones de Absorbancia? . . . . . . . . 9
3.2. ¿Qué ocurre a nivel atómico/electrónico cuando se produce la absorción de la radiación
UV-visible? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.3. Simulación de determinación de la concentración de una muestra problema del cromó-
foro p- nitrofenol (pNF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

Resumen
El empleo del espectrofotómetro es crucial para la determinación precisa de concentraciones
de cromóforos, sustancias que reflejan y absorben determinados rangos de longitud de onda, com-
prendida en la luz visible y rayos UV cercanos. Por consiguiente, se aprendieron los conceptos de
transmitancia y absorbancia, imprescindibles para un buen manejo del equipamiento presente en el
laboratorio. En el procedimiento, se prepararon 6 soluciones estándar del cromóforo azul de meti-
leno diluido. Como resultado, se obtuvo que la máxima absorbancia se dio al λ igual a 664 nm. Los
resultados obtenidos en las concentraciones acuerdan con la ecuación de recta obtenida por interpo-
lación de la ley de Lambert Beer. El R2 obtenido es de 0.991, por tanto la desviación a la ley no es
significativa, y se afirma la hipótesis nula. Como conclusión, se comprueba la relación directamen-
te proporcional entre absorbancia y concentración del cromóforo. Además, consideramos que una
buena praxis de volumetría y manejo y cuidado de los contenedores de las soluciones estándar en el
espectrofotómetro reducen la magnitud de dispersión presente en las mediciones.

Palabras clave: Absorbancia, Cromóforo, Transmitancia

1. Objetivos
Conocer los conceptos básicos relacionados con la espectofotometría, la trasmitancia,
la absorbancia y la clncentración de una sustancia cromófora en solución mediante
la ley de Lambert - Beer.
Conocer de forma experimental el Método espectofotométrico de medición de con-
centración de un cromóforo que comprende: la forma de obtención del espectro o
curva de absorción, la curva de calibración con el empleo de soluciones estándar y el
análisis cuantitativo mediante el cálculo de la concentración de muestras problema d

2. Resultados
2.1. Experiencia 1
Con sus datos encontrados e indicados en la tabla (recuerde trabajar con los rangos de longitud
de onda solicitados por el profesor y que van de acuerdo al modelo del espectrofotómetro).
a) Presente la Curva o Espectro de absorción (espectrograma) para el azul de metileno
de acuerdo a los datos de la Tabla 2.

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

Figura 1

b) Determine la max. Interprete sus resultados

La longitud de onda máxima a la que el azul de metileno absorbe luz se conoce como
λ max y equivale a 664 nanómetros. Esto significa que el azul de metileno muestra su
máxima capacidad de absorción de luz cuando la luz incidente tiene una longitud de
onda de 664 nanómetros. En otras palabras, la absorción máxima de luz por parte del
azul de metileno ocurre a una longitud de onda de 664 nanómetros. Este fenómeno es
fundamental para comprender cómo esta sustancia interactúa con la luz y es relevante en
diversas aplicaciones científicas y tecnológicas Domíngues-Martínez (2018).
c) Indague en internet si el azul de metileno absorbe también la luz UV, muestre el
espectrograma hallado.
El azul de metileno es una sustancia que tiene la capacidad de absorber la luz ultravioleta
(UV) en el espectro electromagnético. Esta capacidad se debe a la presencia de grupos
cromóforos en su estructura química, que son responsables de interactuar con la luz en
el rango de UV. Los grupos cromóforos son regiones específicas en la molécula del azul
de metileno que tienen una afinidad especial por la luz ultravioleta, lo que les permite
absorberla de manera eficiente (Vesga et al., 2023).

Figura 2: Espectograma del azul de metileno. Se observa que la absorbancia de los rayos UV crece desde
los 280 nm hasta el límite inferior de radiación electromagnética visible.

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

2.2. Experiencia 2
Para obtener una curva de calibración, se preparan las soluciones estándar (Std) que consisten
en soluciones de diferentes concentraciones del cromóforo.
Se rotularon 6 tubos y se prepararon una batería de soluciones:
Tubos
Soluciones ml
Blanco Std1 Std2 Std3 Std4 MP
Concentración
de Azul de meti- 0 0.2 0.4 0.8 1.0 ?
leno(mg/dl)
Azul de metileno 1
0 0.5 1.0 2.0 0.5 0
mg/dl
Agua destilada 2.5 2.0 1.5 0.5 0 0
Muestra problema se
0 0 0 0 0 2.5
azul de metileno
a) Presente los cálculos necesarios para preparar los estandares de azul de metileno (Ver
datos anotados en la tabla)
i. Para tubo Std1
V1: Volumen de la solución madre de azul de metileno que necesitas agregar.
V2: Volumen total de la solución que deseas preparar (2,5 ml).
C1: Concentración de la solución madre de azul de metileno (1 mg/dL).
C2: Concentración deseada de la solución final (0,2 mg/dL).
Usamos la fórmula de dilución:

C1 · V1 = C2 · V2

Donde:
C1 = 1 mg/dL
V 2 = 2, 5 ml
C2 = 0, 2 mg/dL
V 1 =?

1 mg/dl · V1 = 0, 2 mg/dl · 2, 5 ml

0, 2 mg/dl · 2, 5 ml
V1 = = 0, 5 ml
1 mg/dl

Por lo tanto, se necesitan 0,5 ml de solución de azul de metileno y 2,0 ml de agua

destilada.

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

ii. Para tubo Std2

V1 : Volumen de la solución madre de azul de metileno que necesitas agregar.
V2 : Volumen total de la solución que deseas preparar (2,5 ml).
C1 : Concentración de la solución madre de azul de metileno (1 mg/dL).
C2 : Concentración deseada de la solución final (0,4 mg/dL).
Usamos la fórmula de dilución:

C1 · V1 = C2 · V2

Donde:
C1 = 1 mg/dL
V 2 = 2, 5 ml
C2 = 0, 4 mg/dL
V 1 =?

1 mg/dl · V1 = 0, 4 mg/dl · 2, 5 ml

0, 4 mg/dl · 2, 5 ml
V1 = = 1 ml
1 mg/dl

Por lo tanto, se necesitan 1 ml de solución de azul de metileno y 1,5 ml de agua

destilada.

iii. Para tubo Std3

V1: Volumen de la solución madre de azul de metileno que necesitas agregar.
V2: Volumen total de la solución que deseas preparar (2,5 ml).
C1: Concentración de la solución madre de azul de metileno (1 mg/dL).
C2: Concentración deseada de la solución final (0,8 mg/dL).
Usamos la fórmula de dilución:

C1 · V1 = C2 · V2

Donde:
C1 = 1 mg/dL
V 2 = 2, 5 ml
C2 = 0, 8 mg/dL
V 1 =?

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

1 mg/dl · V1 = 0, 8 mg/dl · 2, 5 ml

0, 8 mg/dl · 2, 5 ml
V1 = = 2 ml
1 mg/dl

Por lo tanto, se necesitan 2 ml de solución de azul de metileno y 0,5 ml de agua

destilada.

iv. Para tubo Std4

V1: Volumen de la solución madre de azul de metileno que necesitas agregar.
V2: Volumen total de la solución que deseas preparar (2,5 ml).
C1: Concentración de la solución madre de azul de metileno (1 mg/dL).
C2: Concentración deseada de la solución final (1 mg/dL).
Usamos la fórmula de dilución:

C1 · V1 = C2 · V2

Donde:
C1 = 1 mg/dL
V 2 = 2, 5 ml
C2 = 1 mg/dL
V 1 =?

1 mg/dl · V1 = 1 mg/dl · 2, 5 ml

1 mg/dl · 2, 5 ml
V1 = = 2, 5 ml
1 mg/dl

Por lo tanto, se necesitan 2,5 ml de solución de azul de metileno.

b) Con los datos encontrados de lectura de A, presente la tabla 4

Tubos Conc. Azul de metileno (mg/dl) A_664 nm Fc

Blanco 0 0
Std1 0.2 0.192 1.041
Std2 0.4 0.380 1.052
Std3 0.8 0.670 1.194
Std4 1.0 0.944 1.059
MP ? 0.452

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

2.3. Experiencia 3
a) Presente la Curva de calibración para el azul de metileno tomando los datos del Blanco
y de las Sol. Estándar de la Tabla 4 anterior y la Hoja de cálculo. En esta curva debe
aparecer la proyección de la A de la MP sobre el eje X de concentración.

Figura 3: Curva de calibración de Azul de metileno

b) Obtenga la Ecuación de la recta Determine la concentración de la muestra problema del

azul de metileno (tubo 6)
i. Presente una fotografía de la gráfica en papel milimetrado donde se muestra la con-
centración de MP por interpolación de su A

Figura 4: Descripción de la imagen.

ii. Concentración de MP de AzulMet realizando los cálculos de la Opción 1

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

Concentración Absorvancia Blanco

0 0 Blanco
St. 1 0.2 0.192
St. 2 0.4 0.38
St. 3 0.8 0.67
St. 4 1 0.944
MP x 0.452

Cuadro 1: Tabla de Concentración y Absorvancia

Y = 0,903X + 3,86 × 10−3 (1)

Dado que Y = 0,452, podemos resolver para X:

0,452 = 0,903X + 3,86 × 10−3

Resolviendo para X:

0,452 − 3,86 × 10−3

X= (2)
0,903

Simplificando:

X = 0,496 (3)

iii. Concentración de MP de AzulMet realizando los cálculos de la Opción 2.

A=c·l (4)

Dado que A = 0,452 y l = 1, podemos resolver para c:

0,452 = 1,0259 · c · 1 (5)

Resolviendo para c:

0,452
c= (6)
1,0259 · 1

Simplificando:

c ≈ 0,4405 (7)

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

Tubos Conc. Azul de Metileno (mg/dl) A 664 nm Fc

Blanco 0 0 0
Std1 0.2 0.192 1.041
Std2 0.4 0.380 1.052
Std3 0.8 0.670 1.194
Std4 1.0 0.944 1.059
MP ? 0.452 1.086

Cuadro 2: Tabla de Concentración de Azul de Metileno

iv. Concentración de MP de AzulMet empleando el factor de calibración promedio. Use

unidades de mg/dL en todos los casos.
NOTA: El factor de calibración de la muestra problema (MP) se halló con el prome-
dio de los factores de calibración pre adquiridos de las soluciones estándar.
Dado que AM P = 0,452, y F cM P × AM P = CM P , podemos calcular CM P de la
siguiente manera:

CM P = F cM P × AM P = 1,086 × 0,452 = 0,490 mg/dl (8)

3. Cuestionario
3.1. Investigue por qué se pueden producir desviaciones en la Ley de Lambert-Beer. ¿En
qué rango de concentración molar se trabajan las mediciones de Absorbancia?
Las Desviaciones en la ley de Lambert-Beer se producen cuando se pierde la linealidad, esto se
da cuando la proporción se absorbancia y concentración no se encuentran a temperatura y pre-
sión constante, además también se debe a la falta de monocromaticidad, soluciones concentra-
das y por variaciones en el índice de refracción. Por otro lado se pueden producir desviaciones
debido a que la fuente de luz que se usa sea la inadecuada o también que haya variaciones altas
de voltaje, además las celdas deben de ser de un material óptico adecuado y se deben colocar
correctamente en el espectrofotómetro. El rango de concentración para medir la absorbancia
está entre 10−6 M y 10−3 M aunque este rango puede variar dependiendo del espectrofotómetro
utilizado y de la solución que se esté utilizando (Baeza, 2007)

3.2. ¿Qué ocurre a nivel atómico/electrónico cuando se produce la absorción de la ra-

diación UV-visible?
Cuando se produce la absorción de radiación UV-visible, los electrones de un átomo o molécula
absorben la energía de los fotones y se excitan a un nivel de energía superior. Esto provoca una
transición electrónica, es decir, un salto de un electrón de un nivel de energía a otro. La energía
de los fotones absorbidos corresponde a la diferencia de energía entre los dos niveles de energía
involucrados en la transición. La absorción de radiación UV-visible se restringe a un número
limitado de grupos funcionales, llamados cromóforos, que contienen electrones de valencia con
energías de excitación relativamente bajos (Valladares, 1994)

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

3.3. Simulación de determinación de la concentración de una muestra problema del cro-

móforo p- nitrofenol (pNF)

1. Espectro de absorción del pNF:

a Calibración del espectofotómetro

Figura 5

b Barrido espectral del pNF

Figura 6

λmx=400 nm
2. Curva de calibración del pNF:
a. Preparación de soluciones estándar:
Cuadro 3: Preparación de Cubeta de Estándar

Cubeta de Estándar STD1 STD2 STD3

80uM pNF, mL 1 2 3
Agua destilada, mL 2 1 0
Volumen total, mL 3 3 3

Se hallan las absorbancias:

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INFORME SEMANA 5: ESPECTOFOTOMETRÍA

Figura 7

b. Datos de Concentración y Absorbancia de estándares de pNF:

i. Determinando concentración para cada cubeta:
Cubeta 1:
C1 V1 = C2 V2 (9)

(80µM )(1 mL) = C2 (3 mL)

(10)
(80µM )(1 mL)
C2 = = 26,6µM
3 mL

Cubeta 2:
C1 V1 = C2 V2 (11)

(80µM )(2 mL) = C2 (3 mL)

(12)
(80µM )(2 mL)
C2 = = 53,3µM
3 mL

Cubeta 3:
C1 V1 = C2 V2 (13)

(80µM )(3 mL) = C2 (3 mL)

(14)
(80µM )(3 mL)
C2 = = 80µM
3 mL

ii. Tabla con los datos colectados y calculados:

Tubo Concentración, µM A405nm

Blanco 0 0
STD 1 26.6 0.539
STD 2 53.3 1.072
STD 3 80 1.609

Cuadro 4: Resultados de Concentración a 405 nm.

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3. ¿Se observa una relación entre la A y la C?

Tal y como se observa en el conjunto de datos expresados en la tabla, al aumentar la
concentración de pNF, también aumenta su absorbancia. Por lo que, se refleja una relación
directamente proporcional.

4. Absorbancia MP:

Figura 8

a. Análisis Cuantitativo

Figura 9

Opción 1:
Absorbancia de la MP: 0,744 nm.
Empleando la ecuación de la recta:

0,744 = 0,0201x (15)

0,744
x= ≈ 37,01 (16)
0,0201

Tomando en cuenta el factor de dilución:

CM P = (37,01) × 3 = 111,03 µM (17)

Verificando:

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Figura 10

Opción 2:
Aplicando la Ecuación Lambert - Beer:

A=ε·c·l (18)

0,744 = (0,0201) · 1 · C (19)

0,744
C= ≈ 37,01 µM (20)
0,0201

Usando: C1 V1 = C2 V2

CM P (1 mL) = (37,01 µM )(3 mL) (21)

(37,01 µM )(3 mL)

CM P = = 111,03 µM (22)
1 mL
b. En relación con los resultados obtenidos a través de la aplicación de ambas
opciones:
En principio, se resalta que al aplicar ambas opciones, se obtiene el mismo resultado.
Por lo que, se comprueba la fiabilidad de esta misma. De la misma manera, se logra
comprender la relación que existe entre la ecuación de la recta de un gráfico A (nm)
vs C (µM)y la ecuación Lambert - Beer.

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Referencias

Baeza, A. (2007). Precisión en espectrometría.

Domíngues-Martínez, L. (2018). Evaluación de la remoción de colorantes mediante humedales

subsuperficiales.

Valladares, S. (1994). Espectrofotometría de absorción molecular ultravioleta-visible. FAO,

México.

Vesga, A. A. A., Grimaldos, A. C. C., Tarazona, R. A. G., y Castellanos, Y. R. M. (2023). De-

mostración práctica de la importancia de la longitud de onda en la espectroscopia ultravioleta
visible. Educación Química, 34(2):40–49.

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