PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO YREACTIVOS
Laboratorio 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y
REACTIVOS
INTRODUCcIÓN
Apartir de los cultivos es posible realizar una amplia cantidad de ensayos. Por
ejemplo, se puede obtener el cariotipo de una especie cuando se combina con la
técnica de bandas apropiada, y permite efectuar además estudios evolutivos por
comparación de cariotipos entre especies relacionadas.
Através de las metafases de los cultivos referidos se puede confirmar el cariotipo de
una especie y estudiar sus variaciones poblacionales in vivo sin sacrificio del individuo
en análisis. Elcariotipo es un parámetro de suma importancia desde distintos puntos de
vista, especialmente en estudios poblacionales (de especies en las cuales sus linfocitos
se puedan cultivar) y muy especialmente, cuando se trata de especies incluidas en el
CITES (convención sobre el comercio internacionalde especies amenazadas de fauna
y flora silvestre). Además la combinación de esta técnica con las de bandas
cromosómicas apropiadas permite realizar estudios de variaciones cariotípicas
intraespecificas, interespecifica ylo intergenéricas, posibilitando inferencias evolutivas.
También, se pueden utilizar las metafases obtenidas para aplicar ensayos de
genotoxicidad, utilizando para esto, biomarcadores como ICH (Intercambio de
Cromátides Hermanas), CPC (Cinéica de Proliferación Celular), IM (Indice Mitótico),
AC(Aberraciones Cromosómicas) entre otros de los posibles marcadores de efecto
genotóxico.
Comercialmente los medios de cultivo se consiguen en polvo e hidratados, la
presentación en polvo viene en frascos o sobres para la preparación de 1litro o 10
litros, de acuerdo con las necesidades de consumo individuales. Se recomienda el
empleo en medios en polvo ya que son mas estables yde mas fácil almacenamiento.
Las especificaciones para la rehidratación de los diferentes medios vienen claramente
definidas en las instrucciones proporcionadas por las casas productoras. Una vez
rehidratado el medio debe ser esterilizado por filtración a través de una membrana de
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celulosa y empacado en frascos de 100 o 200 mL, identificados y almacenados en
nevera. Hoy día estos medios de cultivos se venden ya en estado liquido con altos
estándares de calidad y con todas las sustancias necesarias para que haya un
crecimiento celular in vitro muy efectivo.
Con referencia a las soluciones hipotónicas existen varios tipos de soluciones que
incluyen suero diluido al 20%, citrato de sodio al 1% o cloruro de potasio 0,075M. El
KCI es el mas recomendado puesto que produce menos daño en la estructura
cromosómica.
COMPETENCIAS
Adquiere conocimientos teóricos sobre manipulación aséptica de reactivos y
medios de cultivos.
Practica iversas formas de preparación de soluciones y reafirman
conocimientos sobre cálculos de concentraciones.
MATERIALES
EN EL LABORATORIO POR LOS ESTUDIANTES
Bata de laboratorio, guantes,
Diferentes medios de cultivos para mascarillas, tabla periodica de los
crecimientos celular en suspensión y en
elementos y calculadora.
monocapa.
Reactivos en estado solido y liquido.
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PREPARACIÓN DE MEDI0S DE CULTIVO YREACTIVOS
PROCEDIMIENTO YOBSERVACIONES
Preparar las siguientes soluciones:
1. Solución salina de Citrato de Sodio: mezclar 17.532 g de Cloruro de Sodio y 8.82 g
de Citrato de Sodio y disolverlos hasta aforar en 1litro de agua bidestilada.
2. Solución hipotónica KCl 0.075M: pesar gde Cloruro de Potasio- KCl y
diluirlo en 1 Lde agua bidestilada.
3. Solución hipotónica KCI 0.046M: pesar gde Cloruro de Potasio- KCl y
diluirlo en 1 Lde agua bidestilada.
4. Solución hipotónica de Citrato de Sodio 1%: pesar 1g de citrato de sodio y
disolverlo en 1Lde agua bidestilada.
5. Solución Fijadora de Carnoy 3:1: mezclar 3 partes de Metanol Absoluto y 1 parte de
Ácido Acético Glacial.
5. Solución Fijadora de Carnoy: Etanol 60 ml, Cloroformo 30 ml,Ácido acético 10ml.
¿En qué proporción esta la solución fijadora?
6. Solución Fijadora Farmer: (etanol absoluto y ácido acético glacial en proporción
3:1), para la fijación de los cromosomas. El tiempo de fijación más efectivo con
Farmer es de 24 horas a 3°C.
"Las soluciones fijadoras se preparan fresco al momento de usar y se mantiene en
frio.
7. Acido acético 50%. Función: conserva la cromatina, retrae los tejidos. Es más un
conservante que un fijador.
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PREPARACIÓNDE MEDIOS DE CULTIVO YREACTIVOS
8. Acido acético 5%: para un volumen final de 100 mL, medir mL de acido
acético glacial yañadirle mL de agua bidestilada.
9. Propanol 30% : para un volumen final de 50 mL , medir mL de propanol
absoluto y añadirle mL de agua bidestilada.
10. Solución buffer PBS: pesar 16 g de NaCl, 0.4 g de KCI, 2.3 gde Na2HPO4
anhídrido, 0.4 g de KH2PO4. Se disuelven en 2.200 mL de agua destilada. Esterilizar en
autoclave para que quede en 2.000mL o2L. Ajustar el pH a74 con NaOHoHCI.
11. Solución de Tripsina 0.25%: pesar gde Tripsina ydiluirlo en 0.025 mL de
EDTA y 10 mL de agua bidestilada estéil. Se colocan en alícuotas de 0.5 mL y se
congela. Al momento de usar, descongelar la alícuota y mezclarlo con 9.5 mL de
solución PBS estéril. ¿Cuántas veces se diluyo la solución de tripsina en alicuota?
12. Solución reguladora de pH a 7.4: preparar NaOH al 20%. Para un volumen de 50
mL, pesar g de NaOHy disolverlo en mL de agua bidestilada.
13. Antimicrobiano estreptomicina: pesar 1 gde sulfato de estreptomicina y diluirlo en
5mL de agua bidestilada estéril. Distribuir en alícuotas y congelar.
14. Antibiótico Kanamicina: pesar 1 g de kanamicina y disolverlo en 5 mL de agua
bidestilada esteril. Anadir 0.5 mL de esta solución a cada litro de medio de cultivo.
15. Antibiotico Neomicina: pesar 0.5g de sulfato de neomicina y disolverlo en 5mL de
agua bidestilada esteril. Anadir a 1 mL de esta solución, 13 mL de agua bidestilada y se
distribuye en alícuotas de 1 mL yse congela.
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16. Antimicotico Nistatina o Micostatin: disolver una ampolleta en 10mL de agua
bidestilada esteril. Colocar 0.05 mL por cada 100 mL de medio de cultivo.
sulfato de vinblastina 1ug-mL
17. Tinte Acetoorceina: Solución madre: pesar 2 g de Orceina sintética y diluirlo en 90
mL de ácido acético, calentarlo hasta ebullición ydejar enfriar yfiltrar.
18. Solución de trabajo de tinte acetoorceina: diluir 45 mL de solución madre de
acetoorceina en 55 mL de agua bidestilada yfiltrar.
19. Tinte Giemsa. Se da detalle de su preparación más adelante.
20. Tinte -Reactivo de Feulgen: no ha sido solicitado, pero sirve para la coloración de
los cromosomas por un tiempo máximo de 30 minutos en oscuridad y calentando
cuando fuera necesario (color rojo purpúreo).
21. Frasco medio de cultivo Kariotipin de 100 mL PB-MAX KeRY0TY NG
22. Frasco medio de cultivo Amniomax de 100 ml
23. Frasco Colcemid de 10 mL
24. Para sellar placas se usa esmalte de uñas o Euparal para una mayor preservación
de la muestra.
Preparación de solución madre de tinte Giemsa:
Pesar 7.5 g de polvo Giemsa, medir 650 mL de metanol y 350 mL de glicerina,
para hacer un volumen final de 1000 mL. Otro protocolo sugiere esta preparación:
pesar 600 mg (0.6 g) de colorante Giemsa en polvo, medir 500 mL de metanol y
50 mL de glicerina.
" Colocar el polvo de Giemsa pesado en un vaso químico grande de 500 mL y
agregar una pequeña cantidad de la glicerina medida y mezclar muy bien. Verter
esta mezcla en un frasco limpio color ambar.
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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO YREACTIVOS
" El resto de la glicerina se coloca en el vaso químico para terminar de mezclar bien
conel tinte Piensa y limpiar el resto de colorante que haya quedado a las paredes
del vaso yechar al mismo frasco.
" El frasco se tapa y se calienta en bano maria a 55°C por 2 horas. Agitar
frecuentemente el frasco cada media hora.
Posteriormente dejar enfriar la mezcla del frasco.
Añadir un poco del metanol medido al vaso químico para terminar de lavar lo que
quedo del colorante y pasarlo al frasco junto con la mezcla calentada.
" Añadir el resto del alcohol al frasco con el tinte.
Dejar reposar esta mezcla por dos semanas.
Para prepara la solución de trabajo del tinte Giemsa, se debe filtrar primero el tinte
Giemsa. Es bueno tener alícuotas en pequeños frascos color ambar para evitar
contaminación del frasco de solución madre.
Solución de Trabajo de Tinte Giemsa:
Medir 2mL de solución madre filtrada y mezclarlo con 6 mL de solución buffer
descrita en el punto 10. Agitar bien esta mezcla. Otros protocolos para diluir el
tinte es en una proporción 1 en 10 mL= 1parte del tinte y 9 partes del buffer.
Colocar esta solución de trabajo en un coplin para tinción.
Otro forma de preparar el buffer para diluir el tinte Giemsa es: pesar 6,77 g de fosfato
de sodio anhidro y 2.59 g de fosfato dihidrogeno de potasioy diluirlo en 1000 mL de
agua destilada.
Mis ANOTACIONES DE ESTA EXPERIENCIA...
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PREGUNTAS DE EVALUACIÓN
1. ¿Para qué se utiliza la solución de Colcemid?
2. Investigar la utilidad de la Solución Fijadora de Carnoy y función de cada uno
de sus componentes.
3. Investigar la utilidad de las soluciones hipotónicas.
4. ¿Cuál es el objetivo principal de una hidrólisis o maceración? (hidrólisis
acida).
5. ¿Cuál es la importancia de teñir con tinte Giemsa a nivel molecular?
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