UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
ANÁLISIS INSTRUMENTAL PARA FARMACÉUTICOS
TÍTULO
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE LAS
ESPECIES VEGETALES
DOCENTE: DORA ENITH GARCÍA DE SOTERO
GRUPO: ASTRAZENECA
INTEGRANTES:
- MOZOMBITE RUIZ RUSBEL DANIEL
- REÁTEGUI CHARPENTIER DARLENE XIOMARA
- SAAVEDRA CHARPENTIER STEPHANY KATHERINE
- TORRES VARGAS HEYDI DE JESÚS
- ZARBE MACEDO JOSÉ
IQUITOS – PERU
2022
INTRODUCCIÓN
Los procesos de separación de proteínas están dominados principalmente por la cromatografía
de líquidos (CL). La resolución de mezclas proteicas por CL se basa en el principio de que, bajo
un conjunto dado de condiciones, los solutos disueltos en una fase móvil interactúan en grado
diferente con la fase estacionaria contenida en la columna. El tipo de interacción depende de
las propiedades físicas y químicas de la fase estacionaria. De esta manera, la CL explota las
diferencias inherentes entre las proteínas (e.g., tamaño, hidrofobicidad, especificidad de unión
y de carga) con el fin de lograr su separación (Cummings y col., 2011).
En base a lo anterior, las técnicas de cromatografía de líquidos pueden estar clasificadas en
cromatografía de: exclusión (Size Exclusión Cromatography, SEC) o filtración en gel,
intercambio iónico (Ión Exchange Chromatography, IEC), interacción hidrofóbica (Hydrophobic
Interaction Chromatography, HIC) y fase reversa (Reverse Phase Chromatography, RPC). En SEC
la separación se lleva a cabo por la inclusión o exclusión de las proteínas en una fase
estacionaria porosa (con cavidades de tamaño y distribución definidas), tradicionalmente se
dice que dicha separación es debida al tamaño o peso molecular de la molécula (Irvine 1997).
Cuando la ´ separación es en base a la carga de las proteínas, se utiliza IEC (Cummins y col.,
2011); mientras que las separaciones que se llevan a cabo mediante interacciones hidrofóbicas
entre la fase estacionaria, la fase móvil y las proteínas se realizan utilizando HIC y/o RPC
JUSTIFICACIÓN
Técnicas cromatográficas utilizadas en la separación de proteínas
1. Cromatografía de exclusión molecular
La cromatografía de exclusión molecular (Size Exclusion Chromatography, SEC) es el nombre
general para los procesos de separación de biomoléculas de acuerdo a su tamaño cuando una
solución fluye a través de una cama empacada con un medio poroso (Irvine 1997; Kostanski y
col., 2004). Para la separación en SEC, se utilizan las propiedades de tamiz molecular de una
variedad de materiales porosos. El proceso de separación depende del tamaño y el volumen
hidrodinámico (volumen que ocupa una molécula en solución), el cual define la capacidad de la
molécula de penetrar o no en los poros de la fase estacionaria. De tal forma que, las moléculas
de alto peso molecular son excluidas de los poros debido a un efecto estérico y pasan
rápidamente a través de la matriz. En el caso de biomoléculas pequeñas, estas tienen diferente
accesibilidad en las cavidades de la matriz porosa.
2. Cromatografia de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico (Ion Exchange Chromatography, IEC) separa las
moléculas en base a su carga iónica neta. La separación se lleva a cabo por la competencia
entre proteínas con diferente carga superficial por grupos cargados opuestamente sobre un
adsorbente o una matriz de intercambio iónico. Actualmente, IEC es una de las técnicas de
purificación de proteínas más usadas. En una separación utilizando IEC, las interacciones
hidrofóbicas reversibles entre los solutos son controladas con el objetivo de favorecer la unión
o elución de moléculas específicas logrando su separación. Una proteína que no tiene carga
neta a un pH equivalente a su punto isoeléctrico (pI) no podrá interactuar con la matriz o fase
estacionaria ´ cargada (ver Fig. 2). Sin embargo, a un pH por encima de su punto isoeléctrico
una proteína podrá ligarse a una matriz cargada positivamente o intercambiador aniónico
mientras que, a un pH por debajo de su pI, una proteína podrá unirse a una matriz cargada
negativamente o intercambiador catiónico (Handbook GEa 2004; Cummins y col., 2011).
Dichos intercambiadores existen en estado de equilibrio entre la fase móvil y la fase
estacionaria, dando lugar a dos tipos de IEC, llamados aniónico y catiónico, tal y como se
muestra en la Fig. 3. La matriz ´ intercambiadora puede incluir protones (H+), grupos hidroxilo
(OH−), iones monoatómicos cargados (Na +, K +, Cl−), iones monoatómicos doblemente
cargados (Ca2+, Mg2+) e iones poliatómicos inorgánicos (SO2− 4, PO3− 4), además de bases
orgánicas (NR 3H +) y ácidos (R-COO−) (Cummins y col., 2011).
3. Cromatografía de interacción hidrofóbica
La cromatografía de interacción hidrofóbica (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) es
uno de los métodos de purificación de macromoléculas biológicas más utilizado,
especialmente para proteínas terapéuticas (Lienqueo ´ y col., 2007; Mahn y col., 2005). Los
mecanismos de adsorción en el cual están basados las interacciones hidrofóbicas de las
moléculas con la fase estacionaria fueron primeramente demostrados por Tiselius en 1940
(Porath 1987).
La HIC explota la interacción reversible entre la superficie hidrofóbica de una proteína y una
matriz cromatográfica con un ligando hidrofóbico a moderadamente altas concentraciones de
sal, como el sulfato de amonio. Este tipo de sales tiene alta polaridad y se unen fuertemente al
agua, lo cual induce la exclusión del agua sobre la proteína y la superficie del ligando lo que
promueve las interacciones hidrofóbicas y la precipitación de la ´ proteína (salting-out)
(Lienqueo y col., 2007; Xia y col., 2004)
Aplicación de técnicas cromatográficas a estudios de cambios conformacionales,
estabilidad y relegamiento de proteínas
Desde la aprobación del uso terapéutico de la insulina humana recombinante en el año 1982,
que marco el comienzo de la era de los productos biofarmacéuticos, muchos productos
proteicos han demostrado ser eficaces y seguros para el tratamiento de numerosas
enfermedades (Gaberc-Porekar y col., 2008; Jevsevar y col., 2010). Sin embargo, este tipo de
fármacos tienen serios problemas de estabilidad. Mientras que su actividad biológica reside ´
en parte en la estructura primaria de la proteína, en la mayoría de los casos el estado funcional
(nativo) es debido a su configuración tridimensional específica. Actualmente existen diferentes
métodos analíticos para detectar y cuantificar cambios en la estructura terciaria de proteínas
por espectroscopia o fluorescencia. Estos cambios de la estructura terciaria pueden ser
conformacionales y/o de desnaturalización y pueden conducir a la perdida de la actividad ´
biológica. Además de las técnicas espectroscópicas, la cromatografía de líquidos también
puede ser utilizada ´ para estos fines ya que permite detectar cambios.
Otra de las aplicaciones de la cromatografía en los últimos años es el relegamiento de
proteínas recombinantes (Gu y col., 2001). Las proteínas recombinantes son frecuentemente
expresadas en cuerpos de inclusión que no tienen la actividad biológica deseada, por lo que
tienen que ser replegados para recuperar su actividad. Las ventajas del relegamiento
cromatográfico son que:
1. existen diferentes modos de operación dependiendo de la técnica cromatográfica
utilizada
2. el relegamiento simultaneo y la purificación de las proteínas correctamente plegadas de
las que no lo están, puede eliminar el proceso de purificación adicional después del
relegamiento
3) las proteínas ligadas a la fase estacionaria reducen la posibilidad de que choquen entre
sí durante el repliegue, lo que se traduce en la disminución de la formación de agregados
4) debido a que los sistemas cromatográficos están ampliamente caracterizados es más
fácil instalarlos, automatizarlos ´ y escalarlos (Hwang y col., 2010).
CONCLUSIONES
Es evidente que la cromatografía es un poderoso método de separación y análisis de proteínas.
Las técnicas cromatográficas pueden llevarse a cabo por diferentes mecanismos como son:
absorción continua, adsorción, partición e intercambio iónico. Son claras sus ventajas en la
purificación de proteínas, particularmente las de interés farmacéutico. La cromatografía ha
sido utilizada con éxito para determinar cambios conformacionales y estabilidad en proteínas,
que además pueden ser correlacionados con los métodos tradicionales; como fluorescencia. ´
Una de las aplicaciones que ha cobrado relevancia en la última década es el relegamiento de
proteínas, en donde se ha demostrado que el proceso puede ser mucho más efectivo que
cuando se utilizan otros métodos (e.g. diálisis y dilución). Además, es posible realizar el
relegamiento y el proceso de purificación de manera simultánea. Sin embargo, es importante
considerar que la versatilidad de las técnicas cromatográficas genera un sinnúmero de
condiciones experimentales, que pueden depender de las características de cada proteína. Es
por ello que se identifica como un área de oportunidad la posibilidad de establecer procesos
generales para el análisis de los ´ cambios conformacionales y estabilidad de proteínas.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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