CURSO: MICROBIOLOGÍA – FACI/ESBI Dr.
CÉSAR JULIO CÁCEDA QUIROZ
PRÁCTICA 04
TÉCNICAS DE SIEMBRAS - CULTIVO DE CEPAS
1. INTRODUCCIÓN
Para poder estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos
en condiciones de laboratorio y, por tanto, inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone
previamente de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:
Que no exista la cantidad suficiente del microorganismo que se busca.
Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, parte de los cuales son contaminantes,
haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros
Generalmente los procesos infecciosos son producidos por un agente causal, sin embargo, es fácil que
puedan proliferar en esas condiciones otros microorganismos oportunistas o incluso contaminantes. De
ahí que una forma de evitar estos errores sea aislarlos inicialmente y posteriormente identificarlos.
2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIÓN
Existen los siguientes materiales:
Asas de siembra. El asa de siembra es utilizada para la inoculación o siembra por estría en medios
sólidos, por picadura en medios sólidos y semisólidos y para la siembra de medios líquidos. Estas
asas se llaman también de platino porque con este material se fabricaron por primera vez, aunque en
la actualidad no se suelen utilizar. Éstas han sido sustituidas por asas de acero inoxidable o cromo-
níquel. Presentan un arco bastante cerrado en su extremo, cuyo diámetro es más o menos específico,
es decir, muchas de las asas son calibradas correspondiendo a un volumen determinado de siembra.
Las más utilizadas son la de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
Hilos de platino. Son similares a las asas con la diferencia de no presentar el arco en su extremo,
únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semisólidos y sólidos.
Asas de Digrasky. Son asas de vidrio con forma de triángulo más o menos abierto. Se utilizan para
extender el inóculo líquido previamente adicionado en la placa, por ejemplo, a través de pipeta
Pasteur. Se esterilizan en horno o en autoclave, aunque generalmente se puede hacer
introduciéndola en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.
Hisopos. Se utilizan para la toma de muestras e incluso, en muchos casos, llevan un medio de
transporte incorporado que permite transportar la muestra sin que ésta sufra ninguna desecación,
deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio de cultivo,
listo para utilizar y son desechables.
Pipetas. Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables
por esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen
volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para pipetas tipo
pera o pro pipetas, pipetas Pasteur (no contienen volúmenes graduados), muy utilizadas
en bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma que no tienen porque ser
necesariamente estériles, aunque si la pipeta, también hay micropipetas utilizadas para la siembra de
mililitros y microlitros en un determinado medio de cultivo.
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3. PREPARACIÓN DE INÓCULOS
Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microrganismos problema. Así pues,
se debe partir, por un lado, de un cultivo puro y, por otro, de una concentración adecuada de
microrganismos problema.
Si la muestra no es pura se aplicarán distintos métodos para el aislamiento mediante técnicas específicas,
como es el caso de la siembra por estría en placa o por agotamiento, o la técnica de la placa invertida, que
en general va a permitir el crecimiento más o menos separado de los microrganismos. Es igualmente útil
utilizar medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que permiten el crecimiento del tipo de
microorganismo concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura
puede ser aislada y desarrollada como cultivo puro.
Si el problema está en la cantidad de microorganismo, que no es suficiente, será necesario preparar un
inóculo con el fin de obtener una cantidad microbiana suficiente y representativa para obtener resultados
fiables.
3.1. MÉTODOS DE PREPRARACIÓN DE INÓCULOS
Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra estéril. Si la muestra
es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta Pasteur estéril en cantidad suficiente y, en
ambos casos, se homogeneizará posteriormente en el medio específico de cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona en un medio líquido se
homogeneizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para
microorganismos patógenos coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos crecer
aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesario la utilización de un
rotavapor para que el crecimiento se restablezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto
va a depender de su aplicación posterior y de la cantidad de inóculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido se
utilizarán diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verificará el cultivo, por ejemplo,
siembra por agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y se adiciona a un medio de cultivo
líquido, se homogeneizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer a una temperatura
adecuada (unos 37 °C) en un tiempo aproximado de 24 horas. Es importante que los inóculos
sean siempre jóvenes y en ocasiones excepcionales, sobre todo, si se necesita de mucha cantidad
de inóculo, se podría utilizar rotavapor.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y ésta se añade al medio sólido,
posteriormente se extenderá con el asa Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa
incubándose a la temperatura adecuada durante aproximadamente unas 24 horas. Se requerirán
también cultivos jóvenes.
Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o, incluso, caldo de
cultivo base. A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximado de
microrganismos problema. En estos casos, los inóculos se establecen en medios líquidos y el
número de microrganismos se recuenta de forma aproximada por comparación de medios líquidos
con diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la Escala de Mc-Farland formada por una
batería de tubos cada una de las cuales tienen distinta turbidez según la concentración de Sulfato
bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos.
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4. Métodos de inoculación o siembra (métodos de aislamiento)
El paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea líquido o sólido, se denomina
siembra o inoculación.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra.
Toda siembra, inoculación, o incluso resiembra, se puede realizar de diferentes formas, según las
características de la muestra, del medio en que se van a sembrar o resembrar, del tipo de material
que se utilice, etc.
A continuación, se explican los métodos más importantes de siembra o inoculación.
4.1. SIEMBRA DEL INÓCULO EN MEDIO LÍQUIDO
Si se realiza con asa de siembra, ésta se carga con una muestra problema sólido, o a veces
líquido, en condiciones de esterilidad y se adiciona al medio líquido agitándola.
Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y se vierte al medio de cultivo
líquido agitándose hasta su homogeneización.
Si se realiza con escobillón o hisopo el método es igual que con el asa de siembra.
4.2. SIEMBRA DEL INÓCULO EN MEDIO SÓLIDO
Estas siembras pueden hacerse en placa o en tubo.
4.2.1.SIEMBRA DEL INÓCULO EN PLACA
Tenemos las siguientes técnicas:
a) Técnica de Barry
Siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello en el medio de cultivo previamente
fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a una temperatura de 45 a 50 °C) en tubo, se adicionará
la cantidad del inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 ml y se homogeneiza la muestra en el tubo
mediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y
se dejara solidificar. La mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la
homogeneización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la
determinación del CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) de un antibiótico frente a
determinados microrganismos.
Figura 1 Técnica de Barry
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b) Siembra de muestra líquida en placa con asa de Digralsky
Consiste en adicionar al medio sólido un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 mililitro según
los casos, con pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende con el asa Digralsky
también estéril. Esta técnica se suele utilizar para el recuento de viables, antibiogramas, etc.
Figura 2: Siembra de muestra liquida en placa
c) Siembra por agotamiento o aislamiento en estría
Se tomará con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad
adecuada de muestra problema depositando el inóculo en unos de los extremos superiores de
la placa, a partir de aquí se realizarán movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa
no tomándose en ningún momento nuevo inóculo y no levantándose el asa hasta concluir la
siembra de toda la placa.
Figura 3: Siembra por agotamiento o aislamiento en estría
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d) Siembra por agotamiento o estría múltiple:
Aislamiento en estría múltiple. Se tomará muestra problema con asa de siembra previamente
estéril y dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un
extremo a otro de ésta, sólo en la parte superior. Se flamea el asa de platino y se gira
ligeramente dicha placa repitiendo el proceso anterior que permitirá arrastrar la muestra desde
uno de los bordes donde quedó la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se
vuelve de nuevo a flamear el asa de platino sin coger muestra como en el caso anterior y
siguiendo la misma dirección y se repite la operación hasta un total de 4 ó 5 veces, que son las
que tiene cabida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se
efectuará hacia el interior de la misma. El resultado son colonias cada vez más separadas
como consecuencia de que cada vez se va arrastrando y separando más la muestra. Es
importante que para separar estas colonias se realice en cada estría un flameado previo del
asa de siembra.
Figura 4. Siembra por agotamiento o estría múltiple
e) Técnica de los cuatro cuadrantes
Con un rotulador, por ejemplo, para vidrio, en la base de la placa (reverso) se dibujan dos
líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa de tal forma que quede
está dividida en 4 cuadrantes iguales. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de
inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por
todo ese cuadrante en forma de zig-zag. Se realizará la misma operación sin flamear en todos
los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el
microorganismo problema, observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o
separadas.
Figura 5. Técnica de los cuatro cuadrantes
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f) Técnica de los tres giros
Se rotula la placa de forma análoga al caso anterior. Se toma el inóculo con el asa de platino y
se siembra por estría la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino se girará la
placa unos 90° y se volverá a sembrar una segunda vez. Así sucesivamente hasta completar
toda la siembra (girando de nuevo la placa 90°). Esta técnica no es muy utilizada porque no
permite buenos aislamientos.
Figura 6: Técnica de los tres giros
g) Técnica de siembra por dilución
Se dispondrá de una batería de tubos con medio de cultivo específico o agua estéril según los
casos. Se adicionará una cantidad de muestra sólida o líquida en los tubos sabiendo la
cantidad de muestra o inóculo que se añade en el tubo inicial. Se agitará hasta
homogeneización. Con pipeta estéril se tomará una cantidad específica o exacta y se
adicionará al segundo tubo, que se homogeneiza. Repetir la operación anterior con el tercer
tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada. Con la dilución esperada, por
ejemplo 10-3 y 10-4, inocular en placas de cultivo una cantidad de inoculo exacto y extender con
asa Digrasky previamente estéril. Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y
posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo
en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta
obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.
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Figura 7: Técnica de siembra por dilución
4.2.2. SIEMBRA DEL INÓCULO EN TUBO
a) Siembra por estría en tubos con medio sólido inclinado
Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra
adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de éste, realizando movimientos
ascendentes en zig-zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado
para conservar cepas durante largos periodos, así como para la realización de ciertas pruebas
bioquímicas, como, por ejemplo, la prueba de la ureasa.
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Figura 8: Siembra de inoculo en tubo con medio solido inclinado
b) Siembra por picadura
Se suelen tomar con hilo de siembra, aunque en algunas ocasiones también puede hacerse
con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el
tubo hasta el fondo de este y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de
medios de cultivo semisólidos como por ejemplo, el medio de oxidación fermentación de Hugh-
Leiffson.
Fig. 9. Siembra por picadura
c) Siembra por picadura y estría
Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este método se lleva a
cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y
posteriormente la siembra por estría; son ejemplos de este tipo de siembra la prueba en medio
KIA y la prueba en medio Citrato de Simmons, entre otras .
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Figura 10: Siembra por picadura y estría
5. CULTIVO DE CEPAS
Tras la preparación de un inóculo y posterior inoculación en el adecuado medio de cultivo se requiere
una serie de condiciones para que la siembra pueda desarrollarse y realizar posteriormente los
oportunos estudios cualitativos y cuantitativos del microorganismo problema. Así pues, de acuerdo con
lo dicho, todo cultivo de cepas para poder crecer como tal, requerirá de una serie de condiciones
adecuadas, que serán las siguientes:
Temperatura adecuada. En general muchas de las bacterias, especialmente las patógenas,
suelen crecer a temperaturas de 35 – 37 °C. Estas temperaturas se podrán establecer de modo
continuo en la siembra deseada gracias a las estufas de cultivo o incubadoras, que controlan de
forma constante una determinada temperatura.
Condiciones de esterilidad. Para evitar el crecimiento de otros microorganismos que pudieran
interferir cualquier tipo de determinación en el germen problema es necesario trabajar en
condiciones de esterilidad. Para ello se requiere de medios cerrados, tales como los tubos con
tapones de cierre hermético o algodón graso o también las placas Petri diseñadas para
mantenerse completamente cerradas y mantener la esterilidad a la que se le somete. Incluso
matraces o botellas con cierres herméticos.
Cantidad suficiente de oxígeno. Si el microorganismo problema es aerobio, cantidad
suficiente de dióxido de carbono o crear ambientes microaerofilos si el microorganismo es
anaerobio facultativo y crear una atmosfera ausente de oxigeno si la bacteria es anaerobia. Estas
condiciones serán en cada caso variables según el tipo de metabolismo oxidativo (característico
de bacterias aerobias) y/o metabolismo fermentativo (característico de bacterias anaerobias
facultativas) del microorganismo problema.
Para mantener estas condiciones en los medios de cultivo que permitan un normal y adecuado
crecimiento será además importante tener en cuenta como medida de trabajo:
Evitar la apertura de los medios de cultivo, sobre todo, en el periodo de incubación. Se abrirán sólo
cuando sea estrictamente necesario.
Controlar la temperatura de las estufas de cultivo, ya que cualquier variación de éstas impedirá el
crecimiento de la siembra.
Verificar las condiciones adecuadas de oxígeno y/o dióxido de carbono, según los casos.
Rotular adecuadamente los medios, el día y hora en que se efectuó la siembra para evitar errores
y garantizar un análisis fiable.
mayo/2023
