Microscopia de
fluorescencia
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
CORREA ZENON JUAN ALEJANDRO.
CRUZ DIONISIO JOSÉ JAVIER.
GUÍA ZARATE JOSUÉ ULISES.
VELÁZQUEZ OLVERA BRANDON EMMANUEL.
¿QUÉ ES LA FLUORESCENCIA?
Es un fenómeno físico por el cual ciertas moléculas (fluorocromos)
emiten luminiscencia tras ser excitadas previamente por un haz de
luz de una determinada longitud de onda.
Tipos de microscopios
Existen 2 tipos principalmente:
Confocal
Convencional
ELEMENTOS Y FUNCIONAMIENTO BASICO
1. La fuente de excitación: emite un haz de fotones a una
determinada longitud de onda.
Las fuentes de excitación más comunes son:
Las fuentes de excitación más comunes son:
Lamparas de mercurio
Lámparas de xenon
Láseres
ELEMENTOS Y FUNCIONAMIENTO BASICO
2. El haz de excitación llega al filtro de excitación, que deja pasar
únicamente los rayos con una longitud de onda determinada.
Existen 3 tipos de filtros de excitación:
Filtros Short Pass: dejan pasar el espectro por debajo de un
valor determinado de longitud de onda y bloquea lo que está
por encima.
Filtros Long Pass: dejan pasar el espectro por encima de un
valor determinado y bloquea lo que está por debajo.
Filtros Band Pass: dejan pasar una banda determinada del
espectro y bloquea el resto por encima y por debajo.
ELEMENTOS Y FUNCIONAMIENTO BASICO
3. La luz filtrada impacta sobre el espejo dicroico y es reflectada
hacia los objetivos, los cuales concentran el haz de luz sobre la
muestra de estudio.
ELEMENTOS Y FUNCIONAMIENTO BASICO
4. Al ser excitada la muestra, los fluorocromos emiten fluorescencia,
que al ser de una longitud de onda mayor a la presente en la
fuente de excitación puede atravesar el espejo dicroico y dirigirse
hacia el filtro de emisión.
Los filtros de emisión son filtros Band Pass que dejan pasar
únicamente la fluorescencia emitida por la muestra
ELEMENTOS Y FUNCIONAMIENTO BASICO
5. La fluorescencia de la muestra filtrada choca contra un prisma
que proyecta la luz hacia los sistemas de detección del
microscopio (cámaras, fotomultiplicadores), haciendo posible su
visualización por el investigador.
Filtro de
excitación
Fuente de excitación
Espejo
dicroico
Filtro de
emisión
ESPECTRO DE LUZ VISIBLE
La luz visible, las ondas, las microondas, la luz
UV y los rayos X son distintas formas de
radiación electromagnética.
Se mide en longitudes de onda.
La luz visible se irradia entre los 400 y 700nm.
La luz UV se encuentra entre los 10 a 400nm.
FLUORESCENSCIA INDUCIDA POR LUZ UV
Fluorescencia
Es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a radiaciones de
baja longitud de onda y alta energía (UV– Rx). Las radiaciones absorbidas (invisibles
al ojo), son transformadas en luz visible.
Fluorócromo: molécula capaz de absorber y
emitir fotones de menor energía.
Primarios(intrínsecos)/ secundarios(extrínsecos)
Fluoróforo y Cromóforo: grupos funcionales de la
molécula responsables de la absorción y emisión.
FLUORÓCROMOS
FLUOROCROMOS
Moléculas capaces de absorber fotones y
emitir fotones de menor energía
ALEXAFLOUR
YODURO DE PROPIDIO
SYTO 9
DIACETATO DE CARBOXY FLUORESCEINA
ALEXA FLOUR
Usados para marcaje de celulas y tejidos en biologia celular
caracteristicas:
El espectro de exitacion y emision cubre todo el espectro de luz
visible y se extiende hasta el infrarrojo
los miembros de la familia Alexa están enumerados de acuerdo a la
excitación máxima
estables brillan baja sensibilidad al pH
YODURO DE PROPIDIO
No permeable a las células vivas, porque detecta células muertas
Se une al ADN intercalándose entre las bases
SYTO 9 Y DIACETATO DE CARBOXYFLUORESCEINA
Permeable membranas celulares procariotas y eucariotas
Alta afinidad por el ADN
utilizado para diferenciar células vivas y muertas
Aplicaciones del microscopio
de florecencia
Son numerosas las aplicaciones de la
microscopía de fluorescencia, notablemente
en biología y medicina:
• Marcaje de moléculas en células y tejidos
para su caracterización e identificación.
• Estudio de células normales y patológicas.
• Estudios inmunológicos.
• Mineralogía.
Empleo de doble marcaje de fluorescencia
para la vigilancia de fenómenos dinámicos
dentro de los organelos celulares de células
vivas
Micrografias de células en
división, tomadas con un
microscopio de
fluorescencia.
Estudio de células normales
y patológicas
Identificación de nuevos
moduladores de metástasis
y mal pronóstico en el
melanoma: Visualización de
la proteína p62 (rojo)
mediante microscopía de
fluorescencia en células de
melanoma.
Estudios inmunológicos.
La inmunofluorescencia (IF)
es una técnica utilizada
para visualizar una proteína
de interés en su contexto
celular. Se basa en la
tinción de células con
anticuerpos generados
contra una proteína diana
que se conjuga
directamente con un
fluorocromo o se usa junto
a un anticuerpo secundario
conjugados.
Mineralogía
