IBT504-5
Procedimientos de Biología Molecular
Nombre: Geoconda Cañizares
Fecha de entrega: 12/10/2018
Resumen 1
Aislamiento y cuantificación de ácidos nucleicos
La doble cadena de ADN es un químico inerte de gran importancia ya que tiene mayor
resistencia que otros componentes intracelulares en situaciones adversas como las escenas de
crímenes y restos fósiles. Esta durabilidad química provee bancos genómicos de mucho valor,
por ende, facilita la ingeniería genética y proyectos de secuenciación grandes y pequeños.
Aislamiento del ADN
La purificación del ADN es la clave para una clonación exitosa, mientras más pura sea la
preparación final del ADN serán más eficientes las reacciones enzimáticas que emplean el ADN
como un sustrato. Existen métodos para extraer ADN de las células y remover constituyentes
celulares que actúan como competidores en las reacciones de catálisis enzimática,
generalmente estos procedimientos tienen 3 pasos principales: 1) lisis de las células
hospederas mediante detergentes iónicos, agentes caotrópicos y sales combinadas con
detergentes. 2) liberación de ADN celular, desprendimiento de proteínas y rápida inactivación
de las nucleasas intracelulares como la digestión enzimática de proteínas y ARN o la remoción
de proteínas de las soluciones de ADN mediante una lisis con solventes orgánicos como el
cloroformo. 3) Remoción de sales mediante la precipitación del ADN con etanol o isopropanol.
Durante la lisis, las proteínas bacterianas rompen las paredes celulares y desnaturalizan el ADN
cromosomal y llegan a estar atrapadas en largos complejos con dodecil sulfato, los mismos que
pueden ser precipitados eficientemente de la solución para reemplazar los iones sodio con los
iones potasio; después el material desnaturalizado tiene que ser removido a través de una
centrifugación y el plásmido de ADN nativo pueda ser recuperado del sobrenadante.
Kits comerciales para la purificación del ADN
A los antiguos métodos de purificación se les han incorporado estos kits que son sumamente
viables debido a su rapidez y facilidad de uso, el rendimiento de resultados puede ser
reproducido y vienen con instrucciones simples pero claras. Proveen beneficios como el
promover una base estable de alta confianza para el uso de técnicas automatizadas, esto
facilita el acceso al campo de clonación molecular, también se usan como herramientas para el
crecimiento del estudio genético. Estos kits tienen membranas de sílica, e instrucciones de
lavado para eliminar contaminantes. El ADN es eluído usando buffers que contienen solventes
volátiles como etanol. Existen algunos tipos de kits, algunos, dependiendo de la matriz de
sílica, la elución del ADN puede ser bajo gravedad o tras la aceleración de las revoluciones en la
centrifugadora.
Aislamiento de ADN de alto peso molecular
El ADN genómico purificado mediante el uso de kits es adecuado en cierta medida para su uso
en PCR. Las cadenas de ADN mayores de 200 kb se obtienen al lisar células cultivadas con
fuertes proteasas como la proteinasa K; después se limpian con solventes orgánicos y se
remueven los contaminantes con concentraciones iónicas. Esto ha sido empleado para la
construcción de la línea evolutiva eucariota. Es indispensable tener cuidado al trabajar con
largas cadenas de ADN porque son frágiles y se rompen al ser pipeteadas con fuerza, vórtex y el
uso de etanol; además siempre se deben eliminar las ADNasas. La extracción también puede
dañarse durante la Electroforesis, la muestra debe ser colocada cuidadosamente en el gel de
agarosa; además, las enzimas que son utilizadas no deberían destruir al ADN, solamente
inmovilizar a las células.
Cuantificación del ADN
Espectroscopia UV: la absorbancia es medida en un espectrofotómetro, este es sensible a
ciertos interferentes como una cadena simple de ADN, ARN, proteínas, nucleótidos,
componentes aromáticos conteniendo anillos fenólicos y solución de partículas. La absorbancia
medida entre 230 a 320 nm es un indicador de pureza; los 230nm miden sales de Guanidina
que son absorbidas fuertemente, a 280nm se absorben los aminoácidos aromáticos como
triptófano y tirosina, por último, a los 320nm se mide la absorción de largas longitudes de onda
lo que significa problemas de turbidez. El coeficiente de absorbancia resultante entre la
división de las lecturas a 260/280 debe estar entre 1,7 y 2 para que sea eficiente la extracción.
Fluorometría: es un método de análisis que utiliza tintes para cuantificación de ADN, que se
mide mediante una espectroscopía con cualquiera de los colorantes mencionados a
continuación: Bromuro de etidio, Hoechst 33285, SYBR Green I, SYBR Green II, SYBR Gold,
PicoGreen. Para eliminar los tintes del ADN se realiza una precipitación con etanol.
Referencias:
Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4° Ed.), Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
