CARRERA(S): Medicina Humana
PRÁCTICA DE LABORATORIO
CURSO: Bioquímica
DOCENTE: Quispe Martinez,Sandra Cristel
INFORME DE PRÁCTICA
N° PRÁCTICA: 1
TÍTULO: Espectrofotometría
INTEGRANTES:
● Camasi Curo, Evelin Sandra - 100115900@[Link] - 100%
● Bendezú Ochoa, Josué Alessandro - 100115557@[Link] - 100%
● Huayta Diaz, Gonzalo Rodrigo - 100090698@[Link] - 100%
● Quispe Colmenares, Celeste Julieta - 100084801@[Link] - 100%
HORARIO DE PRÁCTICA
FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 30/08/23
FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 01/09/23
2023 - ll
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ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………3
II. OBJETIVO (S)......................................................................................6
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL……………………………………..7
IV. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………… 9
V. RESULTADOS……………………………………………………………..11
VI. DISCUSIÓN………………………………………………………………...14
VII. CONCLUSIONES………………………………………………………….16
VIII. RECOMENDACIONES………………………………………………… 17
IX. ANEXOS……………………………………………………………………18
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………20
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I.- INTRODUCCIÓN:
La luz es una fuente principal energética en el cual, en ella,
encontramos energía esencial para diversos procesos metabólicos
como la fotosíntesis en las plantas por ejemplo. Según Darwin A.
León-Figueroa “El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula
requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su
determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización
físico-química y biológica” [3]. La espectrofotometría forma parte de
aquel pilar en donde se pueden obtener ciertos datos estadísticos
respecto al tema a hablar el día de hoy, su implicancia constituye a la
investigación científica de acuerdo a calcular el nivel de absorbancia
en soluciones acuosas. Por ello, se pone hincapié sobre los principales
usos que presenta, puesto que, es una herramienta que se utiliza en
diferentes disciplinas y que necesita ser utilizada según el tipo de
espectro de luz que necesita ser medido.
ABSORBANCIA:
Los rayos de luz que van pasando a nuestro alrededor tienden a tener
energía luminosa en ellos, por el cual pueden ser transmitidos hacia
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otros objetos, esto igual pasa en el espectrofotómetro trayendo como
consecuencia la medición de la absorbancia dependiendo de la
cantidad de muestra que haya.
LEY DE LAMBERT Y BEER:
Según Yojani S. “Se relaciona la absorción de luz con las propiedades
del material atravesado” [2]. Esta ley viene de Lambert (recorrido de la
distancia de la luz) y beer (concentración).
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CURVA DE CALIBRACIÓN:
Para la obtención de una curva de calibrado de un compuesto se
preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo,
determinando para cada una de ellas el valor de absorbancia a λmax.
Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas
(eje de x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se
observará que, a bajas concentraciones, el aumento de concentración
se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de
cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la
linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las
medidas son poco fiables.
Il.- OBJETIVOS:
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● Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro.
● Aplicar la Ley de Lambert – Beer en el empleo del espectrofotómetro.
● Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul de metileno.
● Aplicar el espectrofotómetro para medir los niveles de absorbancia en cada
muestra.
III.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
● Para determinar la longitud de onda óptima de la solución del azul de
metileno a través de un gráfico de espectro de absorción.
● Para elaborar una curva de espectro de absorción, se siguió los siguientes
pasos:
1. Colocamos los volúmenes de los reactivos mencionados en un tubo de
ensayo de 13 x 100 mm
2. Solución de azul de metileno 1 mg/dL - 1 mL
3. Agua destilada 4 mL
4. Para la medición de los volúmenes usamos pipetas volumétricas de 5 mL con
propipetas o micropipetas de 100-100 uL.
5. Luego, se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las
siguientes longitudes de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm.
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6. Graficamos utilizando papel milimetrado las absorbancias en función de las
longitudes de onda y determinar el pico de máxima absorción de azul de
metileno, el cual corresponde al mayor valor de la absorbancia (véase en la
figura 1).
Figura 1. Espectro de absorción de la solución de azul de metileno a 1 mg/dL
● Procedimiento experimental para determinar la concentración de diferentes
patrones de la solución del azul de metileno a 1 mg/dL a través de curva de
calibración. Preparamos el experimento de la siguiente manera:
Preparación de soluciones patrones diferentes concentraciones:
1. Adicionamos en diferentes tubos de ensayos de 13 x 100 mm identificados
con números arábigos (1,2,3,4,5) los volúmenes de los reactivos se
muestran a continuación:
Reactivos 1 2 3 4 5
Azul de metileno 0,5 1 2 3 4
1 mg/dL (mL)
Agua destilada 4,5 4 3 2 1
(mL)
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2. Hallamos la concentración de cada estándar preparados con la siguiente
fórmula:
C1 X V1 = C2 X V2
C1 = Concentración de la solución de azul de metileno 1 mg/dL
V1 = Volumen que se adicionó de la solución de azul de metileno 1 mg/dL
C2 = Concentración que se quiere hallar
V2 = Volumen final de la reacción (5 mL)
3. Adicionamos en cubetas de espectrofotómetro un mL de agua destilada para
ajustar el equipo de lectura a 0 absorbancia y 100% de transmitancia a 660
nm. También, en otras 5 cubetas agregamos un mL de cada una de las
soluciones patrones preparadas a la longitud de onda descrita (660 nm).
4. Graficamos en un papel milimetrado o en una hoja de cálculo de Excel los
resultados de absorbancias a 660 nm (eje Y) versus las concentraciones de
los estándares (eje X). Luego trazamos una línea.
5. Determinamos la concentración de una solución de azul de metileno que se
debe preparar 2,5 mL de la solución del azul de metileno 1 mg/dL y 2,5 mL de
agua destilada .
6. Utilizamos la curva de calibración y el factor de calibración determinará la
concentración de la solución preparada en el apartado 5.
FACTOR DE CALIBRACIÓN= CONCENTRACIÓN DEL ESTÁNDAR
—-----------------------------------------------
ABSORBANCIA A 660 nm
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IV. MATERIALES Y MÉTODOS:
● 01 gradilla.
● 06 tubos de ensayo 13x100mm.
● 01 piseta con agua destilada.
● 01 solución de azul de metileno 1 mg/dL frasco 100mL.
● 01 espectrofotómetro.
● Cubetas para espectrofotometría.
● Puntas descartables respectivas.
● 01 pipeta.
● 01 Propipeta.
Métodos utilizados:
1) Limpieza del equipo: limpiar las cubetas de muestra y cualquier otro
equipo utilizado para evitar la contaminación cruzada.
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2) Calibración del espectrofotómetro: usar las soluciones de referencia
para establecer la línea de base y asegurarse de que el instrumento
esté correctamente calibrado.
3) Preparación de las soluciones: preparar las soluciones de referencia y
las soluciones de muestra en las concentraciones deseadas.
4) Medición de la absorbancia: colocar la solución de muestra en la
cubeta de muestra y colocarla en el compartimento del
espectrofotómetro. Ajustar los parámetros del espectrofotómetro para
medir la absorbancia de la muestra a una longitud de onda específica.
5) Análisis de datos: registrar las lecturas de absorbancia y utilizar una
curva de calibración para determinar la concentración de la muestra.
6) Repetición de medidas: realizar varias mediciones de cada muestra
para asegurar una mayor precisión y reducir errores aleatorios.
V. RESULTADOS:
● Determinación de curva de calibración:
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Fuente: Elaboración propia.
● Determinación del pico de máxima absorción del azul de metileno:
Fuente: Elaboración propia.
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● Determinación de la concentración:
Fuente: Elaboración propia.
VI. DISCUSIÓN:
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Las tablas y resultados indican las lecturas del espectrofotómetro a las
longitudes de onda vistas en las clases de laboratorio del curso para el
correcto desarrollo de este informe. Para esto, es importante mencionar que
para la realización de los resultados se utilizó la aplicación de hojas de
cálculo Microsoft Excel. Las longitudes de onda analizadas en este informe
serán 560 nm, 580 nm, 600 nm, 620 nm, 640 nm, 660 nm, 680 nm y 700 nm
respectivamente.
El tema realizado en este informe juega un rol importante, ya que en el
campo de la medicina la espectrofotometría tiene una alta capacidad para
analizar sustancias biológicas y químicas en alta presión. En los diagnósticos
clínicos, se utiliza para medir concentraciones de biomoléculas en fluidos
biológicos, como la sangre y/o la orina. Midiendo así la concentración de
compuestos como colesterol , proteínas, glucosa e incluso enzimas. Por lo
que incluso, se puede realizar la Espectrofotometría de Reflexión Difusa de
una manera no invasiva (sin procedimientos dolorosos y sin muestras de
tejido) en la dermatología, por lo que en lugar de medir la luz directamente
reflejada, mide la luz que ha sido dispersada en muchas direcciones, es lo
que se conoce como reflexión difusa, ya que la piel no es una superficie
perfectamente lisa ni uniforme, y la luz dispersada proporciona información
completa sobre la composición y características de la piel, esta luz
dispersada es recogida por el espectrofotómetro y se analiza su espectro de
absorción y reflexión [7].
En la Universidad Mayor De San Andrés (La Paz - Bolivia), un estudiante
elaboró en el año 2020 un informe de Espectrofotometría en base a lo visto
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en las respectivas clases de laboratorio de química analítica cuantitativa [9].
En primer lugar, en el laboratorio a contrastar se utilizó como reactivo al
Permanganato de potasio (KMnO4), por lo que estos se diferencian
principalmente en sus propósitos y aplicaciones. El permanganato de potasio
encuentra su principal aplicación en análisis redox y titulaciones, en
contraste, el azul de metileno es un tinte empleado en diversas situaciones,
como pruebas químicas y procesos de tinción en biología. Aunque ambos
compuestos pueden resultar útiles en espectrofotometría para cuantificar
absorbancias, es fundamental destacar que las reacciones y las variaciones
de color asociadas varían sustancialmente entre ellos [5,4]. En segundo lugar,
en el informe del estudiante podemos observar que nos brinda informaciones
más detalladas acerca de la Ley de Lambert y Beer, sabiendo que estas
establecen la relación entre la absorbancia de una muestra, la concentración
de la sustancia absorbente y la longitud de la trayectoria a través de la cual
pasa la luz [2]. En tercer lugar, en el informe a contrastar se realizó un
procedimiento experimental muy extenso, ya que mencionan técnicas como
el enfriamiento y el calentamiento e incluso mencionan AgNO3 al 1%, 0.5 de
KlO4, H2SO4 y H3PO4, no obstante, no detallan de el porqué de cada
solución a verter.
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VII. CONCLUSIONES:
● Mediante la realización de esta práctica hemos profundizado nuestros
conocimientos sobre el uso y la aplicación del espectrofotómetro, puesto que
es un instrumento de uso constante en los laboratorios para la obtención de
un diagnóstico acertado.
● Teniendo en cuenta la Ley de Lambert – Beer podemos decir que es un
principio fundamental en la espectrofotometría que establece una relación
lineal entre la absorbancia de una sustancia y la concentración de soluto
presente en una muestra. Esta relación matemática, expresada como A = εcl,
donde A es la absorbancia, ε es la coeficiente de extinción molar, c es la
concentración y l es la longitud de la celda, proporciona una herramienta
esencial para cuantificar la concentración de compuestos en soluciones y
determinar su absorbancia a diferentes longitudes de onda.
● Según los resultados desarrollamos las curvas de calibración, logrando
posteriormente comprobar que la concentración y la absorbancia se
encuentran relacionadas directamente, es decir, a mayor concentración
mayor absorbancia.
● El informe realizado sobre la espectrofotometría ha demostrado los principios
fundamentales de esta técnica, así como su aplicabilidad en el análisis
cuantitativo y cualitativo de muestras. Además, se ha destacado la
importancia de la calibración de los equipos y la correcta preparación de las
muestras para obtener resultados precisos y confiables
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VIII. RECOMENDACIONES:
● En laboratorio, emplear de manera adecuada el equipo de
espectrofotometría, así como también respetar las medidas de bioseguridad
ya establecidas para la realización exitosa de un experimento de
espectrofotometría y garantizan la validez y la precisión de los resultados
obtenidos.
● Conocer adecuadamente el proceso en el cual se hace a la hora de medir
una absorbancia propiamente de nuestra solución que tengamos, saber
identificar muy bien al factor más alto ya que con ello se van a trabajar los
demás datos que al final se pondrán en un gráfico en donde nos indican los
niveles de absorbancia de distintas muestras al nivel alto hallado.
● Considerar la posibilidad de realizar mediciones espectrofotométricas a
diferentes longitudes de onda para evaluar si existen picos de absorción
adicionales que puedan brindar información adicional sobre las muestras.
● Investigar posibles aplicaciones adicionales de la espectrometría con el azul
de metileno en el campo de la bioquímica, como la determinación de
concentraciones de biomoléculas específicas o la evaluación de reacciones
químicas específicas.
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IX. ANEXOS:
(Figura 1)
Adicionando la concentración de la solución, en la cubeta del espectrofotómetro.
17
(Figura 2)
Medición de la concentración de absorbancia (determinar la concentración de una
solución de azul de metileno).
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X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. Guijarro M, Remedios M. Análisis Instrumental. Espectrometría de Absorción
Atómica (EAA). 2020 [citado el 1 de septiembre de 2023];138418. Disponible en:
[Link]
2. Konika Minolta. Espectrofotometría de Absorción vs. Rango de Espectrofotometría
Ultravioleta Visible. [Internet] [consultado el 29 de agosto del 2023]. Disponible en:
[Link]
e-espectrofotometria-ultravioleta-visible/
3. León-Figueroa DA. ESPECTROFOTOMETRÍA. ESPECTROFOTOMETRÍA
[Internet]. 2020; Disponible en:
[Link]
4. López-Salazar R, González-Cervantes G, Vázquez-Alvarado RE, Olivares-Sáenz E,
Vidales-Contreras JA, Carranza de la Rosa R, et al. Metodología para obtener ácidos
húmicos y fulvicos y su caracterización mediante espectrofotometría infrarroja. Rev
Mex De Cienc Agric [Internet]. 2014 [citado el 1 de septiembre de
2023];5(SPE8):1397–407. Disponible en:
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5. Moreno A, Figueroa D, Hormaza A. Adsorción de azul de metileno sobre cascarilla
de arroz. Prod Limpia [Internet]. 2012 [citado el 1 de septiembre de 2023];7(1):9–18.
Disponible en:
[Link]
ext.
19
6. UCO. Espectrofotometría. [Internet] [consultado el 19 de abril 2020] URL disponible:
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pdf
7. Vivas S, Pardo E, Martínez C, Álvarez I, Muñoz A. Método Diagnóstico no Invasivo
en Dermatología: Espectrofotometria de Reflexión Difusa. IM [Internet]. 2015 [citado
el 31 de agosto de 2023]; 17(2). Disponible en:
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8. Yojani S. Clase02 espectrofotometría [Internet]. [Link]. Disponible en:
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tria.
9. Informe de Espectrofotometria [Internet]. Scribd. [citado el 31 de agosto de 2023].
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20
