Capítulo I.

Las enzimas

Las puertas de la sabiduría nunca están cerradas.

Benjamin Franklin
 Capítulo I. Las enzimas

Las enzimas

Para utilizar enzimas en restauración, es necesario entender qué son, cómo

funcionan, en qué condiciones, etc. Sin estos conocimientos, no comprenderemos
cómo actúan y no sabremos manipularlas correctamente. En restauración de obras de
arte, muchos de los profesionales evitan emplearlas por la falta de información,
conocimiento y experimentación con enzimas. Muchos de ellos tienen miedo por los
posibles efectos que pueden ocurrir después de su empleo. No obstante, tampoco
conocen hasta dónde penetran los disolventes en la superficie de una obra y qué
efecto tienen sobre ésta y en su propia salud a corto y largo plazo. Por estos motivos,
realizamos una búsqueda de información relacionada con enzimas, en libros
especializados de enzimología y de restauración.
[69]
Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica que aceleran la velocidad
de reacción hasta alcanzar un equilibrio. Constituyen el tipo de proteínas más
numeroso y especializado y, actúan como catalizadores [70,71] de reacciones químicas
específicas en los seres vivos o sistemas biológicos. Muchas de las enzimas no
trabajan solas, se organizan en secuencias, también llamadas rutas metabólicas, y
muchas de ellas tienen la capacidad de regular su actividad enzimática [72].

69
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002, p.
15.
70
Los catalizadores son sustancias que aumentan la velocidad o proporción de las reacciones químicas
sin que ellas cambien en el proceso (ni el enzima ni la reacción).
71
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002, p.
25.
72
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006, p. 190.

41
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

I.1 Estructura de las enzimas

Para comprender cómo funcionan las enzimas, es necesario saber qué son y conocer
la importancia de su estructura.
Las enzimas son proteínas globulares
formadas por una o más cadenas
polipeptídicas[74] plegadas, creando una
“hondonada” donde encaja el sustrato y tiene
lugar la reacción. Esta zona de la enzima se
denomina centro activo y sólo unos pocos
aminoácidos están implicados en él.
[75]
La proximidad de los aminoácidos en el
centro activo está determinada por la
Figura 1[73]. Enzima con un sustrato (azul)
estructura terciaria, aunque también pueden
unido al centro activo (hondonada) con un
ocupar posiciones adyacentes en la estructura
amino ácido clave del sitio activo (rojo).
primaria. En una enzima con estructura
cuaternaria, los aminoácidos del centro activo pueden encontrarse incluso en
diferentes cadenas.
La configuración tridimensional del centro activo es complementaria a la del sustrato
y posee una distribución complementaria de sus cargas sobre la superficie de unión.
Es decir, si una región del sustrato tiene una carga negativa, la zona correspondiente
del centro activo tendrá una carga positiva y viceversa.
En 1894, Emil Fischer, un químico alemán, comparó la especificidad de la enzima
[76]
con una llave y su cerradura . Pero, estudios posteriores sugirieron que el centro
activo es más flexible que el ojo de una cerradura: la unión entre la enzima y el
sustrato altera la conformación de la enzima, ajustando el centro activo al sustrato. Se

73
Fotografía del libro Principios de bioquímica. Muchos de los datos mencionados en este capítulo
están extraídos de este libro. LEHNINGER, NELSON, COX, Principios de Bioquímica, 2º Edición,
Ed. Omega, Barcelona, 1995, p. 191.
74
Los polipéptidos (péptidos grandes) están formados por aminoácidos (más de 10 amino ácidos por
péptido). Cuando los polipéptidos son lo suficientemente grandes y tienen estructuras tridimensionales
estables podemos hablar de proteínas.
75
Un aminoácido está formado por un amino (-NH2) y un grupo carboxílico (-COOH ácido)
76
ALDABE, J., HUETO, A., JUNI, J., LÓPEZ, P., Biología, Ed. Erein, 1998, p. 125.

42
 Capítulo I. Las enzimas

piensa que este cambio inducido puede crear cierta tensión en las moléculas reactivas
y facilitar de esta manera la reacción.

I.2 Mecanismo de acción de las enzimas. Catálisis enzimática.

I.2.1 Energía de activación

En toda reacción química se produce la transformación de unas moléculas iniciales

denominadas sustratos (S) en las reacciones bioquímicas, en unas sustancias finales
o productos (P). Esta transformación necesita, en la mayoría de las reacciones, un
aporte inicial de energía que aumenta la energía cinética de las moléculas y éstas,
reaccionan permitiendo que un mayor número de ellas, choquen con suficiente fuerza
para superar su repulsión mutua y debilitar los enlaces químicos que poseen. La
energía que deben poseer las moléculas para iniciar la reacción se conoce con el
nombre de energía de activación [Figura 2] [77].

I.2.2 El catalizador

Un catalizador disminuye la energía de activación necesaria para una reacción,

[78]79
porque forma una asociación pasajera con las moléculas que reaccionan . Esta
asociación aproxima a las moléculas que reaccionan y, favorece tanto la ruptura de
enlaces existentes, como la formación de otros nuevos. Cuando existe un catalizador
en la energía de activación, esta reacción puede suceder rápidamente sin o con poca
adición de energía. El catalizador no sufre ninguna alteración permanente en el
proceso y puede volver a utilizarse.
Gracias a las enzimas, las células son capaces de desarrollar reacciones químicas a
gran velocidad y a temperaturas relativamente bajas.
77
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006, p. 194.
78
ALDABE J.- HUETO A. - JUNI J. - LÓPEZ P., Biología, Ed. Erein, 1998, p. 125.
79
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002, p.
27.

43
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

I.2.3 Reacciones enzimáticas

En estas reacciones, la enzima (E) se une

al sustrato (S) para formar el complejo
enzima-sustrato (ES). Después tiene
lugar la transformación del sustrato (S)
en producto (P), liberándose el producto
(P) y quedando libre la enzima (E) para
Figura 2[80]. Grafico de la diferencia de energía que
[81]
necesita una reacción no catalizada (line más gruesa) y una nueva unión con el sustrato .
la misma reacción con catálisis enzimática (línea fina).
(ES) significa la unión de la enzima y el sustrato, (EI)
E + S
ES
EI
EP
P + E
la enzima con el compuesto intermedio y, (EP) la
enzima con el producto. Los asteriscos significan los
estados de transición correspondientes a cada Las enzimas, como los demás
complejo ES, EI y EP.
catalizadores, aceleran la reacción sin
alterar la posición de equilibrio. En una reacción química [82] tenemos:
Sustrato Producto

80
Grafico del libro LEHNINGER, NELSON, COX, Principios de Bioquímica, 2º Edición, Ed.
Omega, Barcelona, 1995.
81
En algunas ocasiones el producto inhibe la enzima, regulando de esta forma la actividad enzimática.
82
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006, p. 193.

44
 Capítulo I. Las enzimas

Figura 3. Esquemas de la reacción enzimática [83].

I.2.4 La constante de equilibrio

La constante de equilibrio K, se produce en las reacciones enzimáticas y siempre

tiene un valor constante fijado por la relación entre las velocidades en uno u otro
sentido, independientemente de que el catalizador esté o no presente. La catálisis
hace disminuir considerablemente el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio [84].

K= [P]/ [S] K = constante de equilibrio

[P] = concentración de producto
[S] = concentración de sustrato

83
Esquema similar al que encontramos en el libro LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M.,
Principios de Bioquímica 4º Edición Ed. Omega Barcelona 2006, p198.
84
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006, p. 195.

45
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

I.3 Regulación de la actividad enzimática

I.3.1 Rutas metabólicas

En los seres vivos, las maneras para regular la actividad enzimática son diversas.
Existen rutas metabólicas que están formadas por grupos de enzimas que actúan
conjuntamente en el metabolismo celular. Las enzimas trabajan en serie, formando
vías enzimáticas, de forma que el producto de una enzima constituye el sustrato de la
siguiente.
Todas las rutas metabólicas pueden ser controladas por enzimas reguladoras. Éstas
varían su actividad dependiendo de ciertas señales y normalmente la primera enzima
de la ruta es la reguladora. Ésta se llama el punto de compromiso de la vía.
La actividad de estas enzimas se modula por diferentes moléculas señal, que
generalmente son metabolitos de poco peso molecular o cofactores.

Las vías enzimáticas suponen ventajas para las células [85].

Por una parte, los grupos de enzimas que constituyen una vía común pueden
segregarse dentro de la célula e incluso, si están ubicadas en las membranas, pueden
estar alineadas en secuencia.
Otra ventaja es la escasa acumulación de productos intermedios. Cada producto
tiende a ser usado en la siguiente reacción de la vía enzimática.

85
ALDABE, J., HUETO, A., JUNI, J., LÓPEZ, P., Biología, Ed. Erein, 1998, p. 126.

46
 Capítulo I. Las enzimas

I.3.2 Cofactores y coenzimas

1. Cofactores

Muchas enzimas necesitan para una correcta actividad enzimática la adición de

cofactores, que son determinados iones minerales (magnesio, zinc, cobre, etc.).
En algunos casos, los enlaces entre los iones y los radicales de ciertos aminoácidos
ayudan a mantener la estructura terciaria o a estabilizar la estructura cuaternaria de la
proteína [86].

2. Coenzimas

Las moléculas orgánicas que actúan como cofactores se denominan coenzimas. Éstas
se unen de manera temporal o permanente a la enzima en una zona bastante próxima
al centro activo.

Cuando la enzima es activada por una coenzima, el conjunto se denomina

holoenzima, y cuando la inactiva, apoenzima [16 y 87].

Algunas enzimas que contienen o requieren elementos inorgánicos como cofactores

Fe2+ o Fe3+ Peroxidasa
Cu2+ Citromo oxidasa
Se Glutatión peroxidasa
Ca2+ α-amilasa
Tabla 1. Ejemplos de enzimas que requieren cofactores

86
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006, pp. 191-192.
87
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002, p.
25.

47
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

I.3.3 Efecto de las concentraciones de enzima y de sustrato

La actividad enzimática viene limitada por diferentes factores como puede ser la
concentración de enzimas, de sustrato y la disponibilidad de cofactores.

La velocidad de la reacción está relacionada directamente con la concentración de la

enzima y esta velocidad es diferente para cada enzima. Cuando la concentración de
la enzima es constante, la velocidad aumenta hasta alcanzar un máximo (Vmax)[88 y 89]
aunque la concentración del sustrato siga aumentando. Todas las moléculas de
enzima están ocupadas por moléculas de sustrato y la velocidad no puede aumentar
[Figura 4].

Existe un periodo inicial denominado estado pre-estacionario que es cuando la

enzima se mezcla con el gran exceso de sustrato y durante el cual, aumenta la
concentración ES. Seguidamente aparece el estado estacionario donde ES permanece
constante en el tiempo.

Las células regulan la velocidad de las reacciones enzimáticas mediante la regulación

de las concentraciones de la enzima. Muchas enzimas son degradadas rápidamente y
se sintetizan sólo cuando se necesitan. Otras, se segregan en forma inactiva y se
activan cuando se necesitan.

Figura 4. Efecto de la concentración de enzima y sustrato en la velocidad de reacción enzimática.

88
Vmax: velocidad máxima. ALDABE, J., HUETO, A., JUNI, J., LÓPEZ, P., Biología, Ed. Erein,
1998, p. 126.
89
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006, p. 203.

48
 Capítulo I. Las enzimas

I.3.4 Efectos de la temperatura y del pH

1. La temperatura

Cada enzima tiene una temperatura óptima

de actuación. Por debajo y por encima de
esta temperatura, la enzima ralentiza la
velocidad de la reacción enzimática.
Se observa que muchas de las enzimas,
duplican la velocidad de una reacción
enzimática cuando se aumenta la
temperatura de unos 10° C
aproximadamente y luego cae muy
rápidamente por encima de los 40° C
Figura 5. Efecto de la temperatura en la
[Figura 5] [90].
velocidad de reacción enzimática
El aumento en la velocidad de reacción se
produce porque con temperaturas más altas, existen más moléculas de sustrato con
suficiente energía para reaccionar; la disminución de la velocidad de la reacción es
debida a la desnaturalización de la enzima (la mayoría de las proteínas globulares se
desnaturalizan por encima de 60 - 70°C).

2. El pH

La actividad enzimática también viene regulada por el pH de la solución enzimática.

El pH óptimo o intervalo de pH de cada enzima es diferente y cuando varía, la
conformación de la enzima se altera, produciéndose un cambio en el estado de
ionización de grupos del sitio activo y llegando a no ser funcional [91].
Esto es debido a que la conformación de una proteína depende también, de las
atracciones y repulsiones entre los aminoácidos cargados negativamente y los

90
Grafico obtenido del libro ALDABE, J., HUETO, A., JUNI, J., LÓPEZ, P., Biología, Ed. Erein,
1998, p. 128.
91
LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006, p. 212.

49
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

cargados positivamente. Además algunas cadenas laterales de aminoácidos pueden

actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio
activo del enzima.

Figura 6. Efecto del pH en la velocidad de reacción enzimática

Las enzimas pueden tener dos tipos de curvas:

- La primera curva posible de la actividad enzimática es en pico. Esto significa que la
enzima necesita un control riguroso del pH del medio en el que se encuentra. El
100% de su actividad se encuentra en un pequeño intervalo entorno a un pH
determinado.
-La segunda posibilidad es que la enzima mantenga una actividad superior al 75%
alrededor del pH óptimo.
Estas curvas experimentales suelen ser facilitadas por el fabricante o vienen en
documentos técnicos.

I.3.5 Inhibición

Los inhibidores son sustancias que disminuyen, o incluso anulan, la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas.

50
 Capítulo I. Las enzimas

La inhibición puede ser de distintos tipos [Figura 7] [92]:

1. Reversible:
a) Competitiva
b) No competitiva
c) Acompetitiva
2. Irreversible

Figura 7. Tipos de inhibición

92
Figura inspirada en esquemas del libro LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de
Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega, Barcelona, 2006, pp. 209-212.

51
 Capítulo I. Las enzimas

I.5 Tipos de enzimas utilizadas en la restauración [96]

I.5.1 Las hidrolasas

Existen gran variedad de enzimas que podrían ser empleadas en restauración. No

obstante, casi siempre se emplean tres: las proteasas, las lipasas y las amilasas. Estas
enzimas hidrolasas, catalizan la rotura de macromoléculas. Es decir, la acción
específica de estas enzimas es degradar moléculas catalizando la hidrólisis de
uniones de éteres (-C-O-C-), esteres (-CO-O-) y aminoácidos (-CO-NH-), y pueden
representar una alternativa al uso de ácidos y álcalis para la eliminación de sustancias
poliméricas envejecidas.

A continuación, se resume qué tipo de enzimas se emplean normalmente en

restauración y cuáles son realmente sus funciones.
Enzimas Hidrolizan Tipo de uniones que degradan
Proteolíticas Proteínas aminoácidos (-CO-NH-)
Lipolíticas materias grasas esteres (-CO-O-)
Glicolíticas Polisacáridos éteres (-C-O-C-)
Tabla 3. Enzimas más empleadas en restauración de obras de arte.

I.5.2 Las proteasas o peptidasas (enzimas proteolíticas)

Estas enzimas rompen o hidrolizan las uniones peptídicas en los polipéptidos,

creando fragmentos más pequeños e hidrosolubles: Oligopéptidos y raramente
aminoácidos. Las clasificamos de la siguiente manera:

• Las endopeptidasas y exopeptidasas

96
Mucha de la información expuesta en este capítulo, ha sido extraída del libro de CREMONESI, P.,
L’uso degli enzimi nella pulitura di opere policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002.

57
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

Las endo-peptidasas hidrolizan uniones peptídicas en el interior de las cadenas

proteínicas [figura 9], mientras que las segundas comienzan desde una extremidad
de la cadena y se clasifican en carboxipeptidasas si parten de la extremidad ácida o
aminopeptidasas si parten de la extremidad básica [figura 10][97].

Proteasas
R R O R O
H H
N N
H2N OH
N N
O H O H O O
R R

Figura 9. Endopeptidas

Figura10. Exopeptidasas y endopeptidasas

• Las proteasas más empleadas en restauración[98]

Las proteasas poseen una extrema especificidad. Pueden reconocer en la

macromolécula, uniones peptídicas particulares entre muchas del mismo tipo. En
restauración se emplean diferentes tipos:

a. La tripsina (EC.[Link])

97
Esta información y figuras han sido extraídas del libro de CREMONESI, P., L’uso degli enzimi
nella pulitura di opere policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002.
98
BANIK, G., CREMONESI, P., LA CHAPELLE, A., MONTALBANO, L., Nuove metodologie nel
restauro del materiale cartaceo, Ed. Il Prato, Padova, 2003, p.43-44

58
 Capítulo I. Las enzimas

Las tripsinas hidrolizan proteínas en el extremo carboxílico de sus

residuos de lisinas y argininas, excepto cuando el residuo siguiente es
una prolina.
Las tripsinas son endopeptidasas y el pH adecuado es de 7 y 8-8,4. Si
se añade Ca2+ evitamos la autolisis [99].
b. La papaína (EC.[Link])
Hidrolizan su sustrato en fragmentos peptídicos muy pequeños. Estas
enzimas necesitan cisteína para activarse y realizar la hidrolisis. El pH
óptimo es neutro, pH 7,2, pero tolera variaciones entre 4 y 9,5. La
temperatura también oscila entre 5 ºC y 66 ºC.
c. Colagenasa (EC.[Link])
Como su nombre indica, hidroliza colágeno. La colagenasa empleada
en restauración proviene del clostridium histoliticum. Requiere para
activarse un ión metálico bivalente, el Ca2+. El pH[100] adecuado es
entre 6,5 y 8,8.

Por lo tanto, las proteasas son enzimas de la clase 3.4 y podemos encontrar a parte de
las mencionadas anteriormente, las siguientes enzimas [101] proteolíticas:

- La aminopeptidasa (EC 3.4.1)

- La carboxipeptidasa (EC 3.4.2)
- La dipéptido hidrolasa (EC 3.4.3)
- La péptido hidrolasa (EC 3.4.3)

99
BANIK, G., CREMONESI, P., LA CHAPELLE, A., MONTALBANO, L., Nuove metodologie nel
restauro del materiale cartaceo, Ed. Il Prato, Padova, 2003, p. 43.
100
Estas tres enzimas proteolíticas tienen un pH neutro o básico, sin embargo existen enzimas como la
pepsina que necesitan un pH ácido 5-6 para conseguir la actividad enzimática óptima.
101
En el libro de CREMONESI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato,
Padova, 2002 p. 34, existe una tabla resumen con las principales hidrolasas.

59
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

I.5.3 Las lipasas

Estas enzimas lipolíticas, tienen como función principal catalizar la hidrólisis de los
triglicéridos, liberando gliceroles. Es decir que, al hidrolizar las uniones de los
esteres de los triglicéridos, provocan que los productos creados puedan ser
eliminados en un medio acuoso al ser más solubles [figura 11]. Los productos
creados son monoglicéridos, diglicéridos o gliceroles. Estas enzimas suelen requerir
un pH neutro o alcalino de 7-7,5 a 9.
La lipasa más empleada en el mundo de la restauración es la lipasa proveniente de
[102] [103]
candida cylindracea. Wolbers y Cremonesi entre otros, emplean esta lipasa
para la limpieza de lienzos o la eliminación de Paraloid® B-72 [104].

Figura 11. Hidrólisis de las uniones esteres de los

triglicéridos con las lipasas

Las lipasas y esterasas, hidrolizan ésteres carboxílicos y son de la clase 3.1.1.

Encontramos en libros de restauración los siguientes tipos [105]:
• Las lipasas (EC [Link]) que hidrolizan ésteres del glicerol.
• Las esterasas (EC [Link]) que rompen los ésteres carboxílicos
• Las esterasas (EC [Link]) que fragmentan uniones de ésteres fenólicos.
102
WOLBERS, R., Cleaning painted surfaces, Ed. Archetype Publications, London, 2000.
103
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002.
104
BELLUCCI, R., CREMONESI P., PIGNAGNOLI, G., “A preliminary note on the use of enzymes
in conservation: the removal of aged acrylic resin coatings whith lipase” Studies in conservation Vol.
44, 1999, pp. 278-281.
105
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002, p.
34.

60
 Capítulo I. Las enzimas

I.5.4 Las amilasas

Las amilasas, enzimas glucolíticas, hidrolizan los enlaces éter (glucosídicos) de las
cadenas de los polisacáridos de las sustancias amiláceas, degradándolas a
oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos, que son más solubles en medios
[106 y 107]
acuosos [Figura 12] . De esta manera conseguiremos eliminar el almidón de
forma más sencilla.

Figura 12. Hidrólisis del almidón con la amilasa

Al igual que las proteasas, las amilasas pueden hidrolizar las uniones glucosídicas
internas de los polisacáridos (endo-amilasas) y las que se encuentran en las
extremidades de las cadenas (exo-amilasas). Siendo las terminales más fáciles de
degradar para las amilasas que las interiores.
También, se encuentran unas enzimas muy específicas llamadas glucoamilasas. Estas
proteínas pueden degradar las uniones glucosídicas de las cadenas lineares que
poseen uniones 1,4 glucosídicas y las uniones de las ramificaciones laterales con
uniones 1,6 glucosídica.

Estas enzimas que hidrolizan enlaces glucosídicos son de la clase 3.2.1 y podemos
encontrar diferentes tipos de amilasas:

106
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002,
pp. 36-37.
107
BANIK, G., CREMONESI, P., LA CHAPELLE, A., MONTALBANO, L., Nuove metodologie nel
restauro del materiale cartaceo, Ed. Il Prato, Padova, 2003, pp. 39-40.

61
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

- Las α-amilasas (EC [Link]),

- las β-amilasa (EC [Link]),
- Las glucoamilasa (EC [Link]),
- Las 1,6-glucosidasas (EC [Link], EC3.2.1.10, EC 3.2.1.b)

Las amilasas necesitan normalmente una temperatura de 30-39 ºC, una concentración
[108]
de 0,5 % peso/volumen y un pH neutro de 6,5 a 7,5. No obstante, encontramos
diferencias dependiendo del origen de la enzima. Por ejemplo la amilasa derivada de
A. oryzae necesita un pH de 5 a 7 mientras que la extraída de la cebada su pH varía
de 4,7 a 5,8.
Por otro lado, es importante saber que las amilasas necesitan en general iones de
calcio para tener una actividad enzimática correcta.
Las amilasas derivadas de B subtilis (necesitan 150 ppm Ca2+) y las de B.
licheniformis (precisan 5 ppm Ca2+) requieren además iones de sodio.

I.6 Origen de las enzimas

Todas las enzimas pueden ser sintetizadas o producidas por:

- Animales
- Plantas
- Microbios
A continuación vamos a resumir el origen de las enzimas empleadas en restauración.

I.6.1 Enzimas proteolíticas

Las proteasas pueden ser sintetizadas de diferentes maneras y tener una procedencia:

108
Este porcentaje aparece en el artículo de GUPTA, C.B, “Recent development in the treatment of
water damaged documents” Conservation of manuscripts and documents: problems and prospects.
Proceedings of the National Seminar held at Bharat Kala Bhawan, Varanasi, December 14 to 16,
1990 / Agrawal, O.P., Ed. INTACH, Lucknow, India, 1992, pp. 69-73.

62
 Capítulo I. Las enzimas

1. De origen animal: la tripsina, pepsina, pancreatina, colagenasa y pronasa. Se

consiguen a partir de los tejidos de diferentes organismos como el estómago o
el páncreas. Las enzimas derivadas del estómago suelen tener un pH ácido
por lo que se desaconseja su uso.
2. De origen vegetal: La papaína. Se obtiene de la papaya, de ahí su nombre,
aunque también se pueden extraer de otros frutos como la piña o el higo.
3. De origen microbiano: Las proteasas de la bacteria bacillus o del hongo
Aspergillus. Estas proteasas se sintetizan por medio de estos
microorganismos, pero también de las levaduras.

I.6.2 Enzimas lipolíticas

[109]
Se obtienen de tres formas diferentes, como el resto de las enzimas . En las
enzimas lipolíticas encontramos:

- Lipasas

1. De origen animal, la lipasa extraída de tejidos del páncreas.

2. De origen vegetal, la lipasa derivada de germen de trigo, avena, etc.
3. De origen microbiano, sintetizadas por medio de varias especies de hongos,
como el Aspergillus, Penicillium y levaduras y, de bacterias como el Bacillus.

- Esterasas

1. De origen animal: esterasas hepáticas

2. De origen vegetal: esterasas de germen de trigo y avena
3. De origen microbiano: esterasas microbianas y fúngicas de varias especies de
bacterias y hongos.

109
CREMOSI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002,
p. 33.

63
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

I.6.3 Enzimas glicolíticas, amilasas [110].

1. De origen animal:
La amilasa salival o ptialina se obtiene de la saliva.
La amilasa pancreática se extrae de tejidos del páncreas.
No se debe emplear las enzimas producidas en el estomago porque necesitan
mucha acidez para activarse y pueden provocar que los protoenzimas se
activen.
2. De origen vegetal: existen amilasas que podemos conseguir de los tubérculos.
3. De origen microbiana:
La α-amilasa y β-amilasa se obtienen de diferentes microorganismos y
hongos; de diversas bacterias sobre todo del Bacillus y de hongos, en
particular el Aspergillus.

I.7 Manipulación de enzimas

I.7.1 Cuando deben aplicarse

La intervención enzimática puede resultar un método más seguro o de menor riesgo

para la integridad de la obra respecto a otros métodos convencionales. No obstante,
antes de aplicar las enzimas, se debe verificar que no es posible disolver el material
deseado de otra manera, realizando diversas pruebas (descritas más adelante- tabla
3).

Para utilizar las enzimas sin ningún temor, se debe conocer de antemano la
naturaleza química del estrato a eliminar y de los estratos subyacentes. Para ello es
conveniente hacer un estudio estratigráfico para averiguar si el estrato que deseamos
suprimir, posee o no la misma naturaleza que un estrato original subyacente, y si este

110
BANIK, G., CREMONESI, P., LA CHAPELLE, A., MONTALBANO, L., Nuove metodologie nel
restauro del materiale cartaceo, Il Prato, Padova, 2003, pp. 39-40.

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 Capítulo I. Las enzimas

último está protegido por otro estrato (como un barniz) que le pudiese preservar de la
actividad enzimática.

Diferentes pruebas de solubilidad del material:

1- Test de solubilidad de Feller[111], Wolbers o Cremonesi, para determinar un valor

de polaridad en el cual el material es eventualmente soluble con disolventes Neutros.
2- Prueba de solubilidad con polaridad mayor (alcohol etílico)
3- Prueba de solubilidad con agua (disolvente polar)
4- Prueba de solubilidad con disolventes bipolares apróticos (acetona).

Tabla 3. Test de solubilidad que se deben realizar antes de la aplicación enzimática

Si el estado de conservación de la obra es muy malo, con múltiples craquelados y

desconchados, se puede realizar una fijación con el fin de evitar el acceso de las
enzimas a capas subyacentes [112].

Por otro lado, en el caso de que la superficie pictórica no admitiese ser mojada, por
diferentes causas, las enzimas pueden ser aplicadas en geles o en microgotas
disueltas en algún disolvente. Y si por el contrario, lo que sucede es que la capa
pictórica es hidrófuga, el empleo de enzimas se realiza con un surfactante no iónico.

La utilización de un gel evita la migración rápida de la enzima, pero el tiempo de

exposición del gel al sustrato que debemos suprimir y por tanto a la obra, debe ser el
menor posible. Para ello, siempre debemos realizar diversas pruebas antes de aplicar
la enzima sobre toda las superficie.

111
FELLER, R., STOLOW, N., JONES E., Picture Varnishes and Their Solvents, Ed. Natiolnal
Gallery of Art, Washintong D.C., 1985.
112
GARABELLI, G., “Unità di metodologia e applicazione di prodotti biologici nelle operazioni di
restauro di sculture policrome”, OPD restauro N. 10, 1998, p. 47, 112-120, 132-133

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Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

I.7.2 Criterios para escoger una enzima

[113]
El siguiente esquema, nos indica los pasos que debemos seguir para elegir un
tipo de enzima específica [Tabla 4].

Para una aplicación específica se necesita considerar:

1- La naturaleza del material a eliminar (almidón, proteínas, materia grasa)

2- La naturaleza de los materiales que constituyen la obra (para no alterarlos)
↓
determinan la clase de enzima
(amilasa, proteasa, esterasa o lipasa)

3- Las condiciones (pH, temperatura, tiempo y modalidad de aplicación) que

sean compatibles con las características de la obra
↓
determinan el tipo específico de la enzima
4- Coste
Tabla 4. Criterios para seleccionar una enzima, basados en información de Paolo Cremonesi [114].

Como podemos ver en el esquema, la naturaleza del sustrato a eliminar así como los
materiales que constituyen la obra de arte, determinan el tipo de hidrolasa que
debemos escoger. Es necesario e importante realizar este diagnóstico preliminar
antes de la limpieza, aunque a la hora de la verdad, por motivos económicos, los
restauradores no lo efectúen.
Una vez escogida la clase de hidrolasa, se elige el tipo comercial de la enzima
compatible con las características de la obra. Esto dependerá las condiciones óptimas
para la actividad enzimática de la proteína escogida.
113
Estos datos han sido recopilados del libro realizado por CREMONESI P., L’uso del solventi
organici nella pulitura di opere policrome. Il prato. Saonara, seconda edizione, 2004
114
CREMOSI, Paolo, L’uso degli enzimi nella pulitura di oprer policrome, Ed. Il prato, Padova, 2002

66
 Capítulo I. Las enzimas

I.7.3 Parámetros a tener en cuenta a la hora de escoger una enzima

1. Temperatura

A la hora de utilizar las enzimas en operaciones de restauración, debemos conocer su

temperatura específica. En general, los catálogos dan información precisa de la
temperatura óptima para cada tipo de enzima en particular.
Los catalizadores biológicos que operan en el interior de sistemas vivos, tienen una
temperatura óptima de trabajo entorno a los 37-40 ºC. Pero existen excepciones
como enzimas producidas por microorganismos que son segregados al exterior del
organismo mismo y que tienen una temperatura óptima de 25 ºC.

2. Actividad específica

La actividad específica es la cantidad de sólido necesaria para hidrolizar una cantidad

predeterminada de un cierto sustrato en un cierto tiempo y a una cierta temperatura.
A la hora de escoger una enzima, es necesario elegir la de mayor actividad, ya que
esto significa que es necesario una menor cantidad de enzima para hidrolizar un
sustrato, y por tanto, será menor la cantidad de enzima que deberemos eliminar
después del tratamiento.
La actividad específica está expresada en unidad de sustrato transformado por
miligramo de preparación enzimática, en condiciones estándar de temperatura y a un
cierto valor de pH.
Cuanto más alto es el valor, mayor es la capacidad catalítica de una cierta cantidad
de enzima. Algunos productos comerciales, como la lipasa y la pepsina, tienen una
actividad específica muy elevada (hasta 1500-2000 unidad por mg) mientras que
otros (sobre todo ciertas proteasas microbióticas) tienen valores muy inferiores (0,1-1
unidad por mg). En las preparaciones de baja actividad es muy importante acercarse
lo máximo posible a las condiciones óptimas de trabajo (pH y temperatura).

67
Tesis Doctoral 2011. Capítulo I

3. El pH óptimo

Como hemos visto anteriormente, el pH es un factor importante ya que si éste no es

el óptimo, entonces la actividad enzimática puede ser inferior a la adecuada. El pH
viene especificado por los fabricantes en el propio bote o en la bibliografía
especializada.

4. El coste

Cuanta mayor es la pureza, la especificidad y la actividad de la enzima, mayor es el

coste. Aunque, los últimos adelantos en ingeniería genética, han permitido que se
pueda adquirir una amplia variación de lipasas (sobre todo de origen microbiana) a
bajo coste.

I.7.4 Interpretación de la información de la enzima

Se puede encontrar en los catálogos de productos químicos o en las páginas web,

toda la información relacionada con cada enzima.
Cuando deseamos escoger una enzima en particular, podemos ver sus características
en la página donde la queremos comprar. Por ejemplo, en la siguiente fotografía de
la página SIGMA-ALDRICH[115] vemos los detalles de la celulasa.

1 2

3 4

6
8
7
9
10
Figura 13. Fotografía de la página SIGMA-ALDRICH con la información de la celulasa

115
[Link]
CH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC

68
 Capítulo I. Las enzimas

1- Nombre de la enzima
2- Fuente biológica (origen animal, vegetal o microbiano)
3- Código del producto (en el catálogo)
4- Forma física y pureza del producto comercializado.
5- Precio de esta enzima. Cuanto más difíciles son de conseguir más caras son.
6- Sinónimos del nombre de la enzima.
7- Nomenclatura EC específica para cada tipo de enzima. Pinchando sobre
BRENDA o UBMB encontramos más información sobre esta enzima.
8- Numero CAS: es el código para la clasificación internacional de las
sustancias químicas/ bioquímicas según el “Chemical Abstract Registry
Number”. Sirve para identificar y buscar cada producto en bibliografía
especializada.
9- Numero EC: Es el numero EINECS (European Inventory of Existing
Comercial Chemicals) o numero ELINCS (European List of Notified
Chemical Substances).
10- Número MDL. Es un número de identificación de cada reacción.
M indica la reacción, FCD es la base de datos que recopila la reacción. Los
ocho dígitos son el número del producto.
11- Actividad especifica

Una vez escogida y comprada la enzima, tenemos en los botes donde viene la
enzima, toda la información relativa para el buen uso y rendimiento de esta enzima.
A continuación vamos a mostrar la fotografía de un bote, donde podemos ver
diferentes datos [Figura14].

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Tesis Doctoral 2011.
1. Capítulo I

Nombre de la enzima
Nomenclatura de la enzima. Indica la clase.
Procedencia
Forma física del producto e indicaciones sobre su pureza
Actividad específica de la enzima
pH y temperatura óptimos
Temperatura de almacenaje

Figura 14. Fotografía de un bote de celulasa con información relativa a la enzima.

Numero EC: numero europeo de productos químicos comerciales.

Cantidad de producto en miligramos

Actividad específica

Advertencias

Origen

Figura 15. Segunda parte de la etiqueta de un bote de la enzima celulasa

70