EL MICROSCOPIO

HISTORIA: EL INVENTO

 Se inventó,
hacia 1610, por
Galileo, según
los italianos, o
por Jansen, en
opinión de los
holandeses
EL NOMBRE

 La palabra
microscopio fue
utilizada por
primera vez por los
componentes de la
"Accademia dei
Lincei“
 Micro=pequeño
 Scopein=ver
GALILEO GALILEI

 La “Accademia dei
Linceii” era una
sociedad científica a
la que pertenecía
Galileo y publicaron
un trabajo sobre la
observación
microscópica del
aspecto de una abeja
MALPIGHI

 Las primeras
publicaciones
importantes aparecen
en 1660 y 1665
cuando Malpighi
observa los capilares
sanguíneos y Hooke
publica su obra
Micrographia
ANTONY VAN
LEENWENHOEK
En el siglo XVII un
comerciante
holandés, utilizando
microscopios simples
de fabricación propia
describió por primera
vez protozoos,
bacterias,
espermatozoides y
glóbulos rojos
MICROSCOPIO DE
LEEUWENHOEK
CARACTERÍSTICAS DEL
MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK

 El primitivo
microscopio de
Leeuwenhoek tenía
dos lupas
combinadas con las
que llegó a alcanzar
260 aumentos, lo cual
le permitió visualizar
algunos protozoos e
infusorios
MICROSCOPIOS DEL SIGLO
XVIII
ERNST ABBE

 Las mejoras mas

importantes de
la óptica
surgieron en
1877 cuando
Abbe publica su
teoría del
microscopio
CALR ZEISS

 Mejora la
microscopía de
inmersión
sustituyendo el
agua por aceite de
cedro lo que
permite obtener
2000 aumentos
FUNDAMENTO DE LA
MICROSCOPÍA

 Cuando el observador
se acerca el objeto se
agranda
 Pero a menos de 25
cm no se ve con
claridad
 Si se aumenta el
ángulo visual se ve
con claridad
EVOLUCIÓN DEL
MICROSCOPIO
ESQUEMA DEL
MICROSCOPIO
 Un tubo cilíndrico aloja el
sistema óptico
ocular/objetivo. Una
platina de original
diseño permite observar
las preparaciones, que
son iluminadas por un
espejo cóncavo que
concentra la luz sobre el
objeto a estudiar.
PARÁMETROS ÓPTICOS

 Aumento
 Poder de
resolución
 Nº de campo
 Profundidad de
foco
 Contraste
AUMENTO

 Se calcula
multiplicando
el aumento del
objetivo por el
aumento del
ocular
PODER DE RESOLUCIÓN
 Distancia si dos
puntos se distinguen
 Mayor, cuando menor
es la longitud de onda
 Mayor, cuanto mas
grande es la apertura
numérica
 Mayor, con aceite de
cedro
Número de campo

 Es el diámetro
de la imagen
observada a
través del
ocular,
expresado en
milímetros
PROFUNDIDAD DE CAMPO
CONTRASTE

 Diferencia de
absorción de luz
entre el objeto y
el medio
 Puede
aumentarse con
las tinciones
BUENOS PARÁMETROS
MICROSCOPIO ÓPTICO
COMPUESTO
PARTE MECÁNICA QUE SE
PUEDE DESMONTAR
Estativo

Tornillos
Cabezal de la
platina

Oculares

Condensador
Objetivos
SISTEMA DE SOPORTE O
ESTATIVO

Tubo

Platina Brazo

Píe
SISTEMA DE AJUSTE (1)

Anillo de
ajuste de los
oculares

Tornillo que
permite
mover el
cabezal

Tornillos del
condensador

Tornillos
Palanca de reguladores
cierre del de la platina
diafragma
SISTEMA DE ENFOQUE
Freno

Tornillo
macrométrico

Tornillo
micrométrico
PLATINA

Pinza

Escala
PARTE ÓPTICA

 Sistema de
iluminación:
fuente de luz,
condensador y
diafragma
 Lentes: objetivos
y oculares
 SISTEMA DE ILUMINACIÓN:
FUENTE DE LUZ

 Suele ser una

lámpara halógena de
intensidad graduable
 Se enciende y apaga
con un interruptor
 En el exterior puede
Filtro
tener un filtro

Interruptor y
graduación de la luz
Lámpara
CONDENSADOR Y
DIAFRAGMA
 Condensador:
concentra la luz de la
lámpara en un punto
de la preparación
 Diafragma o iris (está
dentro del
condensador):si se
cierra mejora el
contraste, pero
empeora la resolución
LENTES: OBJETIVOS
 Están colocados en el
revolver
 Tienen un sistema de
amortiguación
 Un anillo coloreado
indica los aumentos
 Son de 4, 10, 40 y
100 (inmersión)
aumentos
 OBJETIVOS

Rojo
4x
Amarillo
10x

Blanco
100x Azul
40x

Amortiguación
 LENTES: OCULARES

Oculares
Ajuste de la distancia
interpupilar
OCULARES: 10x; 15x; 20x
TETRAOCULARES
MATERIAL NECESARIO:
PORTAS Y CUBRES
ACEITE DE INMERSIÓN
 Hoy no son de
madera de cedro,
sino sintéticos
 Los hay de baja,
media y alta
viscosidad
 Su empleo es
imprescindible con el
objetivo de inmersión
(100x)
MANEJO DEL MICROSCOPIO

 Mirando
No ponerporla preparación
fuera subir laal platina
revés
 Regular ylaajustar
Enfocar luz a intensidad media
 Ajustaralcondensador
Pasar siguiente aumento
y diafragma
y enfocar
al medio
 Empezar
Al acabar por
retirar
pocola aumento
preparación
 Apagar la luz
CONSERVACIÓN DEL
MICROSCOPIO
 Ponerle su funda al
guardarlo
 Limpieza de lentes
con papel de gafas
 El exceso de xilol al
limpiar las lentes
desgasta el cemento
 Usar pincel y pera de
aire
TIPOS DE MICROSCOPIOS
Microscopio
Óptico Simple Lupa

óptico Microscopio
M.O. Normal
Campo oscuro
Óptico
Contraste de fases
Compuesto
Fluorescencia

Transmisión
Barrido
electrónico Digital
Efecto túnel o cuántico
PODER DE OBSERVACIÓN
DEL MICROSCOPIO
MICROSCOPÍA DE CAMPO
OSCURO

Treponema pallidum
MICROSCOPÍA DE
CONTRASTE DE FASES

Células epiteliales 20 x
MICROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA

Células epiteliales 200 x

ERNST RUSKA

 El microscopio
electrónico de
transmisión (T.E.M.)
consiguió aumentos
de 100.000 X. Fue
desarrollado por
Max Knoll y Ernst
Ruska en Alemania
en 1931
PRIMER MICROSCOPIO
ELECTRONICO

 Utilizó un haz de
electrones en lugar
de luz para enfocar
la muestra.
 Posteriormente, en
1942 se desarrolla el
microscopio
electrónico de
barrido (SEM).
PRIMER M.E. EN ESPAÑA
(1949)
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO DE BARRIDO
M.E. DE TRASMISIÓN

Bacilos en división
M.E DE BARRIDO

Glóbulo rojo
M.E. DE BARRIDO

Glóbulo blanco
Formación imagen microscópica
Formación de la imagen
Formación de la imagen en el
microscopio

OBSERVADOR
Objeto
1 Imag Imagen
Lente en real
virtua (Objeto Lente
Objetivo
l 2) Ocular
(converge
(diverge
nte)
nte)
 Poder de resolución

 Distancia mínima entre dos objetos para que

sean percibidos como objetos separados.

 La mayoría de células eucarióticas miden entre 3

y 10 veces menos el poder de resolución del ojo.

Ojo humano Microscopio Microscopio

compuesto electrónico
Poder de 100 mm ó 0. 2 mm ó 0.2nm ó
resolución 0.1 mm 200 nm 2 Aº
TEMPORALES Muestra +Colorante +
Medio de Montaje

Muestra + Fijadores + Tinción +

FIJAS Medio de Montaje

Cubreobjeto

Portaobjeto
Tipos de Microscopios de luz
 De campo claro
(brillante): el
contraste lo provee
la tinción de las
muestras

Imágenes con
microscopio de
campo claro
 Tipos de Microscopios de luz
 Contraste de fases:
permite observar
muestras vivas, o
carentes de color

Imagen con
microscopio de
contraste de fases
 Tipos de Microscopios de luz
 Fluorescente: utiliza
luz de longitud de
onda corta para
excitar los
electrones de la Fibroblastos
muestra teñidos con el
fluorocromo
Bacillus subtilis
FITC
esporulando teñidos
con FITC, DAPI y
βgalactosidasa.
 Tipos de Microscopios de luz
 Luz polarizada:
utiliza filtros
polarizantes para
observar
estructuras con
birrefringencia
(emite brillantez)
Cristales de ácido urico
observados con
microscopio de luz
polarizada
Tipos de Microscopios de luz
 De campo oscuro:
para muestras no
teñidas, objeto se
observa brillante
sobre un fondo
oscuro

Treponema pallidum observado con

microscopio de campo oscuro
Tipos de Microscopios de luz
 Tridimensional
Confocal: utiliza
muestras de cortes
seriados teñidas Secuencias de microscopia
confocal
con fluorescencia,
para reconstruir
una imagen
tridimensional
Microscopio confocal
MICROSCOPIA OPTICA
CAMPO CLARO

Requiere tinciones

CONTRASTE DE FASES

Permite diferenciar densidades, no tinciones

FLUORESCENCIA

Utiliza luz UV, usa fluorocromos

DE LUZ POLARIZADA

Produce birrefringencia

CAMPO OSCURO

Permite ver muestras vivas, no tinciones

CONFOCAL

Forma imágenes 3D
Videomicroscopia digital

 Permite el
registro y
almacenamiento
electrónico de
imágenes
microscópicas
poniendo una
cámara de vídeo
en el plano de la
imagen
producida por la
Microscopio electrónico
 Utiliza electrones en lugar
de fotones para formar
imágenes de objetos muy
pequeños
 Funciona con un haz de
electrones de alto voltaje
 Utiliza lentes magnéticas
para formar la imagen
sobre una pantalla
Microscopía Electrónica
 Aumenta la imagen desde 1000 hasta 250000
veces

 Posee mayor poder de resolución que el

microscopio óptico, cerca de 2 000 veces.

 Existen dos tipos de microscopio electrónico:

 MTE (microscopio de transmisión electrónica)
electrones transmitidos a través de una muestra.

 MET (microscopio electrónico tridimensional o de

barrido) los electrones rebotan de la superficie de
la muestra.
Microscopia electrónica de transmisión

Microscopia de un alga roja

antes de formar su pared
 Microscopia electrónica de barrido

Óvulo de hamster
sin zona pelucida
con
espermatozoides

Criofractura de epitelio gástrico vista por microscopia de barrido

MICROSCOPIA ELECTRONICA

DE TRANSMISION
Permite ver el interior de las estructuras

DE BARRIDO
Permite ver la superficie de las estructuras
 Límite de resolución y magnificación
Resolución
Magnificación
Ojo humano 0.1 mm no produce

Microscopio
Óptico 200 nm 1000 – 2000 veces

Microscopio
Electrónico 3 – 5 Aº 250,000 veces
Microscopía
El Microscopio es un
instrumento de
óptica que permite
ver de cerca, y
aumentados, objetos
pequeños o detalles
estructurales
imperceptibles a
simple vista.
Microscopía óptica(2)
Procesado de la muestra biológica
para su adecuada observación
Procesamiento de la muestra:
 Permitir que la luz la atraviese y podamos observarla
 Mantener condiciones cercanas a las naturales

Pasos a seguir
1. Obtención de la muestra
2. Fijación
3. Inclusión
4. Corte
5. Tinción
6. Montaje
 OBTENCIÓN Ó RECOGIDA DE LA MUESTRA

Lo más rápida posible para evitar procesos de descomposición

Evitar:
Autolisis por liberación de enzimas lisosomales (más rápida)
Putrefacción provocada por enzimas bacterianos (más tardía)
 FIJACIÓN
Evitan la aparición de alteraciones tras la muerte (autolisis y
putrefacción)

Agentes fijadores
 Capacidad fijadora (evitan autolisis)

 Capacidad conservante (evitan putrefacción)

TIPOS DE FIJADORES

Físicos
Congelación:
N2 líquido (-121ºC)
Isopentano (-50ºC)
Criodesecación o liofilización (desecación por sublimación)
Criosustitución (alcohol etílico, acetona o polietilenglicol)

Químicos: desnaturalización
Bloqueo de la autolisis.o precipitación de proteínas
Efecto microbicida.
Evitar los efectos osmóticos.
Evitar los cambios de textura y composición tisular.
Efecto mordiente.
 TIPOS DE FIJADORES QUÍMICOS

Fijadores por deshidratación tisular (disuelven las grasas): alcohol

etílico, metanol, acetona

Fijadores por cambio en el estado coloidal de las proteínas

(disminución de PH por debajo del PI):
ácido acético, ácido tricloroacético y ácido crómico

Fijadores que actúan formando sales en los tejidos

Fijadores que actúan por reticularización de las proteínas

Mezclas fijadoras
 INCLUSIÓN

Sustancias que producen un endurecimiento de la muestra

para su corte adecuado

PARAFINA
Deshidratación previa
mediante fijación en alcohol
en gradación ascendente y
su
Aclarado posterior
CORTE
CORTE
 TINCIÓN

Según grupos cromóforos:

Colorantes básicos: colorean estructuras ácidas
Colorantes ácidos: colorean estructuras básicas
Colorantes neutros: colorean estructuras diversas
Colorantes indiferentes: colorean por impregnación física
Colorantes metacromáticos: tiñen de color diferente al del colorante
Según criterios de especificidad
General
Específica: colorean estructuras concretas
TINCIÓN
TINCIÓN GENERAL Y TINCIÓN ESPECÍFICA

Tinción Hematoxilina-Eosina
TINCIÓN GENERAL Y TINCIÓN ESPECÍFICA

Tinción de Plata. Tejido nervioso

TINCIÓN GENERAL Y TINCIÓN ESPECÍFICA

Tinción de Mallory. Colágeno

ALMACENAMIENTO
Preparación y Tinción de las
muestras

Aunque los microorganismos vivos se

pueden examinar directamente con un
microorganismos óptico, a menudo hay
que fijarnos y teñirlos para aumentar la
resolución, acentuar las características
morfológicas y conservarlos para su
estudio en el futuro.
TINCION SIMPLE
Los microorganismos se pueden teñir
satisfactoriamente mediante Tinción Simple,
esto es, utilizando solo un colorante.
El valor de esta clase de tinción radica en su
simplicidad y facilidad de empleo.
El frotis, previamente fijado, se cubre con un
colorante durante el tiempo adecuado, se lava el
exceso de colorante con agua y se seca el
portaobjetos.
Los colorante es básicos como cristal violeta, azul
de metileno y carbolfucsina se emplea con
frecuencia para determinar el tamaño, la forma
y la organización de las bacterias.
TINCION DIFERENCIAL
En el primer paso de esta tinción, se tiñe con el colorante básico cristal
violeta (violeta de genciana), el colorante primario. A continuación,
se trata con una solución yodada que actúa como mordiente.

Esto es, el yodo aumenta la interacción entre la célula y el colorante,

de forma que aquella se tiñe más intensamente.

Luego se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona. Este paso

produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram; las bacterias
Gram positivas retienen el cristal violeta, mientras que las Gram
negativas lo pierden y aparecen incoloras.

Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo con un colorante básico de

diferente color al cristal violeta.
La safranina es el colorante de contraste más común y tiñen las
bacterias Gram negativas de rosa o rojo, dejando a las Gram
positivas de color violeta.
La tinción de acido- alcohol resistencia es otro método
importante de tinción diferencial. Unas pocas especies,
particularmente Mycobacterium no se unen fácilmente a
colorantes simples y hay que teñirlas con un tratamiento
màs fuerte: calentando una mezcla de fucsina básica y
fenol.
Una vez que la fucsina básica ha penetrado en la cella con
la ayuda del calor y el fenol, las células acido-alcohol
resistentes no se decoloran fácilmente con una solución
acidoalcohólica, permaneciendo de color rojo.
Esto se debe al elevado contenido en lípidos de las paredes
de estas células; en partículas, los ácidos micólicos, los
responsables de la propiedad de ácido- alcohol
resistencia.
Las bacterias no ácido-alcohol resistentes se
decoloran con la solución acidoalcoholico,
por lo que se tiñen de azul con azul de
metileno (tinción de contraste).

Este método se emplea para identificar

Mycobacterium tuberculosis y [Link].,
agente patogenos responsables de la
tuberculosis y la lepra.
TINCION DE ESTRUCTURAS
ESPECIFICAS

Uno de los mas sencillos es la tinción negativa,

técnica que revela la presencia de cápsulas
difusa alrededor de muchas bacterias.
Se mezcla las bacterias con tinta china o colorante
de nigrosina y se extienden en una capa fina
sobre el portaobjetos.
Después de secarlo al aire, las bacterias aparecen
como cuerpos más claros en medio de un fondo
azul oscuro, porque la tinta y las partículas de
colorantes no pueden penetrar ni la célula
bacteriana ni su cápsula.
La extensión de la región de luz está
determinada por el tamaño de la cápsula y
por la propia célula. Apenas se produce
modificación de la forma bacteriana y la
célula se puede teñir posteriormente para
conseguir una mejor visibilidad.
Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium forman una
estructura de supervivencia en condiciones ambientales
desfavorables, excepcionalmente resistentes durante periodos
largos de tiempo. Esta estructura se denomina endospora pues se
desarrolla dentro de la célula. La morfología y la localización de las
esdosporas varían con la especie y son a menudo de un gran valor
para la identificación bacteriana; pueden ser esféricas a elípticas,
con un diámetro menor o superior al de la bacteria madre.
Se puede observar con el microscopio de contraste de fases o
mediante tinción negativa. Las endosporas no se tiñen bien o
mediante tinción negativa. Las endoporas no se tiñen bien con la
mayoría de los colorantes, pero una vez teñidos, resisten
intensamente la decoloración. Esta propiedad es la base de la
mayoría de los métodos de Tinción de endosporas..
Con el metodo de Schaeffer-Fulton, las endosporas se
tiñen primero calentando las bacterias con verde
malaquita, la preparación con agua para eliminar el resto
de colorante y se contratiñe con safranina. Esta técnica
revela endosporas de color rosa a rojo

TINCION DE FLAGELOS
Los flagelos son estructuras de locomoción en forma de
hilo, tan delgados que sólo se pueden observar
directamente con el microscopio electrónico.
Para observarlos con el M. optico, se aumenta su grosor
cubriéndolos con mordientes, como ácido tànico y
alumbre de potasio, y tiñéndolos con pararosanilina o
fucsina básica.
Los métodos de tinción de flagelos ofrecen una información
taxonómica importante acerca de su presencia y el
modelo de su distribución.