PRIMERS O CEBADORES
un cebador o primer es una secuencia corta de ácido nucleico que contiene un
grupo 3'hidroxilo libre que forma pares de bases con una hebra molde
complementaria y actúa como punto de inicio para la edición de nucleótidos con
el fin de copiar la hebra molde. se necesitan dos para la reacción de PCR.
Es decir, proporciona un extremo hidroxilo 3´ libre, donde la polimerasa va
a comenzar a agregar nucleótidos:
delimitan secuencia diana o secuencia de interés
PCR
Técnica que permite la amplificación de uno o varios segmentos de
CONCEPTO ADN o ARN.
Secuencia diana
Dos oligonucleótidos
REACTIVOS
Cuatro dNTPs (acompañados de magnesio)
DNA polimerasa termoestable (la más común es la Taq
polimerasa)
Desnaturalización (calentamiento
para la separación de las hebras de tiempo.
temp.
DNA) 30-120
68 -97°
seg
Hibridación
ETAPAS. -
tiempo.
( enfriamiento rápido para el temp.
10-120
emparejamiento del DNA 37-65°
seg
monocatenario de interés)
Replicación (amplificación,
la DNA polimerasa elonga los temp. tiempo.
cebadores, empleando como molde 72-75° 1-3 min
las hebras originales)
Rendimiento: La acumulación de copias (tanto totales como
dianas) es exponencial en vez de lineal, en teoría.
CARACTERÍSTICAS
Duración: la duración de cada una de las tres etapas de cada ciclo
y el número de ciclos deben optimizarse.
Especificidad: es muy elevada. Está determinada especialmente
por la secuencia de los dos cebadores utilizados y por las
condiciones de hibridación.
Capacidad de detección: es muy alta, se puede detectar una única
molécula de DNA en casi cualquier tipo de muestra, en teoría.
Fidelidad: es decir, la capacidad de copiar secuencias con
precisión, sin introducir mutaciones, determinado por la
polimerasa.
TIPO DE PCR
qPCR: Muestras con diferente cantidad de DNA inicial pueden producir resultados
similares tras la amplificación
RT-PCR: "PCR con transcriptasa inversa", amplificación de RNA a través de la
síntesis previa de su cDNA.
PCR con "comienzo en caliente": Consiste en privar a la mezcla de reacción de
alguno de sus componentes (frecuentemente la polimerasa) hasta que se haya
alcanzado una temperatura superior a la de hibridación. Aumenta la especificidad de
la amplificación.
PCR "larga" (L-PCR)
Amplificar con fidelidad regiones diana de gran tamaño (entre 5 y 40 kb). Se
añade una cantidad menor de otra enzima con capacidad de corrección de pruebas
(por ejemplo, la Pfu) para contrarrestar la carencia de es la ausencia de actividad
correctora de la Taq Pol.
PCR asimétrica
Se trata de generar copias monocatenarias. Se añaden cantidades muy diferentes
de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se
agota y, disponibles ya suficientes copias del DNA diana, sólo una de sus hebras sigue
amplificándose.
PCR "anidada”
La especificidad puede aumentarse realizando una segunda reacción de PCR, con
dos cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el
primer par.
PCR inversa
Se emplea para clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posición
vecinal a secuencias diana conocidas. Se amplifica la región flanqueante a los
cebadores. Es necesario cortar el DNA a ambos lados de la región diana con una
enzima de restricción, de tal forma que los extremos cohesivos resultantes puedan
hibridar entre sí, formando una molécula circular
PCR con adaptadores
Se amplifica una región de DNA de secuencia desconocida ligando a sus
fragmentos de restricción unos adaptadores, oligonucleótidos sintéticos con extremos
cohesivos compatibles con los generados en la muestra. Después, se añaden
cebadores específicos para las secuencias 3’ de los adaptadores.
APLICACIONES
Detección de infección bacterianas o virales
Diagnostico de enfermedades hereditarias
Estudios de evolución molecular
Estudios de medicina forense
Pruebas de paternidad
ENZIMAS
Nucleasas: son fosfodiesterasas específicas para hidrolizar el enlace entre dos nucleósidos. Las
más útiles son las enzimas de restricción.
Endonucleasas: hidrolizan enlaces entre nucleótidos internos.
puede generar extremos romos o cohesivos y pegajosos
Exonucleasas: separan nucleótidos terminales
Reconocimiento de moléculas mono- o bicatenarias, de DNA o RNA, reconocimiento
de nucleósidos por su base nitrogenada.
Enzimas de restricción. (endonucleasas)
Gran especificidad para reconocer una secuencia corta de DNA bicatenario e
hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra, siempre en la misma
posición.
-Cada una tiene un sitio o secuencia de reconocimiento o de restricción, o
secuencia diana.
Existen de 3 tipos.
Enzimas de restricción tipo II: Son las de estructura más simple y las mejor estudiadas
por su utilidad en ingeniería genética para el corte del DNA
Puede cortar en extremos romos (bases emparejadas) o en extremos escalonados
(bases desemparejadas)
Si sabemos la secuencia se sabe el mapa de restricción (sitios de cortes) con eso
se sabe que enzima de restricción usar………
Las enzimas de restricción sirven para caracterizar fragmentos de DNA.
Las enzimas de restricción – cortan acorde a la cantidad de segmentos o bases
que reconoce clonación
Ligasas
• Estas enzimas catalizan la formación de un solo enlace fosfoéster, parte
del fosfodiéster resultante.
• Requiere la presencia de un grupo fosfato en el extremo 5’ de una hebra de DNA y
un grupo OH en el extremo 3’ de la otra.
• Requiere un grupo 5’-P para su actuación.
Actúa en la unión de los fragmentos de OKASAKI
SECUENCIACION
Método definitivo para caracterizar una secuencia de interés o clonada.
Método químico de Maxam y Gilbert (1977)
La fragmentación específica de DNA es la base del método. Se basa en la
hidrólisis química y en un diseño original aplicable a secuencias de DNA de
menos de 250 nucleótidos.
Puede describirse en 5 etapas:
1) El marcaje radiactivo del extremo 5’ con 32P
2) La modificación de una base
3) La eliminación de la base modificada
4) Rotura de la cadena de ADN en la desoxirribosa modificada
5) El análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis
Método enzimático de Sanger (1980)
Conocida como secuenciación de terminación en cadena, se usa para la secuenciación
a gran escala del DNA.
El método se apoya en dos conceptos fundamentales:
1) La síntesis a cargo de una DNA polimerasa
2) El uso de nucleótidos terminadores.
El método puede describirse en tres secciones:
1) Síntesis enzimática
2) Análisis de los fragmentos
3) Automatización.
Características del método:
1) Necesidad de un cebador
2) Uso de didesoxinucleótidos (provocan la detención de la reacción de síntesis de
DNA)
¿porque son importantes los didesoxinucleótidos?
Dado que los didesoxinucleótidos no tiene el grupo hidroxilo en el 3 carbono, sirven de
bases terminadoras o de parada para la síntesis.
MICROARREGLOS
Funciones: expresión de genes al mismo tiempo
Aplicaciones:
Se usan para detectar mutaciones
-Analizar miles de genes que se crea que están implicados en las enfermedades
que muestran un patrón de herencia multifactorial o que surgen tras diversos
sucesos de mutaciones. Por ejemplo: cáncer, enfermedad bipolar y
esquizofrenia.
-Desarrollo de medicamentos.
-Diagnóstico de enfermedades.
-Rastreo genómico.
-Predicción de respuesta a un tratamiento.
Ejemplo: Para usar un microarreglo en un análisis genético:
1) Se extrae el ADN de una persona y se amplifican los genes relacionados por PCR.
2) Los productos de PCR se marcan con uno o más colorantes fluorescentes, se
desnaturalizan en cadenas sencillas y se bombean hacia el micoarreglo.
3) Los fragmentos de PCR con secuencias nucleotídicas que encajan exactamente
con la secuencia de una sonda del microarreglo se unirán a ella, y las que no
encajen a la perfección con ninguna sonda se lavarán.
4) El microarreglo se rastrea con un láser, lo que provoca que los campos en que se
haya producido hibridación emitan fluorescencia, produciendo un patrón de marcas
en el microarreglo.
5) Se analiza el patrón de hibridación con softwares unidos al sistema, y los datos se
pueden presentar de diversas formas.
bibliotecas genómicas – encaminadas toda la información de un genoma en
diferentes viales o clonas
biblioteca de expresión – se recopila todos los genes que se están expresando en
una determinada célula-
transcriptasa reversa – La transcriptasa inversa es una enzima de tipo ADN
polimerasa que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando como
molde ARN monocatenario.
