PRACTICA 2

SEPARACION DE AMINOACIDOS

NOMBRE: JOEL GUTIERREZ CALLAPAZA TURNO:A5 M-3:40-5:40

CURSO:LABORATORIO DE FUNDAMENTOS DE BIOPROCESOS

1. OBJETIVO:
Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de aminoácidos
presentes en una muestra biológica.
2. FUNDAMENTO
2.1. Aminoácidos
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas. Por lo tanto, si a una
determinada proteína se le somete a una hidrólisis ya sea ácida o alcalina; este proceso
rendirá una mezcla de sus aminoácidos constituyentes, los cuales pueden ser susceptibles
de ser analizados o identificados por métodos cromatográficos.
Todas las proteínas son polímeros y los monómeros que se cambian para formarlos son
los a -aminoácidos.

• Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.

• In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.
• El pKa de los grupos carboxilo y amino de los alfa -aminoácidos es aproximadamente 2 y
10 respectivamente.
• Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habrá perdido un
protón y el grupo amino habrá captado un protón para dar la forma ZWITTERION.
• En los genes, de todos los organismos están codificados 20 aminoácidos que se
incorporan a las proteínas.
• Todos los aminoácidos son enantiómeros (L)
• Existen otros aminoácidos (no proteicos) y también hay aminoácidos modificados que
se hallan en las proteínas.
• La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas, hidrófobas, ácidas, básicas, neutras)
permite una gran complejidad funcional en las proteínas.
2.2. Cromatografía
Es un método de separación que permite separar, aislar e identificar componentes
estrechamente relacionados presentes en mezclas complejas. En estos métodos se emplea:
 Fase estacionaria: Sólido / líquido
 Fase móvil: liquido / gas

Los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase estacionaria por
medio de una fase móvil que fluye”. Las separaciones se basan en las diferencias de
velocidad de migración entre los componentes de la muestra.

Cromatografía en Capa Fina

La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva,

cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla. Permitiendo así
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. La cromatografía en capa
fina es una cromatografía de adsorción, que tiene 2 partes: Fase móvil y Fase estacionaria.
El soporte o Fase Estacionaria, es un sólido poroso capaz de retener solvente y sólido
pueden ser de celulosa, sílica, óxido de aluminio… etc.

El soporte poroso está adherido a la base, está pegado gracias a la presencia de SO4Ca que
ayuda a pagar el soporte. En las leyendas de las placas de sílica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de la
migración de muestra o estándares esta marcha ya no es verde sino violeta.
La elección del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en
qué, la separación se lleva a cabo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
 Éter de petróleo
 Éter dietílico
 Ciclohexano
 Tetracloruro de carbono†
 Acetato de etilo
 Piridina†
 Cloroformo†
 Diclorometano†
 Benceno†
 Etanol
 Metanol
 Agua
 Ácido acético
 † compuestos cancerígenos

En la elección del eluyente influyen varios factores, como. Precio, Pureza. Se recomienda,
no utilizar mezclas de eluyentes a menos que se conozcan las proporciones de los
disolventes que conformen la mezcla (reproducibilidad), No utilizar compuestos muy
volátiles, Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). La elección del eluyente
se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con
eluyentes cada vez más polares. La separación se basa fundamentalmente en las distintas
afinidades de adsorción de los componentes de la muestra con la superficie del sólido en
la fase estacionaria. La fuerza con la que es adsorbido un componente dependerá de la
polaridad de los componentes, de la actividad del adsorbente que conforma la fase
estacionaria y de la polaridad de la fase móvil. Después del desarrollo cromatográfico se
aplica una etapa de revelado, ya que los analitos son incoloros. Se utiliza la ninhidrina
como agente de revelado, la cual forma con los aminoácidos un derivado de color azul-
violáceo. La constante RF (Ratio of Front) es una manera de expresar la posición de un
compuesto sobre una placa, y como una fracción decimal, mide la retención de un
componente. Se define como: RF= Distancia de la muestra desde el origen/Distancia del
eluyente desde el origen La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente
desde el centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10. Para que
los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa,
fase móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El máximo valor de RF que se puede
alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7. Para averiguar si dos compuestos son
iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una
vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad
que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario, si los RF son iguales los
compuestos pueden ser iguales o no. Si se sospecha que dos compuestos son muy
parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor
polaridad, hasta apreciar una separación mínima. En este caso no se pueden usar
reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indicador ultravioleta. Este
 método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros estudios de
la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografía
líquida de alta resolución, ya que esta última es más confiable para la cuantificación y
tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan por fluorescencia. Sin embargo, la
cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar fosfoaminoácidos, ya que
de esta manera es posible identificar si una determinada fosfoproteína, se encuentra
fosforilada en serina, treonina o tirosina.

3. Metodología.
Observe los siguientes videos.
 [Link] Prácticas de Química Orgánica I:
Cromatografía en capa fina
 [Link] Cromatografía de aminoácidos
4. Procedimiento:
4.1. Primer Proceso: Sembrado de la muestra
 Se siembra los estándares y la muestra con un capilar bastante fino.
 Tener precaución de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre 1 y 2
mm de diámetro.
 La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm aproximadamente.
4.2. Segundo Proceso: Elusión (fenol-agua).
 Una vez sembrada la muestra se procede a la fase móvil con la ayuda de un solvente
de elusión.
 Para ello se coloca dentro de una cámara de elusión

 “El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra”.

 El solvente comienza a subir por capilaridad.
 Las muestras se comportan diferente según el solvente utilizado y sus componentes
algunos migrarán rápidamente otros no.
4.3. Tercer Proceso: Visualización o Revelado
El producto puede verse:
  Por sí mismo porque tiene color.
 Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.
 Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dónde está la mancha dando
coloraciones amarillas profundas.

 Usando métodos químicos, con una sustancia química reveladora (ninhidrina en

butanol, acetona, etanol)

4.4. Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados.

 Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su factor de retardo RF
que se define como.

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia

patrón en idénticas condiciones. “La razón de estas distancias se designa por Rf”.
Parte experimental:
a. Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras
b. Corrida cromatográfica. Elusión
c. Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
d. Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separación
cromatográfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la
parte superior de la placa.
e. Repetir el proceso con butanol-ácido acético.
f. Revelado del cromatograma
g. Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.
h. Destapar la cámara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa con
ayuda de una secadora de cabello.
i. Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en solvente sobre la placa. Secar
la placa con una secadora.
j. Identificación
k. Luego proceder a identificar las manchas existentes que deberán corresponder a
aminoácidos para ello se deberán hacer los cálculos de los Rf de los estándares y
luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras. l. Rx. Ninhidrina es
la reacción que identifica aminoácidos a través de una coloración azul violeta.

5. Cuestionario
a. Dibuje un esquema, que represente de los resultados observados. (indicar distancias
recorridas)
Ácido Patrón Distancia Recorrida
Metionina 3.7
 Alanina 2.4
Glysina 1.8
Ácido Patrón Distancia Recorrida
Arginina 1.5
Aspartico 0.9
Glutamina 1.1

b. Calcular los Rf de los estándares y muestras, y complete la tabla.

Aminoácidos Patrón Rf de patron Rf en Muestra

Metionina 0.637 0.569
Alanina 0.414 0.362
Glysina 0.310 0.258
Muestra 1
Aminoácidos Patrón Rf de patron Rf en Muestra
Arginina 0.294 0.260
Aspartico 0.176 0.137
Glutamina 0.216 0.186
Muestra 2

c. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de intercambio

iónico y cuáles son sus aplicaciones.
La cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso que
permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de
carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada,
incluyendo proteínas grandes, nucleótidos y aminoácidos pequeños.
La cromatografía de exclusión molecular puede ser usada para purificar fagos
filamentosos, el virus bacteriano más usado en la tecnología de presentación de
péptidos y proteínas en la superficie de los fagos.
La cromatografía iónica se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgánicos y
bioquímicos, incluyendo fármacos, conservantes alimentarios
d. Qué métodos existen para identificar a los aminoácidos.
 Prueba Ninhidrina
 Prueba Sulfato de amonio Prueba Biuret
  Prueba Coagulación Prueba Xantoproteica
 Prueba grupos Azufrados (SH)
 Prueba Sakaguchi Prueba Hopkins-Cole
 Prueba Millon.
e. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto para silica y alúmina.
Como eluyentes (solventes que se emplean para preparar la fase móvil) se utilizan
agua, alcoholes, cetonas, ésteres, cloroformo, tetracloruro de carbono, etc. Su
capacidad de elución depende de su polaridad, del adsorbente y de los componentes a
eluir.
f. Escriba el mecanismo de reacción de la Ninhidrina con los aminoácidos.
El aminoácido se va a unir a la nihidrina a través de su grupo amino

g. Explique el mecanismo por el cual, se separan los aminoácidos en la cromatografía

de capa fina.

h. Explique la diferencia entre cromatografía de papel y cromatografía de capa fina

La diferencia entre ambos procedimientos se encuentra en la fase estacionaria, que en
el caso de la cromatografía en capa fina se compone de materia pulverizada como la
alúmina, gel de sílice o celulosa que se sitúan sobre plaquitas de vidrio.
6. Observaciones
 Los aminoacidos en la muestra 1 se pudieron identificar en referencia a los aminoácidos
patrón, pero en la muestra 2 se pudo observar un aminoácido desconocido ya que no coincide
con los demás aminoacidos
7. Conclusiones
Se deben justificar las diferencias en los valores de Rf para cada uno de los aminoácidos, así
como las formas de la mancha, tipo de color e intensidad. A partir de la estructura química hay
que relacionar el mayor o menor valor de Rf con la mayor o menor solubilidad en las fases
estacionaria y móvil.
8. Bibliografía
 Jorrín J. et al., 2014. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y
detección mediante reacción con ninhidrina.
 Medina M. et al., 2013 Identificación de aminoácidos libres por cromatografía de capa fina
en jugo fresco de naranja (Citrus sinensis L. Osbeck) variedad “Valencia”