Objetivos
Entender los principios químicos de separación y purificación
Describir las generalidades de los diversos mecanismos de extracción
Comprender la necesidad de la extracción de ADN para su uso en pruebas
diagnosticas
TEORÍA
El ADN es útil para la realización de diversos estudios diagnósticos utilizando pruebas
de biología molecular para poder realizar dichas pruebas es necesario iniciar con la
extracción y purificación y así obtenerlo de diferentes fuentes con un alto grado de
calidad y pureza de esta forma los resultados serán mucho mas exactos y confiables
Existen una gran variedad de métodos por lo cual se designa el más adecuado, los
métodos común mente empleados combinan procesos físicos químicos y mecánicos o
incluyen básicamente 3 pasos que son:
Extracción: Se saca el ADN dl compartimiento celular por medio de medio de
una lisis
Purificación: Permite separar el ADN de los demás componentes celulares.
Precipitación: Retirar el ADN completamente puro
La lisis permite liberar el ADN del interior y puede realizarse por métodos químicos,
físicos o enzimáticos.
Lisis celular: contiene detergentes solidos como el sodio silo de sulfato (SDS), degrada
la membrana celular capturando lípidos y proteínas evitando que cantidades
significativas de ADN queden atrapada en los restos celulares, también se añade
moléculas quelantes como por ejemplo el EDTA que costa de 4 grupos carboxilos y 2
grupos aminos cuya forma desprotonada puede unirse al Mg +2., este funciona como un
cofactor que degrada el ADN
Algunas sales como el NaCl forman una capa iónica suave que recibe el ADN y así lo
protege y ayuda a evitar su degradación además de deshidratar y precipitar proteínas
celulares, estas soluciones también deben contener Tris (HCl) que es una solución que
mantiene el pH de la solución estable entre 7.5 a 8.2. Algunas también contienen
proteínas que permiten degradar proteínas o enzimas y de esa forma ayudan a purificar
cada vez más el ADN.
Durante la lisis con buffer la muestra en sometida a 3 o 4 ciclos de incubación a
temperatura entre los 50 y 70 °C. alternados con la agitación de la muestra incubación a
4°C esto facilita la rotura d ellos lípidos de la membrana celular permitiendo la
liberación del ADN.
Lisis por medio físico
Se realiza con homogenización mecánica o en solución moliendo manualmente en un
mortero o por zonificación estos métodos pueden ser usados cuando es necesaria la
disgregación o fragmentación de algún tejido antes de realizar lisis con la solución
buffer por ultimo la extracción puede hacerse por métodos enzimáticos estos métodos
utilizan proteasas que rompen los enlaces peptídicos de proteínas de la pared y
membrana plasmática además de la interacciones célula-célula el resultado es una lista
de libera el material genético.
Purificación
Se realiza con la eliminación de proteínas y lípidos de membrana la eliminación de estos
se realiza agregando solventes orgánicos como por ejemplo el fenol que debe agregarse
en un volumen igual a la de la muestra, debe agitarse hasta que la solución dentro del
tubo tenga un aspecto de emulsión y posteriormente debe de centre jugarse.
La centrifugación permite la formación de dos fases una acuosa y otra orgánica, entre
ella se forma una interfase que es donde quedan atrapadas proteínas de membrana y
nucleasas liberadas durante la lisis celular la fase acuosa es la que contiene el ADN por
lo tanto es la de mayor interés asique debemos traspasarse a otro tubo estéril siempre
teniendo de no arrastrar la interfase o la fase orgánica, posterior mente se agrega
cloroformo en volumen igual a la del sobrenadante recuperado y se procede de la misma
manera con el fenol en este paso son eliminados residuos lipídicos que pueden estar aun
presentes en la muestra nuevamente la fasee acuosa que contiene le ADN debe
recuperarse en otro tubo estéril por ultimo es necesario precipitar el ADN esta
precipitación se lleva acabo agregando estanol absoluto a la fase acuosa recuperada la
sal adicionada en el buffer de extracción también ayuda a la precipitación del ADN
debido a la formación de una capa iónica positiva alrededor de este, el etanol además
cumple la función de remover la concentración residual de sales luego se centrifuga
para remover el sobrenadante, tomando en cuenta que para esta fase el ADN ya ha
precipitado . al destapar el sobrenadante el botón del precitado de ADN se lava con
etanol al 70% el objetivo de este lavado es remover todas las sales que aun estén
presentes nuevamente se centrifuga y se elimina todo el etanol dejando secar el botón de
ADN por media hora a temperatura ambiente en un lugar protegido hasta que todo el
etanol se haya evaporado una vez seco el botón de ADN puede suspenderse en agua
para ser utilizado o bien puede guardarse en el congelador hasta su uso.
