PROTOCOLO DE MANEJO DEL HPLC CROMATOGRAFO LIQUIDO DE ALTO
DESEMPEÑO
PRINCIPIO
En la cromatografía se separan los componentes de las mezclas a medida que son
transportadas por un fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o
líquida, la separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto
depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y
esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños
moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox.
En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados través de
una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase
móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de
migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la
naturaleza de los analitos y su interacción con las fases.
La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid
Chromatografy) es el método más sofisticado y moderno de la cromatografía
líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria para el interior de la columna con
diámetros muy pequeños para aumentar la eficiencia, entorno a 3-10 µm. Así, se
ha conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de
diámetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separación, de minutos a 1h.
PROCEDIMIENTO
1. Cheque que la fase móvil y las botellas de lavado del suministro están lo
suficientemente llenas para que no se desocupen durante su sesión. La
solución de lavado debe, en lo posible, ser igual a la que usted piensa usar
como fase móvil inicial en su método, pero normalmente usando metanol es
suficiente
2. Encender el computador
3. Encender módulos del HPLC de abajo hacia arriba en el siguiente orden:
L-7100 Bomba de gradiente de presión baja
L-7350 columna de horno
L-7470 Detector de conductividad
D-7000 Módulo de interfaz
4. Encienda el desgasificador en línea. Esto automáticamente desgasifica los
componentes de la fase móvil. Sin el desgasificador, usted corre el riesgo de
obtener burbujas en la bomba y normalmente en el detector cuando se está
obteniendo una señal.
5. Abrir el icono “Software Multi HSM D7000” que se encuentra en el escritorio
del computador.
Se abre una ventana como la mostrada en la siguiente figura, y es donde se va a
trabajar la muestra.
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Conexión del equipo: Dar clic en el botón con una “I”. Esto transmitirá la
información del software al hardware y confirma que todos los componentes
apropiados están en su lugar.
Después de dar clic, abre la ventana “Hardware Status”, y se debe dar clic en el
botón de inicializar y se espera a que reconozca los siguientes módulos: Interface
Module –Pump – other detector, como se puede ver en la siguiente figura; una vez
están reconocidos se debe dar clic en OK.
7. Crear metodo: Con el icono XXXXX, hacer clic para crear un nuevo
metodo
8. Encendido bomba: Use el teclado pequeño en el frente de la bomba de
gradiente L-7100 para poner la fase móvil a 100% A (esto bombeará el agua
desionizada a través del sistema) y poner la presión mínima para la bomba a
45 psi. Esto se hace presionando la opción "manual set” entrando
entonces en el valor apropiado por cada parámetro (presionando la tecla
enter). La bomba determina el correcto A% usando los valores que use para
las otras fases móviles. Así, para 100% A, usted entrará en 0% para los otros
componentes de la fase móvil. Sólo ajuste las proporciones de la fase móviles
y la presión mínima de la bomba; deje los otros valores predefinidos
(acéptelos presionando la tecla enter.
9. Encendido Horno: Después de haber encendido el L-7350 columna de
horno, se debe dar enter en la pantalla que tiene para que comience a subir
la temperatura del mismo hasta 30°C.
10. Configuración Detector: En el módulo L-7470 Detector de conductividad
(conductivity detector), se debe poner en rango 1.
11. Procedimientos de limpieza: una vez encendida la bomba, para limpiar
las impurezas que existen por anteriores inyecciones en el equipo se debe
dejar correr agua desionizada durante 10 min. Seguido a esto, se debe
realizar una purga del equipo. Para esto, se debe abrir la válvula que se
encuentra en el modulo de la bomba. Después de abrirla, se oprime el
botón “purge”, inmediatamente el flujo se va a poner como 9.9999 y se
espera 4 minutos mientras se retiran las impurezas de inyecciones
anteriores. Pasados los 4 minutos se oprime de nuevo el botón “purge” y el
flujo debe regresar al programado (ej. 1 l/min) y finalmente se cierra la
válvula para que la columna no sufra.
12. Limpieza del loop: para garantizar que el loop se encuentra
completamente limpio, se debe inyectar agua desionizada y/o
desmineralizada con una jeringa, llenándola tres veces la capacidad del loop
(loop vol = 250µl). Recuerde que la jeringa tampoco puede tener burbujas.
Realice esta inyección tres veces.
13. Línea Base: después de haber realizado la limpieza, se debe poner a
estabilizar el equipo, dejando pasar agua desionizada o desmineralizada. Con
eso lo que se busca es establecer la línea base sobre la cual se van a dejar
estandarizadas las medidas. Después de pasados inicialmente 15 minutos, en
el modulo del detector de conductividad hay una tecla que di ce “autozero”,
se oprime para que el equipo comience a crear la línea base y se esperan
otros 20 minutos.
14. Tabla de información de la muestra: Para crear la tabla de muestras
bajo la cual se van a ingresar los patrones o muestras, se debe hacer clic en
el icono que tiene una tabla.
Se abre la ventana “Open File”, se debe seleccionar una de las tablas
existentes y dar OK, como se puede observar en la siguiente figura.
Después de esto se va a File, New, Sample Table y aparece una nueva tabla.
Una vez aparece la nueva tabla, se le asigna un nuevo nombre y se ingresa la
información de la muestra a ser leída.
En el icono que se encuentra al lado de la tabla verde, se realiza click y se abrirá
la tabla donde se ingresan los datos sobre la información de la muestra. Se debe
tener en cuenta que si la inyección es de las soluciones estándar, en la columna
cuatro llamada “Type”, se debe especificar el numero de estándar que se va a
ingresar (ejm. Std. 1) para garantizar que en el momento de realizar la curva de
calibración del equipo se van a reconocer de tal forma. En caso que se vaya a
inyectar muestra, se debe poner como UNK que es “desconocido”.
Una vez se ha terminado de ingresar la información concerniente a la muestra a
inyectar, se debe guardar lo que se realizo en File, Save Simple.
15. Hacer Clic en el Ojo para iniciar, las inyecciones teniendo en cuenta la
secuencia de la tabla anteriormente creada.
16. En el cuadro de Dialogo “Open simple Table for Data Acquisition se
muestran las diferentes tablas creadas, seleccionar la que se va ha utilizar.
Dar Clic en OK.
17. Aparece una ventana en la cual se muestra la intensidad (Mv) de la curva
por inyección de muestra, contra el tiempo en minutos. Además aparecen
tres opciones de trabajo.
Elegir una de las anteriores dependiendo del tipo de corrida a realizar: Start Run si
se va ha realizar una sola inyección; Start Series cuando se necesita llevar una
secuencia de inyecciones definidas en la tabla de muestras y Noise Test si se
quiere revisar el nivel de ruido en el sistema.
18. Definición tiempo de corrida de Muestra: En el menú Acquire,
seleccionar Stop Time. Definir el tiempo en minutos y hacer Clic en OK.
19. AL seleccionar “Start Run” o “Start Series”, aparece un cuadro de Dialogo
indicando el momento en el cual se debe realizar la inyección y un cuadro de
dialogo el cual indica, estado, nombre del método, la tabla de muestra, serie,
tipo de muestra, presión y flujo de trabajo.
20. Inyección de patrones o muestra: una vez se ha dado clic en el botón
“Star series”, como veíamos en el anterior ítem, el programa comienza a pedir
las inyecciones en el orden que se programaron en la tabla de datos. Se
recomienda que por cada estándar se realicen tres repeticiones para con esto
garantizar que la curva quede bien realizada. Al realizar la inyección, en la
jeringa no puede quedar ninguna burbuja, ya que esto va a generar errores
en la lectura de la muestra. Recuerde que se debe inyectar tres veces la
capacidad del loop para garantizar el llenado, por lo cual tendrían que ser
750µl.
En el momento de la inyección, se debe bajar la perilla que esta junto al loop
para permitir el ingreso de la muestra, una vez se ha inyectado todo,
rápidamente se sube la perilla y se debe dejar la jeringa allí introducida
durante por lo menos un minuto mas, como se puede ver en la figura XXXX.
21. Revisión de los cromatogramas obtenidos: una vez se han terminado
de realizar las inyecciones, para poder revisar los cromatogramas obtenidos,
se debe hacer Clic en el icono . Aparecerá el cuadro de dialogo
“Open File”. Dirigirse hasta File Type, seleccionar Data. Seleccionar en
Aplicación, Conductividad. Aparecerán una serie de datos elegir de la lista el
que se desea ver y dar Clic en OK para que se muestre la información
requerida.
22. Inmediatamente se abre una ventana que contiene la información de la
Tabla de inyección seleccionada con las diferentes inyecciones realizadas con
la siguiente información. Numero del Vial, Volumen inyectado, Tipo, Nombre
de la muestra, Concentración.
23. Opciones de trabajo del cromatograma:
Display: Cuando solo se quiere el cromatograma de una inyección.
Multidisplay: Para revisar al mismo tiempo el cromatograma de dos o mas
inyecciones.
Recalculate: Cuando wl resultado de los picos no es muy convincente y se quiere
corroborar la información.
Calibration: para Realizar la curva de calibración.
Modify Report: Para editar el reporte
24. En la ventana de Display. Se puede disponer del cromatograma, moverlo,
superponerlo para comprar los resultados con otros ya existentes.
25. Curva de calibración: para poder realizar la curva de calibración el analito
objeto de estudio, se deben seleccionas las inyecciones realizadas con patrón,
y se debe hacer clic en “Recalculate” como se ve en la XXXXXXX.
PENDIENTE PANTALLAZO
Después de esto, se da clic en “Calibration” para que el programa realice la
respectiva curva de calibración. Como se ve en la XXXXXX.
26. Reporte de resultados: Hacer Clic en icono , donde aparecerá
una ventana con una serie de datos, seleccionar en File Type, reporte y en
Aplication Conductividad. Aparecerá una serie de datos seleccionar los
necesarios para generar el reporte definitivo. Dar clic en OK.
22. Aparece el Reporte en una ventana con varias opciones, para editar e
imprimir el reporte. Y finalmente aparece el reporte completo listo para imprimir.
27. Salir del Programa: Dirigirse al menú File y seleccionar Close All.
21. Y finalmente en seleccionar exit.
