NORMA IRAM-INTA

ARGENTINA 15935-2
15935-2 Primera edición
2008 2008-06-20

Productos del NOA (noroeste argentino)

Propóleos

Parte 2 - Extractos de propóleos

NOA (Argentinean northwest) products

Propolis
Part 2 - Propolis extracts

Referencia Numérica:
IRAM-INTA 15935-2:2008
IRAM 2008-06-20
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cualquier medio, incluyendo fotocopiado y microfilmación, sin permiso escrito del IRAM.

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Prefacio
El Instituto Argentino de Normalización y Certificación (IRAM) es
una asociación civil sin fines de lucro cuyas finalidades específicas,
en su carácter de Organismo Argentino de Normalización, son
establecer normas técnicas, sin limitaciones en los ámbitos que
abarquen, además de propender al conocimiento y la aplicación de
la normalización como base de la calidad, promoviendo las
actividades de certificación de productos y de sistemas de la
calidad en las empresas para brindar seguridad al consumidor.

IRAM es el representante de la Argentina en la International

Organization for Standardization (ISO), en la Comisión
Panamericana de Normas Técnicas (COPANT) y en la Asociación
MERCOSUR de Normalización (AMN).

Esta norma IRAM es el fruto del consenso técnico entre los

diversos sectores involucrados, los que a través de sus
representantes han intervenido en los Organismos de Estudio de
Normas correspondientes.

Esta norma fue estudiada en el marco del convenio con INTA

(Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria).

Esta norma, bajo el rubro general de Productos del NOA (noroeste

argentino). Propóleos, se compone de las partes siguientes:

Parte 1 - Propóleos en bruto.

Parte 2 - Extractos de propóleos.

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Índice
Página
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN .............................................................. 5

2 DOCUMENTOS NORMATIVOS PARA CONSULTA ........................................ 5

3 DEFINICIONES ................................................................................................. 6

4 REQUISITOS .................................................................................................... 6

5 MUESTREO ...................................................................................................... 7

6 MÉTODOS DE ENSAYO .................................................................................. 7

Anexo A (Informativo) Bibliografía....................................................................... 18

Anexo B (Informativo) Integrantes de los organismos de estudio ....................... 20

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Productos del NOA (noroeste argentino)

Propóleos
Parte 2 - Extractos de propóleos

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN IRAM 21306 - Drogas para análisis. Ácido nítrico
(HNO3).
1.1 Establecer los requisitos que deben cum- IRAM 21322 - Agua para análisis. Requisitos y
plir los extractos de propóleos para consumo métodos de ensayo.
directo o para ser utilizado como materia prima
en el desarrollo de productos.
IRAM 21324 - Drogas para análisis. Ácido orto-
fosfórico (H3PO4). (Ácido fosfórico).
1.2 Esta norma es aplicable a todos extractos
derivados del propóleos. IRAM 21326 - Drogas para análisis. Alcohol etíli-
NOTA. La parte 1 de esta norma IRAM-INTA establece
co (C2H5OH) (etanol).
los requisitos para el propóleos en bruto.
IRAM 21338 - Drogas para análisis. Carbonato
de sodio anhidro. (Na2CO3).

2 DOCUMENTOS NORMATIVOS PARA IRAM 21344 - Drogas para análisis. Metanol.

CONSULTA (CH3OH) (alcohol metílico).

Los documentos normativos que se indican a IRAM 21360 - Drogas para análisis. Éter etílico
continuación son indispensables para la aplica- absoluto (CH3CH2)2O. (Éter dietílico absoluto).
ción de este documento.
IRAM 21396 - Drogas para análisis. Permanga-
Para los documentos normativos en los que se nato de potasio KMnO4.
indica el año de publicación, se aplican las edi-
ciones citadas. IRAM-AQA AA 91002 - Artículos de vidrio para
laboratorio. Balones, matraces, balones de
Para los documentos normativos en los que no Kjeldahl y balones de destilación.
se indica el año de publicación, se aplican las
ediciones vigentes, incluyendo todas sus modi- IRAM-AQA AA 91004 - Artículos de vidrio para
ficaciones. laboratorio. Erlenmeyer.

IRAM 9115 - Termómetro de vidrio. De precisión IRAM-AQA AA 91005 - Artículos de vidrio para
largos, con escala grabada sobre el cuerpo laboratorio. Embudos.
(STL).
IRAM-AQA AA 91006 - Artículos de vidrio para
IRAM 15970 - Miel. Buenas prácticas de higie- laboratorio. Tubos de ensayo.
ne y de procesamiento.
IRAM-AQA AA 91021 - Artículos de vidrio para
IRAM 21301 - Drogas para análisis. Ácido sulfú- laboratorio. Picnómetros.
rico.
IRAM-AQA AA 91023 - Artículos de vidrio para
IRAM 21302 - Drogas para análisis. Ácido clorhí- laboratorio. Ampolla de decantación.
drico.

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3 DEFINICIONES 4.1.2 Para la higiene, se deben aplicar las

buenas prácticas de manufactura según la
IRAM 15970.
Para los fines de la presente norma se aplica la
definición siguiente:
4.2 Requisitos sensoriales
extracto alcohólico de propóleos. Producto La determinación de cada requisito se debe rea-
semielaborado que se obtiene cuando se proce- lizar mediante los sentidos.
sa el propóleos con alcohol etílico, de manera de
extraer los componentes biológicamente activos.
– Olor. Característico de este producto: resino-
NOTA. El extracto contiene básicamente propóleos, alcohol
so o balsámico, según su origen botánico o
etílico y agua. Posteriormente, se evapora el alcohol a una geográfico.
temperatura baja y controlada, de manera de no afectar los
compuestos bioactivos. A partir del extracto se pueden des- – Color. Variable, según su origen botánico o
arrollar una gran variedad de productos. geográfico y su concentración.

– Sabor. Variable, de suave a fuerte, amargo y

4 REQUISITOS picante.

4.3 Requisitos físicos y químicos. El extracto

4.1 Higiene de propóleos debe cumplir los requisitos siguien-
tes:
4.1.1 El extracto de propóleos no debe contener
sustancias extrañas a sus procesos de produc-
ción y elaboración.

Tabla 1 - Requisitos físicos y químicos

Método de
Requisito Unidad Mínimo Máximo
ensayo

Extracto seco (materia seca) 10,0 – 6.3

Sustancias extraíbles en
– 2,0 6.4
n-hexano1)
Compuestos fenólicos tota- g/100 g
les, expresados como ácido 0,25 – 6.5
gálico
Flavonoides 0,25 – 6.6
Índice de oxidación s – 22 6.7
Debe presentar un pico de absorción
Espectro de absorción al UV – 6.8
entre 270 nm y 315 nm
1)
Si bien otras normativas denominan este requisito como ceras, el método aplicado determina otras sustancias extraí-
bles en n-hexano distintas de las ceras.

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4.4 Acondicionamiento. El extracto de propó- Tabla 3 - Muestreo al azar

leos debe ser envasado en recipientes de
material bromatológicamente apto, almacena- Nº total de recipien- Nº mínimo de
dos en un sitio oscuro y fresco. El envase debe tes de la partida recipientes que se
ser tal que le confiera al producto una protec- deben muestrear
ción adecuada respecto de la humedad, la luz y
la temperatura excesiva. 1a3 Cada recipiente
4 a 20 3
4.5 Aditivos. No se debe agregar al extracto
de propóleos ningún tipo de aditivos. 21 a 60 4
61 a 80 5
4.6 Contaminantes. Se debe cumplir con la
legislación vigente referida a la presencia de 81 a 120 6
contaminantes.
Más de 120 1 recipiente cada 20
En la tabla 2 se indican los límites máximos de
los contaminantes siguientes.
Se debe tomar más de una muestra parcial de la
Tabla 2 - Contaminantes partida, el número de las muestras y la profundi-
dad a la cual es extraída, depende de la
capacidad del recipiente.
Método
Requisito Unidad Máximo
de ensayo Las muestras parciales no se deben extraer a
distancias del fondo o de la superficie, inferiores
Plomo, expresa- a un décimo del espesor total.
mg/kg 2,0 6.9
do como Pb
referido
a mate-
Arsénico, expre- ria seca 1,0 6.10
sado como As 6 MÉTODOS DE ENSAYO

6.1 Preparación de la muestra

4.7 Residuos de plaguicidas. Se debe cumplir
con la legislación vigente referida a la presencia La muestra debe conservarse en un frasco oscu-
de residuos de plaguicidas. ro o ámbar, bien cerrado, en un lugar fresco y
protegido de la luz, preferentemente refrigerado
4.8 Residuos de antibióticos y medicamen- entre 4 qC y 10 qC, para evitar la evaporación de
tos veterinarios. Se debe cumplir con la alcohol, hasta que se lleve a cabo el análisis.
legislación vigente referida a la presencia de
residuos de antibióticos y otros medicamentos 6.2 Determinación de la densidad a 20 qC
veterinarios.
6.2.1 Instrumental

5 MUESTREO [Link] Balanza analítica.

[Link] Picnómetro de vidrio (IRAM-AQA

El producto se debe muestrear al azar de acuer- AA 91021), de capacidad nominal mínima de
do con la tabla siguiente: 50 ml.

[Link] Baño de agua, capaz de mantener la

temperatura a 20 qC ± 0,2 qC.

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[Link] Termómetro normalizado (IRAM 9115) 6.2.4 Cálculos

graduado hasta 50 qC, con divisiones al 0,2 qC ó
0,1 qC. La densidad relativa, d 20
20 se determina con la

fórmula siguiente:
6.2.2 Reactivos
m2  m0
[Link] Agua para análisis (IRAM 21322), recién d 20
20
m1  m 0
hervida y enfriada a aproximadamente 20 qC.
siendo:
[Link] Etanol (IRAM 21326).
d 20
20 la densidad relativa a 20 qC;
[Link] Éter etílico (IRAM 21360).
m0 la masa, en gramos, del picnómetro va-
6.2.3 Procedimiento
cío, determinada según [Link];
[Link] Preparación del picnómetro.
m1 la masa, en gramos, del picnómetro
Se lava cuidadosamente el picnómetro ([Link]) lleno con agua, determinado según
y luego se enjuaga sucesivamente con, por [Link];
ejemplo, etanol y éter etílico; finalmente se se-
ca el interior por medio de una corriente de aire m2 la masa, en gramos, del picnómetro lle-
seco. no con el producto según [Link].

Si fuera necesario, se limpian las paredes exter-

6.3 Determinación de extracto seco
nas con un paño seco o papel de filtro.

Cuando se alcanza la temperatura de equilibrio 6.3.1 Instrumental

entre la caja de la balanza y el picnómetro, se
pesa éste con su tapa. [Link] Balanza analítica.

[Link] Pesada del picnómetro con agua para [Link] Cristalizador.

análisis.
[Link] Desecador, provisto de un agente dese-
Se llena el picnómetro con agua para análisis cante adecuado.
([Link]).
[Link] Estufa, que opere a una temperatura de
Se sumerge el picnómetro en el baño de agua 100 qC ± 2 qC.
([Link]). Después de 30 min, se ajusta el agua
hasta el enrase, se inserta la tapa y si fuera ne- [Link] Embudo.
cesario se seca exteriormente con un paño seco
o con papel de filtro. 6.3.2 Reactivos

Cuando se alcanza la temperatura de equilibrio Agua para análisis (IRAM 21322).

entre la caja de la balanza y el picnómetro, se
pesa éste con su tapa. 6.3.3 Procedimiento

[Link] Pesada del picnómetro con el producto. La determinación se realiza por duplicado.

Se vacía el picnómetro, luego se lava y se seca Se pesan 20 g de extracto de propóleos en un

como especifica en [Link]. cristalizador, previamente tarado, se pesa el con-
junto y se lleva a estufa a 100 qC ± 2 qC para
Se procede como se especifica en [Link] reem- eliminar completamente el solvente. Luego se re-
plazando el agua por la muestra de ensayo tira el cristalizador, se coloca en un desecador
preparada según 6.1. hasta que llegue a temperatura ambiente, y se

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pesa hasta constancia de masa, lo cual se verifi- 6.4.2 Reactivos

ca cuando dos pesadas sucesivas no difieran
entre sí en más de 5 mg. n-hexano (IRAM 21429).

6.3.4 Cálculos 6.4.3 Procedimiento

Para calcular el extracto seco, se utiliza la fórmu- Se parte de la masa seca obtenida en la deter-
la siguiente: minación de extracto seco y se tritura.
m1  m 0 Se pesan aproximadamente 2 g, se colocan en
ES ˜ 1 00
m2 un cartucho de celulosa seco, o se envuelven en
un papel de filtro seco y se sujeta con hilo de al-
siendo: godón desgrasado.
ES el extracto seco, en gramos por cien Se coloca la muestra preparada en el cuerpo de
gramos; un extractor de Soxhlet.
m0 la masa del cristalizador, en gramos;
Se pesa el balón del extractor de Soxhlet y se
m1 la masa del cristalizador más el residuo coloca en él un volumen adecuado de n-hexano
seco, en gramos; (6.4.2), se conecta al extractor y se comienza a
calentar hasta que el solvente entre en ebullición
m2 la masa de la muestra en gramos. y se mantenga en esas condiciones durante 6 h,
a una velocidad de aproximadamente 120 gotas
La muestra se reserva para la determinación de a 150 gotas de condensado por minuto.
sustancias extraíbles en n-hexano según 6.4.
Transcurrido ese tiempo se comprueba si ha fi-
6.4 Determinación de sustancias extraíbles nalizado la extracción sacando por la llave lateral
en n-hexano un par de gotas del solvente en contacto con la
muestra, se las coloca en un vidrio de reloj, se
6.4.1 Instrumental evapora el n-hexano y se controla que no que-
den residuos.
[Link] Balanza analítica.
En el balón queda la cera disuelta en n-hexano;
[Link] Equipo para extracción, tipo Soxhlet o se evapora dicho solvente, para lo cual se coloca
similar. el balón en una estufa a 80 qC por lo menos
30 min. Después de evaporado el n-hexano, se
[Link] Cartuchos de celulosa o de papel de fil- retira el balón de la estufa, se coloca en un de-
tro, secados en estufa a 80 qC. secador hasta temperatura ambiente y se pesa.
Se repite el último procedimiento hasta lograr
[Link] Calefactor eléctrico. constancia de masa, lo cual se verifica cuando
dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en
[Link] Estufa con circulación de aire, que opere más de 5 mg.
a una temperatura de 80 qC, preferentemente
NOTA. Si se desea recuperar el hexano usado, se reco-
forzada. mienda montar un equipo de destilación a baño maría de
entre 70 qC y 75 qC (ver la serie IRAM-ISO 14000 de nor-
[Link] Desecador, provisto de un agente dese- mas de gestión ambiental).
cante adecuado.
6.4.4 Cálculos
[Link] Equipo de destilación.
Se calcula el contenido de sustancias extraí-
bles, SE, mediante la fórmula siguiente:

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(B c1  B c0 ) lución refrigerada a 4 qC, y se la utiliza después

SE ˜ 100 de 48 h de haberla preparado.
m

siendo: [Link] Reactivo de Folin-Ciocalteu. Se prepara

a partir de los componentes siguientes:
SE el contenido de sustancias extraíbles
en n-hexano, en gramos por 100 gra- – 100 g de wolframato de sodio hidratado p.a.;
mos;
– 25 g de molibdato de sodio hidratado;
Bc1 la masa del balón con sustancias ex- – 50 ml de ácido fosfórico de 85 ml/100 ml
traíbles (seco), en gramos; (IRAM 21324);
Bc0 la masa del balón vacío (seco), en – 100 ml de ácido clorhídrico de 36 ml/100 ml
gramos; (IRAM 21302);
– 150 g de sulfato de litio hidratado;
m la masa de la muestra, en gramos.
– Bromo (ampollas).
Se informa el promedio de las dos determina-
ciones siempre y cuando los resultados indivi- Se mezclan los reactivos mencionados dentro de
duales no difieran en más de 5% del valor un balón de 1 000 ml y se calienta a reflujo sua-
obtenido. De no ser así, se repite el ensayo. Se ve, durante 10 h. Luego se deja enfriar, y se lava
expresa el resultado con una cifra decimal. el condensador con 50 ml de agua para análisis,
la que se escurre sobre el balón. Se añaden
150 g de sulfato de litio hidratado y una o dos go-
6.5 Determinación de compuestos fenólicos
tas de bromo. Luego se lleva ebullición, sin el
totales
condensador, dentro de una campana de extrac-
ción de gases, hasta que la solución quede libre
6.5.1 Instrumental
de bromo (lo que se evidencia porque el color
verde se torna amarillo brillante).
[Link] Espectrofotómetro que permita hacer lec-
turas de absorbancia a 765 nm. NOTA. El reactivo de Folin-Ciocalteau está disponible en el
comercio ya listo para usar.
[Link] Baño de agua, que opere a una tempera-
tura de 50 ºC. [Link] Solución de carbonato de sodio. Se di-
suelven 159 g de carbonato de sodio anhidro
[Link] Matraces aforados, adecuados para la (IRAM 21338) en 700 ml de agua para análisis
preparación de las soluciones (IRAM-AQA caliente. Se enfría y se completa a 1 000 ml con
AA 91024). agua análisis, en un matraz aforado.

[Link] Balón, de 1 000 ml (IRAM-AQA 6.5.3 Trazado de la curva de calibración

AA 91002).
Se debe efectuar una curva de calibración para
[Link] Condensador de reflujo. cada serie de ensayos.

[Link] Cubetas de vidrio. Se toman alícuotas de 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml

y 25 ml de la solución de referencia ([Link]), y
6.5.2 Reactivos se colocan en matraces aforados de 25 ml y se
deja un matraz vacío como blanco. Se comple-
[Link] Agua para análisis (IRAM 21322). ta el volumen con una solución de etanol de
10 ml/100 ml. Las diluciones así preparadas
[Link] Solución de referencia de ácido gálico de deben contener 0 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml;
0,5 mg/ml. Se disuelven 0,05 g de ácido gálico 0,3 mg/ml; 0,4 mg/ml y 0,5 mg/ml, respectiva-
en agua para análisis y se lleva a un volumen de mente, de ácido gálico.
100 ml en un matraz aforado. Se mantiene la so-

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Se toma 1 ml de cada una de las soluciones de se enfría en baño de agua hasta temperatura
referencia diluidas y se coloca en matraces afo- ambiente.
rados de 25 ml, se agregan 10 ml de agua para
análisis y 1 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu, Se coloca la solución en una cubeta de vidrio y
se agita suavemente y se deja en reposo du- se lee la absorbancia en un espectrofotómetro a
rante 2 min. 765 nm, contra un blanco preparado en las mis-
mas condiciones, conteniendo los reactivos y
Se añaden 4 ml de la solución de carbonato de utilizando 1 ml de agua para análisis en lugar de
sodio ([Link]) y se completa el volumen con muestra.
agua para análisis, sin agitar. Finalmente, se ca-
lienta en un baño de agua a 50 qC durante 5 min, Con el valor de absorbancia obtenido, se interpo-
y se enfría hasta temperatura ambiente. la en la curva de calibración (6.5.3), y se
determina el valor buscado.
Se coloca la solución en una cubeta de vidrio y
se lee la absorbancia en un espectrofotómetro a 6.5.5 Cálculos
765 nm, contra un blanco preparado en las mis-
mas condiciones conteniendo los reactivos, y La cantidad de fenoles totales (F) expresada en
utilizando 1 ml de agua para análisis en lugar de gramos en la muestra tomada es:
la solución de referencia diluida.
Fe
F = Vm ˜ G ˜ (1)
Para el trazado de la curva de calibración es 100
conveniente disponer de 4 a 5 repeticiones y en
principio considerar el valor promedio. Además, siendo:
se debe tener en cuenta la dilución que se pro-
duce en las soluciones de referencia diluidas al Fe el contenido de fenoles totales, en gra-
colocarlas en el matraz de 25 ml donde se agre- mos por cien gramos;
gan los reactivos para la lectura final.
G la densidad del extracto, en gramos por
6.5.4 Procedimiento mililitro.
Se pipetean 5 ml de extracto (Vm), se colocan en La concentración de fenoles totales en la solu-
un matraz de 100 ml (VS) y se completa a volu- ción que se coloca en la cubeta del espectro-
men con etanol. Esta solución se reserva para la fotómetro es:
determinación del contenido de flavonoides tota-
les y el análisis espectrofotométrico. VT1 Vt Vm Fe
F= ˜ ˜ ˜ ˜ G ˜ 1 000 (2)
Se pipetean 10 ml de la solución anterior (Vt) y V1 VS Vc 100
se colocan en un matraz aforado de 100 ml (V1).
Se completa con agua para análisis y se agita siendo:
vigorosamente para estabilizar la emulsión for-
mada. 1 000 el factor para expresar la concentración
en miligramos por mililitro.
Se toma 1 ml (VT1) de la solución anterior y se
coloca en un matraz aforado de 25 ml (VC). Se La curva de calibración relaciona la absorbancia
agregan 10 ml de agua para análisis y 1 ml del con la concentración de la sustancia de referen-
reactivo de Folin-Ciocalteu, se agita suavemente cia, en este caso ácido gálico mediante la
y se deja en reposo durante 2 min. expresión Abs = f (F). Generalmente se obtiene
una recta con ordenada al origen igual a cero.
Se añaden 4 ml de la solución de carbonato de Por lo tanto:
sodio ([Link]) y se completa el volumen con
agua para análisis, sin agitar. Finalmente, se ca- Abs b ˜F (3)
lienta en un baño de agua 50 qC durante 5 min, y

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siendo: [Link] Solución patrón de quercetina de

100 Pg/ml. Se toman 10 ml de la solución madre
Abs el valor de absorbancia leído; ([Link]), y se diluyen a 100 ml con metanol. Se
debe conservar en la oscuridad y refrigerada.
b la pendiente de la recta;
[Link] Solución de tricloruro de aluminio de
F la concentración de la solución de refe- 5 g/100 g. Se pesan 10 g de tricloruro de alu-
rencia, en miligramos por mililitro. minio, con mucho cuidado, empleando guantes
y barbijo, ya que el producto es muy corrosivo e
Despejando F de (3) e igualando con (2): higroscópico, y se disuelven en 200 ml de me-
tanol.
Abs V V V
Fe ˜ 1 ˜ S ˜ C (4) 6.6.2 Trazado de la curva de calibración
10 ˜ b ˜ G VT1 Vt Vm
Para realizar esta curva de calibración se pre-
siendo:
paran soluciones de 2 Pg/ml, 4 Pg/ml, 6 Pg/ml,
Abs la absorbancia de la muestra, leída a 8 Pg/ml y 10 Pg/ml de quercetina, respectiva-
765 nm. mente.

La fórmula (4) es la ecuación general, pero para En seis matraces aforados de 25,0 ml se pipe-
las condiciones enunciadas en esta técnica re- tean 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml y 2,5 ml de la
sulta la siguiente: solución patrón de quercetina ([Link]) y se de-
ja uno como blanco. Se agregan 0,5 ml de la
Abs 100 100 25 solución de tricloruro de aluminio [Link] a cada
Fe ˜ ˜ ˜ (5) una de ellas y al blanco. Se enrasa a 25 ml con
10 ˜ b ˜ G 1 10 5 metanol. Se deja 30 min en la oscuridad, y se
leen las absorbancias a 425 nm.
Abs 2500
Fe ˜ (5c)
b ˜ G Vm 6.6.3 Procedimiento

El resultado obtenido en (5c) indica el contenido Se pipetean 5 ml de extracto (Vm), se colocan en

de compuestos fenólicos totales, en g/100 g de un matraz de 100 ml (VS) y se completa el volu-
extracto de propóleos, expresado como su men con etanol. Esta solución se reserva para la
equivalente en ácido gálico. determinación del contenido de fenoles totales y
el análisis espectrofotométrico.

6.6 Determinación de flavonoides totales Se pipetea 0,1 ml (Vt) de la solución anterior en

un matraz de 25 ml (Vc), se agregan 0,5 ml de
6.6.1 Reactivos solución de tricloruro de aluminio ([Link]) y se
enrasa con metanol.
ADVERTENCIA. Debido a la peligrosidad de
los reactivos utilizados en esta técnica se Se prepara un blanco con 0,1 ml de alcohol etíli-
debe utilizar propipeta en todas las medi- co y 0,5 ml de solución de tricloruro de aluminio
ciones de volumen. ([Link]) y se enrasa con metanol.
[Link] Metanol (IRAM 21344). Se deja 30 min en la oscuridad, se coloca en una
cubeta de vidrio y se lee la absorbancia a
[Link] Tricloruro de aluminio, p.a. 425 nm. Si la absorbancia es mayor que 0,400
se repite la determinación tomando un volumen
[Link] Solución madre de quercetina de menor de extracto alcohólico. Del mismo modo,
1 mg/ml. Se disuelven 100 mg de quercetina di- si se obtiene una lectura muy baja, se aumenta
hidratada en 100 ml de metanol. Se debe con- el volumen de dicho extracto.
servar en la oscuridad y refrigerada.

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6.6.4 Cálculos Igualando (2) y (3) y despejando:

El contenido de flavonoides totales (Flt), expre- Abs VS VC 1

sado en gramos, en la muestra tomada es: Fl ˜ ˜ ˜ (9)
G ˜ b V1 Vm 10 000
Fl
Flt = Vm ˜ į ˜ (6) siendo:
100
Abs el valor de absorbancia de la muestra,
siendo: leído a 425 nm.
Fl el contenido de flavonoides totales, en La fórmula (4) es la ecuación general, pero para
gramos por cien gramos; las condiciones enunciadas en esta técnica, re-
sulta la siguiente:
G la densidad del extracto.
Abs 2.5
La concentración de flavonoides totales en la Fl ˜ (10)
solución que se coloca en la cubeta del espec- G ˜ b Vm
trofotómetro es:
siendo:
Fl V1 1 000 000
Flt = Vm ˜ G ˜ ˜ ˜ (7) Fl el contenido de flavonoides totales, en
100 Vs VC g/100 g de extracto de propóleos.

siendo: El resultado obtenido en (10) indica el contenido

de flavonoides totales, en g/100 g de extracto de
1 000 000 el factor para expresar la concentra- propóleos, expresado como su equivalente en
ción en microgramos por mililitro. quercetina dihidratada.

La curva de calibración relaciona la absorbancia 6.7 Determinación del índice de oxidación

con la concentración de la sustancia de referen-
cia, en este caso quercetina dihidratada, 6.7.1 Instrumental
mediante la expresión Abs = f (Flt). Generalmen-
te se obtiene una recta con ordenada al origen [Link] Balanza analítica.
igual a cero. Por lo tanto:
[Link] Erlenmeyer, de 125 ml (IRAM-AQA
Abs = b · Flt AA 91004).
siendo: [Link] Embudo (IRAM-AQA AA 91005).
Abs el valor de absorbancia leído; [Link] Papel de filtro de velocidad de filtración
rápida.
b la pendiente de la recta;
[Link] Tubo de ensayo (IRAM-AQA AA 91006).
Flt la concentración de la solución de refe-
rencia, en miligramos por mililitro. [Link] Cronómetro.
Abs 6.7.2 Reactivos
Flt (8)
b
[Link] Etanol (IRAM 21326).

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[Link] Ácido sulfúrico (IRAM 21301). 6.8.2 Reactivos

[Link] Solución de ácido sulfúrico de Etanol (IRAM 21326).

20 ml/100 ml.
6.8.3 Procedimiento
[Link] Permanganato de potasio (IRAM 21396).
Se efectúa una dilución de la muestra de 1 en
[Link] Solución de permanganato de potasio 10 000 con alcohol etílico y se prosigue como se
0,1 N. indica a continuación.

6.7.3 Procedimiento Se lee la absorbancia a 290 nm (zona en la que

muchos tipos de propóleos tienen un máximo de
La determinación se efectúa por duplicado. absorbancia), y si este valor se encuentra entre
0,5 y 0,8 unidades de absorbancia, se efectúa el
Se colocan 100 ml de agua para análisis en un barrido completo de longitudes de onda, a inter-
erlenmeyer de 125 ml. Se pipetean 2 ml de la valos de 10 nm, desde 240 nm hasta 420 nm. En
muestra de extracto de propóleos y se agregan las zonas en las que haya un posible máximo de
lentamente sobre el agua mientras se agita. Se absorbancia, se efectúa un barrido más fino, de
filtrar a través de un papel de filtro y se recoger el 1 en 1 nm.
filtrado en un vaso de precipitación o erlenmeyer
de volumen adecuado. Si la absorbancia medida inicialmente a 290 nm
es mayor de 0,8, o menor de 0,5 unidades de
Se colocan 2 ml del filtrado en un tubo de ensa- absorbancia, se debe corregir la dilución efec-
yo, se añade 1 ml de solución de ácido sulfúrico tuada inicialmente.
([Link]) y se agita durante 1 min.
Se grafican los valores de absorbancia medidos
Finalmente, se agregan en el tubo 0,05 ml en función de la longitud de onda de la radiación.
(1 gota) de la solución de permanganato de po- La presencia de compuestos fenólicos resulta
tasio 0,1 N y se pone en marcha el cronómetro positiva si se registra un máximo de absorbancia
en el preciso momento en que la gota se pone entre 270 nm y 315 nm.
en contacto con la solución acidulada de propó-
leos, agitando constantemente. La gota debe
6.9 Determinación de plomo
caer directamente sobre la solución y no sobre
las paredes del tubo. Se registra el tiempo, en
6.9.1 Reactivos
segundos, que la solución tarda en decolorarse.
ADVERTENCIA. Debido a la peligrosidad de
Se expresa el resultado, en segundos, como el
los reactivos utilizados en esta técnica se
promedio de ambas determinaciones.
debe utilizar propipeta en todas las medi-
ciones de volumen.
6.8 Determinación del espectro de absorción
UV – visible [Link] Agua para análisis (IRAM 21322).

6.8.1 Instrumental [Link] Ácido nítrico (IRAM 21306).

[Link] Espectrofotómetro de UV-visible, que [Link] Solución stock de plomo de 100 Pg/ml.
permita trabajar en un rango de longitudes de Se disuelven 0,1599 g de nitrato de plomo en
onda comprendido entre 240 nm y 420 nm. aproximadamente 200 ml de agua para análisis.
Se agregan 10 ml de ácido nítrico concentrado y
[Link] Cubetas de cuarzo, de 1 cm de camino se diluye a 1 000 ml con agua para análisis.
óptico, para trabajar en la región UV del espectro.

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[Link] Solución de trabajo de plomo de calienta durante 4 h, aspirándose los vapores

2 Pg/ml. Se diluyen 20 ml de la solución stock nitrosos con un sistema con trampa de agua.
([Link]) a 1 000 ml con agua para análisis libre
de plomo. Una vez terminada la digestión se filtra el con-
tenido del balón o el tubo de digestión en un
[Link] Solución de ácido nítrico (1 + 4). Se dilu- matraz aforado de 50 ml, se enjuagan el tubo o
yen 200 ml de ácido nítrico concentrado a 1 L balón y el papel de filtro con agua para análisis
con agua para análisis. caliente, y finalmente se enrasa a 50 ml.

[Link] Solución reductora de citrato cianuro 6.9.4 Curva de calibración

amoniacal. Se disuelven 400 g de citrato de
amonio dibásico [(NH4)2HC6H5O7], 20 g de sulfito Se pipetean 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml y 10 ml de la
de sodio anhidro, 10 g de clorhidrato de hidroxi- solución de trabajo de plomo ([Link]) en una
lamina ([Link]), y 40 g de cianuro de ampolla de decantación de 125 ml, que corres-
potasio, en agua para análisis, y se diluye a ponden a 4 Pg, 8 Pg, 12 Pg, 16 Pg y 20 Pg de
1 000 ml. Se mezcla esta solución con 2 000 ml plomo.
de hidróxido de amonio concentrado.
Se agregan 50 ml de la solución de citrato-
[Link] Solución stock de ditizona de 100 Pg/ml. cianuro amoniacal, se mezcla y se enfría a tem-
Se disuelven 100 mg de ditizona en 1 000 ml de peratura ambiente. Se adicionan 10 ml de la
cloroformo p.a. solución de trabajo de ditizona ([Link]), se agita
vigorosamente durante 30 s, y se deja que las
[Link] Solución de trabajo de ditizona de fases se separen.
40 Pg/ml. Se diluyen 100 ml de solución stock de Se descarga la fase clorofórmica en un vaso de
ditizona ([Link]) a 250 ml con cloroformo. precipitación, y se filtra recogiendo el filtrado en
la cubeta del espectrofotómetro. Se lee la absor-
6.9.2 Instrumental bancia a 510 nm.

[Link] Ampollas de decantación de 250 ml, con Se realiza un ensayo en blanco, y se resta de la
robinete de teflón (IRAM-AQA AA 91023). absorbancia de los patrones la del blanco.

[Link] Espectrofotómetro, para trabajar en la Se grafica la absorbancia en función de la con-

región visible del espectro. centración de plomo en el extracto clorofórmico
(Pg Pb en 10 ml).
[Link] Cubetas de vidrio de 1 cm de camino óp-
tico. 6.9.5 Procedimiento

[Link] Equipo de digestión tipo Kjeldahl. Se pipetean 20 ml del extracto ácido obtenido en
la mineralización de la muestra (6.9.3) en una
[Link] Mufla. ampolla de decantación de 125 ml.

[Link] Plancha calefactora. Se agregan 50 ml de la solución de citrato-

cianuro amoniacal, se mezcla y se enfría a tem-
[Link] Crisoles de porcelana. peratura ambiente.

Se adicionan 10 ml de la solución de trabajo de

6.9.3 Mineralización de la muestra ditizona ([Link]), se agita vigorosamente duran-
te 30 s, y se deja que las fases se separen.
Se pipetean 20 ml (V1) del extracto y se colo-
can en un balón o tubo de digestión del tipo Se descarga la fase clorofórmica en un vaso de
empleado para la determinación de Kjeldahl. precipitación, se filtra recogiendo el filtrado en la
Se agregan 20 ml de ácido nítrico (1 + 4), y se cubeta del espectrofotómetro.

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Se lee la absorbancia a 510 nm. [Link] Solución de ácido nítrico (1 + 4). Se di-
luyen con agua para análisis 200 ml de ácido
NOTA. Como alternativa, partiendo de la muestra minera- nítrico concentrado en un matraz de 1 000 ml.
lizada se puede determinar el contenido de plomo minera-
lizado en 6.9.3 mediante espectrofotometría de absorción
atómica. [Link] Ácido clorhídrico concentrado
(IRAM 21302).
6.9.6 Cálculos
[Link] Solución de yoduro de potasio. Se di-
Se calcula el contenido de plomo, mediante la suelven 15 g de yoduro de potasio (IRAM 21303)
fórmula siguiente: en 100 ml de agua para análisis. Se conserva en
frasco oscuro.
Abs Vf 1
Pb ˜ ˜ (11) [Link] Solución de dietilditiocarbamato de
b Vt V1 plata (AgSCSCN (C2H5)2). Se disuelven 500 mg
de efedrina en 100 ml cloroformo, se agregan
siendo: 625 mg de dietilditiocarbamato de plata y se
ajusta el volumen a 250 ml con cloroformo adi-
Pb el contenido de plomo expresado en cional. Se filtra y se almacena en un frasco
miligramos por litro; oscuro.

Abs el valor de la absorbancia leído; [Link] Zinc, en granallas, 20 a 30 mesh, libre

de arsénico.
b la pendiente de la recta;
[Link] Solución de stock de arsénico. Se di-
Vf el volumen al que se enrasa el extrac- suelven 1,320 g de trióxido de arsénico en
to ácido obtenido en la mineralización 10 ml de agua para análisis que contenga 4 g
de la muestra, en mililitros (50,0 ml); de NaOH, y se diluye a 1 000 ml con agua para
análisis; 1 ml = 1 mg As.
Vt el volumen tomado y colocado en la
ampolla de decantación para agregar [Link] Cloruro estanoso.
los reactivos, en mililitros;
ADVERTENCIA. El arsénico es tóxico, por lo
V1 el volumen de extracto tomado para que se deben tomar precauciones para evitar
realizar el análisis, expresada en gra- la ingestión de soluciones de arsénico.
mos (20 ml).
[Link] Solución intermedia de arsénico. Se
6.10 Determinación de arsénico diluyen 5 ml de la solución de stock ([Link]) a
500 ml con agua para análisis (bidestilada);
6.10.1 Reactivos 1 ml = 10 g As.

ADVERTENCIA. Debido a la peligrosidad de [Link] Solución estándar de arsénico. Se di-

los reactivos utilizados en esta técnica se luyen 10 ml de la solución intermedia ([Link])
debe utilizar propipeta en todas las medi- a 100 ml con agua para análisis (bidestilada);
ciones de volumen. 1 ml = 1 Pg As.

[Link] Agua para análisis (IRAM 21322). [Link] Solución de cloruro de estaño II.

[Link] Yoduro de potasio (IRAM 21303). 6.10.2 Instrumental

[Link] Ácido nítrico concentrado [Link] Digestor tipo Kjeldahl.

(IRAM 21306).

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[Link] Generador de arsina (generador de [Link] Generación de la arsina y medición.

Gutzeit) y tubo absorbedor. Se adicionan 3 g de zinc al generador y se co-
necta inmediatamente el absorbedor. Se deja
[Link] Espectrofotómetro, que permita leer a 60 min para el desprendimiento completo de la
535 nm, con cubetas de 1 cm de camino óptico. arsina. Se calienta el generador suavemente pa-
ra asegurarse que toda la arsina fue liberada. Se
[Link] Papel de filtro, de velocidad de filtración trasvasa la solución del absorbedor directamente
rápida. en una cubeta de 1 cm de camino óptico, y se
mide la absorbancia a 535 nm, usando un blanco
[Link] Baño de agua, que permita operar a de reactivos como referencia.
90 ºC.
[Link] Preparación de la curva de calibra-
6.10.3 Procedimiento ción. Se tratan alícuotas de la solución
estándar, que contienen 0 g, 1 g, 2 g, 5 g y 10 g
[Link] Tratamiento de la muestra. Se pesan de As, de igual manera que a la muestra. Para
10 g de extracto de propóleos en un tubo de di- ello, se continúa con el procedimiento según lo
gestión tipo Kjeldahl, o bien, en un vaso de indicado en [Link] hasta [Link]). Se grafica
precipitación. Se agregan 10 de agua, 10 ml de la absorbancia en función de la masa de arsé-
ácido sulfúrico concentrado y 5 ml de ácido nítri- nico en el estándar.
co concentrado. Se calienta procurando evitar
que la solución se seque y se carbonice, puesto 6.10.4 Cálculos
que en este caso el arsénico se reduce y se
pierde. Si es necesario se agrega agua con cui- Se calcula el contenido de arsénico, mediante la
dado y habiendo enfriado previamente le tubo de fórmula siguiente:
digestión. Se calienta hasta eliminar completa-
mente el ácido nítrico (si quedan restos, Vf 1
impedirán la reducción del arsénico y la conse- As m. . (12)
V t M1
cuente formación de la arsina), lo cual se
observa al formarse humos blancos. Se enfría
previamente a temperatura ambiente y luego se siendo:
coloca en freezer el extracto ácido obtenido, para
separar posibles restos de cera, y se filtra con As el contenido de arsénico expresado en
papel. Se adicionan 25 ml de agua y se trasvasa miligramos por kilogramo;
a una botella generadora. Se adicionan sucesi-
vamente, 5 ml de ácido clorhídrico concentrado, m la masa de arsénico obtenida por extra-
2 ml de la solución de yoduro de potasio, y 8 go- polación de la curva de calibración, en
tas (0,40 ml aproximadamente) de la solución de microgramos;
cloruro de estaño II (SnCl2). Se calienta 15 min
Vf el volumen al que se enrasa el extracto
en baño de agua a 90 qC para reducir el arsénico
ácido obtenido en la digestión de la
pentavalente al estado trivalente.
muestra, en mililitros (100 ml);
NOTA. Como alternativa de la muestra digerida, se puede
determinar el contenido de arsénico digerido en [Link] Vt el volumen tomado y colocado en la bo-
mediante espectrofotometría de absorción atómica. tella del generador de Gutzeit;

[Link] Preparación del absorbedor. Se pipe- M1 la masa de extracto de propóleos toma-

tean 4 ml de la solución de dietilditiocarbamato do para realizar el análisis, en gramos.
de plata en el tubo absorbedor.

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Anexo A
(Informativo)

Bibliografía

La redacción de esta norma se basa en la presentación realizada por los integrantes del Subgrupo de
Trabajo Propóleos, del Grupo de Trabajo Miel Regional, del Subcomité Productos Agroalimentarios
del NOA.

– Maidana, José Francisco – Efecto de la cosecha y almacenaje sobre la calidad del propoleos.
Centro de Investigaciones Apícolas-CEDIA - Facultad de Agronomía y Agroindustrias -
Universidad Nacional de Santiago del Estero.

– Isla, María I.; Carrasco Juárez, Belén; Nieva Moreno, María I.; Zampini, Iris; Ordóñez, Roxana M.;
Bedascarrasbure, Enrique; Álvarez, Alejandro; Cioccini, Fabián; Maldonado, Luis M. 63 - Actividad
antiradicalaria de propóleos de Calingasta, San Juan, Argentina. I-Congreso Argentino de
Apicultura, Córdoba, Julio de 2006.

– Isla, María I.; Carrasco Juárez, Belén; Nieva Moreno, María I.; Zampini, Iris; Ordóñez, Roxana M.;
Bedascarrasbure, Enrique; Álvarez, Alejandro; Cioccini, Fabián; Maldonado, Luis M. 64 – Análisis
comparativo de la actividad inhibidora de la peroxidación de lípidos de extractos de propóleos de
Calingasta (San Juan, Argentina) recolectados en diferentes épocas del año. I-Congreso
Argentino de Apicultura, Córdoba, Julio de 2006.

– Propóleos de norma Rusa – Propóleos – Métodos analíticos para el control de calidad. Requisitos
técnicos, según norma RST-RSFSR-317-77.

– Técnicas para análisis de propóleos y productos derivados. Estación experimental agropecuaria

Famaillá – Laboratorio de Agroindustrias. Instituto Nacional de Tecnologías agropecuaria.

Otros trabajos que pueden ser de utilidad para ampliar el conocimiento sobre estos productos natura-
les son los siguientes.

– Tabera, A.; Bedascarrasbure, E.; Maldonado, L.; Alvarez, A.; van der Horst, A. Actividad
antibacteriana de propóleos argentinos enfrentados a Staphylococcus aureus. Anales del Congre-
so Internacional de Propóleos, Buenos Aires, 1 y 2 de septiembre de 2000, pág. 97.

– Bedascarrasbure, E.; Maldonado, L.; Gurini, L.; Alvarez, A.; van der Horst, A.; Tabera, A.
Caracterización de propóleos argentinos. I- Delta del Río Paraná. Anales del Congreso Internacio-
nal de Propóleos, Buenos Aires, 1 y 2 de septiembre de 2000, pág.102.

– Bedascarrasbure, E.; Maldonado, L.; Segura, C.; Pérez, O.; Alvarez, A.; van der Horst, A.; Tabera,
A. Caracterización de propóleos argentinos. II- Valle Calchaquí. Anales del Congreso Internacional
de Propóleos, Buenos Aires, 1 y 2 de septiembre de 2000, pág.103.

– Bedascarrasbure, E.; Maldonado, L.; Vicente, M.; Alvarez, A.; van der Horst, A.; Tabera, A.
Caracterización de propóleos argentinos. III- Mendoza. Anales del Congreso Internacional de
Propóleos, Buenos Aires, 1 y 2 de septiembre de 2000, pág.105.

– Bedascarrasbure, E.; Maldonado, L.; Álvarez, A. y Rodríguez, E. Contenido de Fenoles y Flavo-

noides del Propóleos Argentino. Acta Farm. Bonaerense 23(3): 369-72 (2004), pág. 369-372.

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– A. Sales; A. Alvarez, M. Rodriguez Areal, L. Maldonado, P. Marchisio, M. Rodríguez, E.

Bedascarrasbure. The effect of different propolis harvest methods on its lead contents determined
by ET AAS and UV-visS. Journal of Hazardous Materials A137 (2006) 1352-1356.

– Ministerio de Agricultura de Brasil – Legislação - Reglamento técnico para fixação de identidade e

qualidade de própolis.

– Woisky, Ricardo G.; Salatino, Antonio. (1998) Analysis of propolis: some parameters and
procedures for chemical quality control. Journal of Apicultural Research 37(2): 99-I 05.

– Tossi, E., Cazzoli, A.. Informes técnicos sobre los métodos de ensayos aplicables a Propóleos.
CIDTA – Centro de Investigación y Desarrollo de Tecnología de alimentos, UTN - Universidad
Tecnológica Nacional, Regional Rosario, Argentina, Años 2004-2006.

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Anexo B
(Informativo)

Integrantes de los organismos de estudio

El estudio de esta norma ha estado a cargo de los organismos respectivos, integrados en la forma
siguiente:

Subcomité de Productos Agroalimentarios del Noroeste Argentino (NOA)

Integrante Representa a:
Ing. Alejandro ÁLVAREZ INTA – FAMAILLÁ
Ing. Enrique BEDASCARRASBURE INTA – FAMAILLÁ
Ing. Luis MALDONADO INTA – FAMAILLÁ
Ing. Andrés VAN DER HORST INTA – FAMAILLÁ
Lic. Romina GARAY IRAM
Lic. Juan Carlos TROIANO IRAM

Subcomité de Miel y otros productos de la colmena

Integrante Representa a:
Dra. Bertha BALDI UNER – UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Ing. Ampelio CAZZOLI CIDTA – FACULTAD REGIONAL ROSARIO
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA NACIONAL
Lic. Susana FATTORI INAL – INSTITUTO NACIONAL DE ALIMENTOS
Lic. Alicia GUTIÉRREZ INTI – Cereales y Oleaginosas
Dra. Inés LEALI DE JUARISTI UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA CUENCA DEL PLATA
Lic. Evangelina MACIAS LABORATORIO RAPELA
Sr. Adrián MORO PARODI APICULTURA
Lic. Héctor MUGICA SENASA – SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CA-
LIDAD AGROALIMENTARIA
Ing. Mariana OLMEDO INTI – Cereales y Oleaginosas
Sra. Marta PALLNER SUNNEL
Bioq. Mirta Gabriela SILVA SENASA – SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA
Ing. Luis TAPIZ CIDTA – FACULTAD REGIONAL ROSARIO
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA NACIONAL
Ing. Agr. Javier VÁZQUEZ UNIVERSIDAD DE LOMAS DE ZAMORA
Lic. Mariana QUESADA IRAM-BID FOMIN
Lic. María del Carmen FERNANDEZ IRAM

Comité General de Normas (C.G.N.)

Integrante Integrante
Lic. Vicente BIANCHI Dr. Ricardo MACCHI
Dr. José M. CARACUEL Tco. Hugo D. MARCH
Lic. Alberto CERINI Tco. Ángel TESTORELLI
Dra. Irene DASSO Ing. Raúl DELLA PORTA
Dr. Federico GUITAR

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ICS 67.180.10
* CNA 8925

* Corresponde a la Clasificación Nacional de Abastecimiento asignada por el Servicio Nacional de Catalogación del Ministerio de Defensa.

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