4: MÉTODOS DE

SIEMBRA Y CULTIVO
DE
MICROORGANISMOS

María M. Reynoso, Carina E. Magnoli,

Germán G. Barros y Mirta S. Demo
Universidad Nacional de Río Cuarto
 CHAPTER OVERVIEW

4: Métodos de siembra y cultivo de microorganismos

4.1: Introducción
4.2: Cultivos en medios sólidos
4.3: Cultivos en medios líquidos
4.4: Influencia del medio ambiente físico
4.4.1: Introducción
4.4.2: Temperatura
4.4.3: Acidez y alcalinidad (pH)
4.4.4: Oxígeno
4.4.5: Disponibilidad de agua
4.4.6: Radiaciones no Ionizantes
4.5: Bibliografía
4.6: Teórico Práctico 4. Métodos de siembra y cultivo de microorganismos. Influencia del ambiente físico sobre el crecimiento
microbiano
4.7: Laboratorio 3. Métodos de siembra y cultivo de microorganismos. Influencia del ambiente físico sobre el crecimiento
microbiano

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1
4.1: Introducción
La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de microorganismos de un ambiente a
otro con el propósito de cultivarlos. Una vez que el medio de cultivo está debidamente preparado se procede a inocular la muestra
deseada.
Si se desea aislar o separar los diferentes tipos microbianos que se encuentran en una muestra (agua, materias primas, alimentos,
etc.) se pueden utilizar distintas técnicas de siembra. Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de la muestra
(inóculo) en un medio de cultivo adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano; y se realizan diferentes metodologías de
acuerdo al fin que se persiga. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
Dependiendo del estado físico del medio de cultivo (líquido, sólido o semisólido) la siembra se puede realizar con: ansa en anillo,
ansa en punta, varilla de vidrio (espátula de Drigalsky), hisopo o pipeta estéril.
El ansa de siembra consta de un filamento de platino, que puede ser recto o en anillo. Para facilitar el manejo, este filamento está
sujeto a un mango aislante.

Figura 4.1.1 : a) ansa en anillo b) ansa recta (CC-BY; Este libero)

Antes de poner en contacto el ansa de siembra con los microorganismos. Esta debe ser esterilizada para evitar contaminaciones;
para ello se la incinera a la llama del mechero Bunsen, hasta que todo el filamento esté incandescente. Se deja enfriar el ansa cerca
de la llama y luego, se la introduce en el recipiente (tubo, placa, frasco Erlenmeyer, etc.) que contenga el cultivo microbiano o la
muestra que se quiere trasladar.
Para ello, se sigue el siguiente esquema

4.1.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51424
 Figura 4.1.2 : Copy and Paste Caption here. (CC-BY; Fuente: Prácticas de Microbiología Industrial. Universidad de Barcelona.
Facultad de Farmacia)

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4.1.2 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51424
4.2: Cultivos en medios sólidos
Siembra en picadura o punción
Se introduce el ansa en punta con el inóculo en un tubo conteniendo agar en columna, sin tocar las paredes del tubo y en forma
paralela asegurándose que el inóculo quede distribuido a lo largo de toda la punción. Se retira el ansa y se quema.
Esta técnica permite conocer el comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno y su movilidad

Figura 4.2.1 : (CC-BY; Este libero)

Siembra en estrías
Se toma el material con ansa en anillo y se siembra en estrías en un tubo que contiene agar pico de flauta o agar inclinado,
respetando las indicaciones señaladas anteriormente.
Esta técnica constituye un medio adecuado para el cultivo de microorganismos aerobios y aerobios facultativos.

4.2.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51425
 Figura 4.2.2 : (CC-BY; Este libero)

Siembra por agotamiento en estrías

Con el ansa en anillo cargada de material se realiza una serie de estrías paralelas no superpuestas, sobre una tercera parte de la
superficie de la placa de Petri conteniendo el medio de cultivo. Se esteriliza el ansa y se efectúan una serie de estrías en dirección
perpendicular a la anterior, comenzando en la zona donde termina la última estría. Este procedimiento se repite varias veces.
El esterilizar el ansa de siembra disminuye la cantidad de microorganismos que se extiende en una superficie determinada. Una vez
inoculadas las placas se incuban en estufa durante 24 – 48 h, a la temperatura adecuada según el microorganismo a cultivar.
Utilizando esta metodología de siembra se obtienen colonias aisladas en las últimas estrías, separadas unas de otras, permitiendo a
partir de las mismas la obtención de cultivos puros mediante resiembra en otro medio de cultivo.

4.2.2 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51425
 Figura 4.2.3 : (CC-BY; Fuente: Ingraham J & Ingraham C. Introducción a la Microbiología. Ed Reverté SA, España, 1998)

Siembra con espátula de Drigalsky

Se pipetea un volumen de inóculo (generalmente 0,1 ml) y se deposita sobre la superficie de la placa de Petri que contiene el medio
de cultivo solidificado. Con una espátula de Drigalsky estéril (previamente embebida en alcohol, flameada y enfriada) se disemina
la muestra por toda la superficie, efectuando movimientos de rotación hasta su completa absorción.

4.2.3 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51425
 Figura 4.2.4 : (CC-BY; Este libero)
Esta técnica permite sembrar inóculos sobre superficies grandes, para obtener un crecimiento confluente que nos permite estudiar el
efecto de antimicrobianos (antibióticos, antisépticos, desinfectantes, etc.). También se utiliza para realizar recuento de colonias;
para cumplir con este último objetivo, previamente se deben realizar diluciones seriadas de la muestra.

Siembra con hisopo

Se embebe un hisopo de algodón estéril en un tubo que contiene un cultivo líquido previamente homogeneizado. Se elimina el
exceso de inóculo presionando el hisopo contra las paredes internas del tubo y se disemina el inóculo por toda la superficie de la
placa conteniendo el medio de cultivo sólido.
Esta técnica permite sembrar inóculos abundantes sobre superficies grandes (cajas de Petri, botellas de Roux, etc.) a los fines de
obtener un crecimiento confluente con los mismos fines que en el procedimiento anterior, excepto que no se pueden realizar
recuento de colonias debido a que no se conoce el volumen de inóculo que se siembra.

Siembra en placa vertida

Se lleva un volumen de inóculo (generalmente 1 ml) a un tubo que contiene agar fundido y se vierte el contenido en una placa de
Petri vacía y estéril. Se homogeneiza el contenido de la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones para
distribuir su contenido y se deja solidificar.
Una vez incubada a la temperatura adecuada, se observarán colonias en profundidad (inmersas en el medio) y en la superficie. Esta
técnica permite el desarrollo de microorganismos aerobios, aerobios facultativos y microaerófilos.

4.2.4 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51425
 Figura 4.2.5 : Copy and Paste Caption here. (CC-BY; Fuente: Ingraham J & Ingraham C. Introducción a la Microbiología. Ed
Reverté SA, España, 1998
)

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4.2.5 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51425
4.3: Cultivos en medios líquidos
Se lleva el material con ansa en anillo o pipeta a un recipiente (frasco Erlenmeyer o tubo) conteniendo el medio de cultivo líquido.
Generalmente este tipo de siembra se utiliza para aumentar el número de microorganismos.

Figura 4.3.1 : (CC-BY; Este libero)

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4.3.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51426
 SECTION OVERVIEW
4.4: Influencia del medio ambiente físico
4.4.1: Introducción

4.4.2: Temperatura

4.4.3: Acidez y alcalinidad (pH)

4.4.4: Oxígeno

4.4.5: Disponibilidad de agua

4.4.6: Radiaciones no Ionizantes

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4.4.1: Introducción
Las actividades microbianas se ven afectadas por las condiciones físico-químicas del ambiente. El entendimiento de la influencia
medioambiental sobre los microorganismos permite explicar su distribución ecológica y a diseñar métodos para su control y/o
destrucción. No todos los organismos responden igualmente a un factor ambiental determinado. De hecho, una condición ambiental
puede ser dañina para un organismo y beneficiosa para otro.
Los factores físicos que influyen sobre el crecimiento de los microorganismos son: temperatura, pH, oxígeno, disponibilidad
de agua, presión osmótica y radiaciones.

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4.4.1.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51428
4.4.2: Temperatura
La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que influyen en la proliferación y sobrevida de los organismos.
Los microorganismos son particularmente susceptibles debido a que son usualmente unicelulares y “poikilotérmicos”, es decir que
su temperatura varía de acuerdo a la del medioambiente externo. Ciertas bacterias pueden desarrollarse a temperaturas extremas
que impedirían la supervivencia de casi todos los organismos eucariotas.
El factor más importante que influencia la temperatura sobre el crecimiento microbiano es la sensibilidad de las reacciones
catalizadas por enzimas. Así, dentro de ciertos límites, las reacciones químicas y enzimáticas en la célula ocurren a velocidades
cada vez más rápidas conforme aumenta la temperatura.
La dependencia de la temperatura de un microorganismo se caracteriza por sus temperaturas cardinales (temperaturas de
crecimiento mínima, óptima y máxima). Al sobrepasar la temperatura máxima se produce la desnaturalización irreversible de las
proteínas estructurales y enzimáticas. Por debajo de la temperatura mínima los microorganismos detienen su crecimiento pero
mantienen su viabilidad. Estas características del crecimiento tienen importantes aplicaciones prácticas. Las temperaturas por
encima de la máxima son utilizadas para eliminar microorganismos mediante los procedimientos de esterilización por calor,
mientras que la congelación es usada para la conservación de cultivos, sangre, plasma, alimentos, cepas bacterianas. La temperatura
óptima permite, entre otros factores, la máxima velocidad de desarrollo microbiano.
De acuerdo a sus temperaturas cardinales, los microorganismos pueden ser clasificados en cinco categorías. Los límites y las
temperaturas máximas que definen a las bacterias en estos cinco grupos no están bien definidos, dado que existen variaciones para
cada especie en particular.

 Psicrófilos
Pueden crecer a 0º C, pero tienen una temperatura óptima de crecimiento de aproximadamente 15º C. Estos microorganismos
rara vez causan problemas en la conservación de los alimentos.

 Psicrótrofos (psicrófilos facultativos)

Pueden proliferar a 0º C, pero tienen temperaturas óptimas de crecimiento más elevadas (20 a 30º C). Son más comunes que
los psicrófilos y probablemente están implicados en el deterioro de los alimentos a bajas temperaturas.

 Mesófilos

Presentan una temperatura óptima de crecimiento de 25 a 40º C. Son el tipo más común de microorganismos y comprenden a
microorganismos que causan deterioro en los alimentos y enfermedades en el hombre y animales

 Termófilos
Muchos de ellos tienen una temperatura óptima de 50 a 60º C y varios de ellos no pueden desarrollar a temperaturas inferiores
a los 45º C. No constituyen un problema en salud pública y son importantes en los montículos de compost

 Hipertermófilos
En ocasiones son llamados termófilos extremos. Tienen una temperatura óptima de crecimiento de 80º C o más, viven en
fuentes termales asociadas a la actividad volcánica.

Figura 4.4.2.1: Clasificación de los microorganismos según sus temperaturas cardinales. (CC-BY; Este libero)

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4.4.2.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51429
4.4.3: Acidez y alcalinidad (pH)
La concentración de iones positivos juega un rol decisivo en la colonización de sustratos de diferentes ambientes. La mayoría de
los entornos naturales poseen valores de pH entre 5 y 9, evidentemente el mayor número de poblaciones microbianas desarrollarán
dentro de estos límites. En general, las bacterias desarrollan a pH neutro (7,2 - 7,6), cuando el pH disminuye por debajo de 5, el
crecimiento bacteriano es progresivamente menor.
Respecto del margen normal de pH a los que crecen los microorganismos, se clasifican en:

 Acidófilos
• Crecen entre pH 0 y pH 5
•Acidófilos extremos u obligados) Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las arqueas
del género Sulfolobus tienen su pH óptimo cercano a 2. De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+
para mantener la integridad de sus membranas y envolturas.

 Neutrófilos

• Crecen entre pH 5 y pH 9
•Ejemplos: la mayoría de las bacterias (E. coli, Staphylococcus spp., Pseudomonas spp. etc.)

 Basófilos

• Crecen entre pH 8,5 y pH 11,5

•Basófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Ejemplo, Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus
hábitats típicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterim gregoryi

Muchas bacterias neutrófilas modifican el pH del medio y resisten entornos relativamente ácidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas
bacterias fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan el medio, produciendo amonio a partir de desaminación de
aminoácidos.
Para evitar cambios en el pH del medio de cultivo que puedan afectar el desarrollo de un microorganismo, con frecuencia se añade
un amortiguador (buffers) o bien, carbonatos insolubles. Los amortiguadores a base de fosfatos, son mezclas de fosfatos
monobásicos (PO4H2K) y dibásicos (PO4HK2) que en distintas proporciones pueden controlar y mantener el pH entre valores de
6,0 y 7,6 aproximadamente. Los carbonatos insolubles como carbonato de calcio (CO3Ca), a pH por debajo de 7,0 se descomponen
con liberación de CO2 actuando como agentes neutralizantes. Se encuentran mayores dificultades cuando se trata de controlar el
pH alcalino, debido a que los amortiguadores de fosfato no son efectivos en la escala de pH entre 7,2 y 8,5. Por tanto, en ciertos
casos es necesario ajustar el pH, en forma periódica mediante la adición aséptica de ácidos o bases fuertes.
El desarrollo de una población microbiana puede ser inhibido por:
el descenso de pH debido a la producción de ácidos orgánicos a partir de la fermentación de los azúcares.
el ascenso de pH resultante de la utilización de componentes aniónicos o la descomposición de proteínas y aminoácidos.

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4.4.4: Oxígeno
El comportamiento de cada microorganismo frente al oxígeno está dado por la presencia o no de una o más enzimas, tales como:
catalasa, peroxidasa, superóxido dismutasa (SOD), encargadas de destruir los derivados tóxicos del oxígeno: peróxido (H2O2),
anión peróxido (O2-2), oxígeno singlete (1O-2), radicales libres superóxido (O-2) y radical hidroxilo (OH-). Esto determina la
concentración gaseosa que debe suministrarse durante el crecimiento microbiano.
Los microorganismos pueden clasificar en:

Microorganismos aerobios:

 Aerobios estrictos u obligados

• Dependen de la respiración aeróbica para cubrir sus necesidades energéticas.

• Crecen fácilmente sobre la superficie de placas de agar y en la superficie de los cultivos líquidos en reposo (estáticos).
• En cultivos líquidos, es necesario airear el cultivo para suministrar la misma concentración de O2 en todo el cultivo.
• Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y superoxidismutasa (SOD) para neutralizar las formas tóxicas del O2.
• Ejemplos: Micrococcus luteus, Pseudomonas spp.

 Microaerófilos
• Son microorganismos aerobios que crecen mejor a presiones parciales de O2 considerablemente más bajas (0,2 atm) que las
presentes en el aire
• En medios de cultivo no crecen en la superficie, sino por debajo donde la concentración de O2 es menor.
• Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y SOD para neutralizar las formas tóxicas del O2.
• Ejemplos: Campilobacter spp., Spirillum volutans.

 Aerobios facultativos
• Pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de O2, pero lo hacen mejor en presencia, en cuyo caso realizan
respiración aeróbica.
• En medios sin O2 desarrollan mediante respiración anaeróbica o fermentación.
• En los medios de cultivo pueden desarrollar en todo el tubo, tanto en superficie como en profundidad.
• Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y SOD para neutralizar las formas tóxicas del O2.
• Ejemplo: Escherichia coli

Microorganismos anaerobios:

 Aerotolerantes
• No requieren ni crecen en presencia de oxígeno y toleran su presencia.
• Poseen SOD o un sistema equivalente que les permite neutralizar las formas tóxicas del O2.
• Ejemplo: Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes

 Anaerobios estrictos

• Se desarrollan en ausencia de O2.

• Realizan respiración anaeróbica o fermentación.

4.4.4.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51431
 • Los cultivos líquidos se preparan en tubos o matraces con gran volumen de medio con el agregado de sustancias reductoras,
cerrados con tapones de goma o rosca, eliminando el O2 por ebullición del medio de cultivo, previo a la siembra.
• El aislamiento en medios sólidos se realiza mediante la incubación de las cajas de Petri en jarras anaeróbicas de cierre
hermético.
• Carecen de enzimas para neutralizar las formas tóxicas del O2.
• Ejemplo: Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium.

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4.4.4.2 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51431
4.4.5: Disponibilidad de agua
La disponibilidad de agua depende no sólo del contenido de agua del ambiente, es decir cuán húmedo o seco sea un hábitat
determinado, sino también de la concentración de solutos en ella. Esto es porque las sustancias disueltas tienen gran afinidad por el
agua, lo que hace que el agua asociada con los solutos sea inutilizable por los organismos.
Los efectos de altas concentraciones de solutos sobre los microorganismos se deben al soluto en sí mismo o a los efectos del soluto
sobre la actividad acuosa (aW). Los solutos disueltos en agua disminuyen la cantidad de agua libre. La actividad acuosa provee una
medida del agua disponible para el microorganismo
La disponibilidad del agua se expresa en términos físicos como la actividad de agua (a ). Esta es el cociente entre la presión de
W

vapor del aire en equilibrio con una sustancia o solución y la presión de vapor del agua pura a la misma temperatura y se define por
la siguiente ecuación:
P n2
aW = = (4.4.5.1)
P0 n1 + n2

donde:
P = presión de vapor a saturación en la solución.
P0 = presión de vapor a saturación del agua pura bajo las mismas condiciones.
n1 = número de moles del soluto.
n2 = número de moles del solvente.
A medida que se incrementa la concentración de soluto decrece la actividad acuosa. Los valores de a W varían entre 0 y 1. La aW
del agua pura es 1.
En muchas situaciones prácticas la a W es el factor ambiental dominante que gobierna la estabilidad o el deterioro de un alimento.
En la escala de la a la vida existe en el rango de 0,999 a 0,60. La mayoría de los microorganismos toleran pequeños
W

decrecimientos de a ; no crecen por debajo de 0,95. Sin embargo, hay notables excepciones, estas incluyen a bacterias halófilas,
W

levaduras osmófilas y hongos xerófilicos. Dichos microorganismos son agentes de deterioro en productos alimenticios.
Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias pueden vivir en medios hipotónicos, debido a la
protección que les brinda la pared celular rígida
Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente superior a la del entorno, lo que garantiza el paso
de agua al interior. La presión de turgencia es relativamente constante porque la membrana citoplásmica se topa con la rigidez de la
pared celular.
a) En medios hipotónicos (cuando la a en el exterior > a que la del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el papel:
W W

su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgencia
excesiva.
b) En medios hipertónicos (cuando la a del exterior < que la del citoplasma). Algunas bacterias poseen mecanismos
W

compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de
agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentración de un soluto muy soluble
en agua en el interior celular (denominado soluto compatible), lo cual se puede lograr por varios mecanismos posibles:
bombeando iones al interior;
sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa;
bombeando sustancias osmoprotectoras.
Ahora bien, si el medio es muy hipertónico, estos mecanismos son incapaces de evitar la salida de agua desde el citoplasma, lo cual
conlleva a una retracción de la membrana citoplasmática. La pérdida de agua puede suponer la deshidratación del citoplasma, lo
que conlleva a la detención del crecimiento.
Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y en general se llaman osmófilos. Entre los
osmófilos podemos distinguir los sacarófilos y los halófilos.

4.4.5.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51432
Uno de los ejemplos de microorganismos sacarófilos son las levaduras, que viven en jugos de vegetales, néctares, zumos etc., con
contenido alto de glucosa y/o sacarosa. Las levaduras utilizan como solutos compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc.
Entre los organismos halófilos, podemos distinguir los halófilos moderados y los halófilos extremos o hiperhalófilos:
Halófilos moderados (facultativos): suelen ser bacterias marinas que viven en 3,5% de NaCl, y que generalmente ven inhibido su
crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halófilos moderados tienen requerimientos concretos de una aw
equivalente a la de agua de mar, así como concentraciones determinadas de iones Na+.
Halófilos extremos (hiperhalófilos o estrictos), representados paradigmáticamente por las arqueas de la familia Halobacteriaceae
(halobacterias), que viven en (y de hecho requieren) concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Estos
microorganismos requieren cerca de 30% de sales para su desarrollo en el laboratorio.
Además de las bacterias halófilas, que requieren altas concentraciones de sales para su desarrollo, hay algunas bacterias que pueden
tolerar cierta concentración de sales, y se denominan halotolerantes (como por ejemplo, S. aureus).
La inmensa mayoría de los procariotas viven a valores de actividad de agua de 0,98. Por ello, un método que ya se conocía
empíricamente en la antigüedad para conservar ciertos alimentos era desecarlos o salarlos, o añadirles grandes cantidades de azúcar
(como en las mermeladas). Estas estrategias para conservar los alimentos tienen como base los principios antes expuestos.

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4.4.5.2 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51432
4.4.6: Radiaciones no Ionizantes
Luz Ultravioleta (UV)
La luz ultravioleta es de considerable interés microbiológico por su efecto sobre las macromoléculas celulares. Las bases púricas y
pirimidínicas de los ácidos nucleicos absorben a una longitud de onda de 260 nm, mientras los aminoácidos (triptofanos,
fenilalanina, tirosina) lo hacen a 280 nm.
El principal efecto de la radiación ultravioleta es la formación de enlaces covalentes entre restos de pirimidinas adyacentes en
una misma cadena, formando dímeros de pirimidina (generalmente dímeros de timina). Estos dímeros distorsionan la forma de la
molécula de DNA e interfieren con el apareamiento normal de las bases, aumentando la probabilidad de error en la replicación.
Además, en presencia de aire, se forma ozono. Este actúa sobre las bacterias y produce peróxidos, que intensifican la actividad
antimicrobiana de la radiación como agente oxidante.
La radiación UV se usa en la preparación de vacunas víricas inactivadas y bacterianas, cuartos de cultivo en laboratorios,
envasado de antibióticos, ambientes de salas de prematuros y quirófanos, superficies, potabilización de aguas de mesa, etc.
Dada la escasa capacidad de penetración de los rayos UV se utilizan sobre las superficies o líquidos de poca opacidad. Los factores
más destacados para alcanzar un tratamiento adecuado son:
Longitud de onda de la radiación de la lámpara germicida.
Dosis.
Tiempo de exposición.
Distancia entre el material y la lámpara.
Susceptibilidad de los microorganismos frente a la radiación.
Para que se establezca el efecto de la luz UV sobre los microorganismos estos deben estar expuestos en forma directa. Cuando el
procedimiento no es correcto, desciende la tasa de muerte y aumenta el número de alteraciones (mutaciones) en el genoma
bacteriano. Muchos microorganismos tienen enzimas reparadoras que reparan el daño inducido en el DNA por la radiación
ultravioleta.

Radiación Infrarroja
Las longitudes de ondas infrarrojas poseen poco poder de penetración y al parecer no matan a los microorganismos directamente.
Sin embargo, la absorción de tales radiaciones da como resultado un incremento en la temperatura, exponiendo los
microorganismos a temperaturas más elevadas que sus temperaturas óptimas de crecimiento. Lo mismo sucede con las microondas,
es por eso que en la industria de los alimentos la utilización de hornos microondas no alcanza una temperatura adecuada para matar
a los microorganismos que contaminan los alimentos.

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4.4.6.1 https://espanol.libretexts.org/@go/page/51433
4.5: Bibliografía
Ingraham J, Ingraham C. (1998). Introducción a la Microbiología. Ed. Reverté S.A., Barcelona, España.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP (2014). Crecimiento microbiano. En: Brock Biología de los microorganismos.
12º Edición. Editorial Pearson Educación, S.A., pág. 172–190.
Prescott LM, Harley JP, Klein DA (2002). Microbial Nutrition. In: Microbiology. Editorial McGraw Hill, United States.
Stanier R, Doudoroff M., Adelberg E. (1977). Microbiología. 2° Edición y posteriores. Ed.
Reverté SA, Barcelona, España.

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4.6: Teórico Práctico 4. Métodos de siembra y cultivo de microorganismos.
Influencia del ambiente físico sobre el crecimiento microbiano
A partir de una muestra de agua de un lago se preparó una dilución 10-2 y se sembró con espátula de Drigaslky 0,1 ml de dicha
dilución en 5 placas con los siguientes medios: Agar nutritivo, Agar Mac Conkey, Agar EMB, Agar Cetrimide y Agar Manitol
Salado. Todos los medios de cultivos fueron incubados a 37° C durante 48 h. Los resultados obtenidos son los siguientes:
Agar nutritivo: 62 colonias;
Agar Mac Conkey: 18 colonias;
Agar EMB: 12 colonias;
Agar Cetrimide: 5 colonias; A
gar Manitol Salado: sin crecimiento
1) Indique cómo esterilizaría dichos medios (Ayuda: debería conocer la composición química de cada uno de ellos). Fundamente su
respuesta.
2) Identifique en los diferentes medios de cultivo los macro y micronutrientes. Fundamente su respuesta. Teniendo en cuenta la
estructura de una célula bacteriana, indique los posibles sitios donde son necesarios los distintos componentes que se aportan en el
medio de cultivo.
3) ¿Cómo clasifica dichos medios de cultivo?
4) Indique cómo se clasifican nutricionalmente los microorganismos que podrían desarrollar en los diferentes medios de cultivos
utilizados. Tenga en cuenta la fuente de carbono, fuente de poder reductor y fuente de energía.
5) Explicar a qué se deben las diferencias observadas en el número de colonias que aparecen en cada medio considerando que se
inoculó la misma cantidad de muestra en cada uno.
6) ¿Cómo diseñaría un medio de cultivo para aumentar el número de bacterias quimiolitótrofas a partir de la muestra de agua del
lago? Identifique la fuente de carbono, fuente de poder reductor y fuente de energía. ¿Qué condiciones de incubación debería
utilizar?
¿Qué técnica de siembra utilizaría para tal fin?
7) ¿Sería posible aislar de esta muestra microorganismos psicrótrofos, psicrófilos, mesófilos, termófilos, hipertermófilos? ¿Por
qué? ¿Qué características estructurales presentan dichos microorganismos?
8) ¿Sería posible aislar de esta muestra microorganismos acidófilos, neutrófilos y basófilos?
¿Por qué? ¿Qué características estructurales presentan dichos microorganismos? ¿Cómo controlaría el pH del medio de cultivo,
considerando los rangos ácidos, neutros y alcalinos?
9) ¿Cómo prepararía el medio de cultivo si necesita aislar a partir de la muestra de lago un microorganismo quimioheterótrofo,
auxótrofo para lisina? ¿Qué condiciones de incubación adoptaría si el mismo es mesófilo y aerobio?
10) ¿Qué condiciones necesitaría controlar para aislar los siguientes microorganismos: a) quimioheterótrofo y microaerófilo, b)
quimioheterótrofo y anerobio estricto? ¿Qué técnica de siembra utilizaría para tal fin? ¿Cómo diseñaría los medios de cultivo para
ambos microorganismos?
11) Esquematice como espera observar en un tubo con agar nutritivo semisólido el desarrollo de los siguientes microorganismos:
aerobio estricto, microaerófilo, aerobio-anaerobio facultativo, aerotolerante, anaerobio estricto. Relacione el metabolismo
productor de energía y las enzimas que neutralizan las formas tóxicas del oxígeno en cada microorganismo anterior.
¿Cómo controlaría la provisión de oxígeno en cada caso?
12) ¿Qué métodos usaría para conservar cada una de las cepas puras aisladas? Fundamente su respuesta.

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G. Barros y Mirta S. Demo.

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4.7: Laboratorio 3. Métodos de siembra y cultivo de microorganismos. Influencia del
ambiente físico sobre el crecimiento microbiano
Objetivos
Adquirir conocimientos sobre los distintos métodos de siembra.
Adquirir criterio en la elección de los distintos medios de cultivo.
Utilizar factores físicos y químicos como herramienta microbiológica para estimular o inhibir el desarrollo microbiano.

Desarrollo práctico
Primer día:
Cada subgrupo contará con un cultivo líquido de uno de los siguientes microorganismos: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aureoginosa
Siembra en placas de Petri en estrías por agotamiento
Cada subgrupo sembrará por diseminación en estrías por agotamiento una placa de cada uno de los siguientes medios de cultivos:
agar nutritivo, agar Cetrimide, agar manitol salado, Agar EMB a fin de evaluar las características culturales de los diferentes
microorganismos. Una vez sembradas las placas se incubarán a 37ºC durante 24 – 48 h.
Siembra en cajas de Petri con espátula de Drigalsky
Con pipeta estéril colocar 0,1 ml del inóculo sobre las placas de agar nutritivo (hacerlo por triplicado), diseminar inmediatamente
con espátula de vidrio o metálica esterilizada a la llama del mechero. Incubar las placas a tres temperaturas diferentes: 4ºC, 37ºC
y 56ºC durante 24 – 48º C a fin de evaluar el efecto de la temperatura en las diferentes especies bacterianas sembradas.
Siembra en placas de Petri con hisopo estéril
Embeber el hisopo estéril sumergiéndolo en el inóculo, presionar sobre las paredes del tubo a fin de sacar el excedente de inóculo.
Diseminar en estrías paralelas en diferentes direcciones sobre las placas de agar nutritivo (hacerlo por triplicado).
Estas placas de agar nutritivo sembradas serán sometidas a la acción de la luz UV, durante diferentes intervalos de tiempo (30 s, 5
min, 30 min.), cubriendo previamente la mitad de cada placa con papel (control). Al cabo del período de exposición a la luz UV,
retirar e incubar a 37ºC durante 24 – 48 h. Se evaluará el efecto del tiempo de exposición a la luz UV en las diferentes especies
bacterianas sembradas.
Siembra en placa por el método de placa vertida
Tomar 1 ml del inóculo y colocarlo en el tubo que contiene el agar nutritivo fundido y enfriado a aproximadamente 45ºC, agitar a
fin de homogeneizar. Verter el contenido del tubo en una placa de Petri vacía y estéril. Rotar la placa en varias direcciones para
permitir su homogeneización. Incubar a 37ºC durante 24 – 48 h. Se observará crecimiento en la superficie y en el agar. Si el
volumen de inóculo es adecuado se observarán colonias aisladas.
Siembra en tubos
agar semisólido en columna, con ansa recta y se siembra por punción. Se evaluará el comportamiento de los microorganismos
frente al oxígeno y la movilidad.
agar sólido en pico de flauta, con ansa recta o en anillo y se siembra en estrías.
agar sólido inclinado, con ansa recta o en anillo y se siembra en estrías.
medio líquido, con ansa recta o en anillo y se inocula en el caldo de cultivo por homogeneización.
Incubar todos los tubos a 37ºC durante 24 – 48 h.
Acción de distintos factores ambientales en el control del desarrollo microbiano: exponer los medios sembrados a distintas
condiciones ambientales (según se mencionan anteriormente).

Segundo día:
a) Observar las características de desarrollo de los diferentes microorganismos en cada uno de los medios de cultivo.
b) Analizar los resultados y formular conclusiones.
c) Comparar los resultados obtenidos con cada una de las cepas y los informados en la bibliografía.

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Tratamiento de los materiales usados:
Una vez finalizado el trabajo de laboratorio, limpie adecuadamente las mesadas de trabajo con alcohol al 70% o hipoclorito de
sodio al 1%.
Descarte todo material contaminado en las bolsas para residuos patógenos.
Lávese las manos con jabón.

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