UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y
BIOTECNOLOGÍA
INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
DATOS INFORMATIVOS:
Carrera: Biotecnología Asignatura: Biotecnología Animal
Estudiantes: Guevara Jennifer Nivel: Sexto
Moreno Claudio Paralelo: “B”
Rivera Alejandra Docente: PhD. Lorena Núñez
Vásconez Juan Auxiliar de Laboratorio: Ing. Patricia Dávalos
Práctica N° 1, Actividad 2
I. TEMA:
“Aislamiento de células madre embrionarias”
II. INTRODUCCIÓN
Las células madre son células capaces de replicarse y diferenciarse para dar lugar a todo
tipo de células especializadas, y pueden obtenerse a partir de células somáticas por
técnicas de transfección o son obtenidas directamente de cultivos celulares, y estas poseen
la capacidad de autorrenovarse y dar origen a cualquier tipo de tejido del organismo
(Mata, Vásquez y Sánchez, 2013). Las células madre se clasifican según su potencialidad
en células madre totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes; mientras que
conforme a su lugar de origen se clasifican en células madre embrionarias, adultas y
pluripotentes inducidas (Pimentel y Murcia, 2017).
Las células madre embrionarias (CME) son aquellas que se encuentran en la primera fase
del desarrollo embrionario y son consideradas células pluripotentes por su capacidad de
convertirse en cualquiera tipo funcional de: endodermo, mesodermo y ectodermo
(Pimental y Murcia, 2017, p. 3).
El enfoque de la presente práctica se centra en las células madre embrionarias (CME),
mismas que se obtendrán a partir de células blastodérmicas de un embrión de pollo, y una
vez aisladas, se visualizará el número de CME viables a través de un hemocitómetro con
ayuda de un microscopio
III. OBJETIVOS
Objetivo General:
• Aislar células madre embrionarias de pollo para el desarrollo de un cultivo celular
primario y posterior obtención de un tejido aviar específico.
Objetivos Específicos:
• Aislar células blastodérmicas tempranas obtenidas a partir de pollo para su
posterior estudio como células madre embrionarias.
• Determinar la viabilidad celular según el número de células madre embrionarias
de pollo vistas a través de un hemocitómetro.
IV. METODOLOGÍA
• Se llevó 2 huevos fértiles recién puestos por la gallina de los cuales se realizaron
las siguientes actividades:
Método de recolección de blastodermos
• Se desinfectó 2 huevos con una solución de Hipoclorito de sodio al 0.5% (tal
concentración fue estimada debido a que el hipoclorito de sodio tenía una
concentración del 3.5%) y se limpió con etanol al 70%.
• Se rompió la cascara, separando la clara y la yema con cuidado y se dejó al
embrión en la superficie de la yema.
Figura 1. Separación de yema de huevo
• Se distribuyó las 2 yemas en dos platos Petri de vidrio de 25 ml con el embrión
hacia arriba.
Figura 2. Yema de huevo
• Se agregó un pequeño anillo perforado de papel filtro estéril en cada yema para
eliminar el exceso de clara encontrado en la superficie del embrión.
• Se colocó un nuevo anillo de papel filtro en la superficie de la yema, en el orificio
que rodea el embrión con ayuda de unas pinzas de disección.
Figura 3. Embriones de los huevos rodeados de papel filtro
• Transcurrido 4 minutos se realizó 4 pequeñas incisiones alrededor del anillo.
• Se retiró de manera inmediata el anillo de papel con las pinzas de disección curvas.
• Se sumergió en agua estéril el anillo de papel que llevaba el embrión de manera
vertical evitando que el embrión se desprenda.
Figura 4. Limpieza de los restos de la yema de huevo en agua estéril.
• Se colocaron los anillos con el lado de la yema hacia arriba en el agua estéril.
Método de preparación de células blastodérmicas
• Se transfirió los anillos con los embriones a un plato Petri con agua estéril fresca.
Figura 5. Limpieza de los restos de la yema de huevo en agua estéril.
• Se retiró suavemente el exceso de yema con palillos y se colocó en otro plato Petri
nuevo que contenía agua estéril.
Figura 6. Embrión del pollo.
• Se separó el embrión con la punta de pipeta de 1 ml del anillo de papel y se agregó
0.25 ml de agua estéril en un tubo Eppendorf.
• Se disoció las células mecánicamente con varios pipeteos suaves hacia arriba y
hacia abajo.
• Se mantuvo los tubos Eppendorf a 4°C.
Análisis de las características de las células.
• Se tomó dos gotas del tubo que contenía el agua estéril y células.
• Se observó bajo el microscopio las células viables y no viables.
• Se realizó una dilución 1:10 de agua estéril para contar las células ya que estas se
encontraban muy agrupadas.
V. RESULTADOS
• Células madre embrionarias
Figura 7. Células embrionarias muestra de yema de huevo 1.
Células viables (verde): 55
Células no viables (rojo): 6
o Número de células
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 20 𝜇𝐿
𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = = =2
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 10µ𝐿
𝑛° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 ∗ 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 ∗ 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 =
𝑛° 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜
55 ∗ 2 ∗ 10µ𝐿
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 =
16
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 = 69
o Porcentaje de células viables
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠
∗ 100
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
55
∗ 100 = 90.16% 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠
61
Figura 8. Células embrionarias muestra de yema de huevo 2.
Células viables (verde): 13
Células no viables (rojo): 3
o Número de células
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 20 𝜇𝐿
𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = = =2
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 10µ𝐿
𝑛° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 ∗ 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 ∗ 10.000 ∗ 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 =
𝑛° 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜
13 ∗ 2 ∗ 10µ𝐿
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 =
9
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 = 29
o Porcentaje de células viables
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠
∗ 100
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
13
∗ 100 = 81.25% 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠
16
• Células de pato
Figura 9. Células embrionarias muestra de yema de pato, lente 4X.
Figura 10. Células embrionarias totipotentes muestra de pato, lente 40X.
ACTIVIDAD TEÓRICA
1. ¿Cuáles son los componentes del medio completo ESA PM para el cultivo de
células madre embrionarias de pollo?
Para el cultivo de células madre embrionarias de pollo comúnmente se utiliza el
medio completo ESA PM, puesto que dicho medio contiene distintos factores de
crecimiento y citosinas que permiten la formación de biomasa (Intarapat & Stern,
2013). Para la realización de este medio, se lo debe realizar en dos procesos, ya
que se requiere del medio completo ESA CM para poder producir el medio
completo ESA PM (proliferativo).
• Medio completo ESA CM
o 50 ml de suero bovino fetal no inactivado por calor.
o 6 ml de solución madre NEAA (Aminoácido no esencial).
o 6 ml de solución madre de piruvato de sodio (100 mM).
o 6 ml de solución madre de penicilina/estreptomicina (10000 U/1000 U).
o 6 ml de solución madre de glutamina (20 mM).
o 7 µl de solución madre de mercaptoetanol (14 M).
Una vez preparado el medio completo ESA CM, se agregan los siguientes
componentes para la formación del medio completo ESA PM:
• Medio completo ESA PM
o 5 ng/ml de IGF-1.
o 1 ng/ml de SCF.
o 1 ng/ml de IL-6.
o 1 ng/ml de sIL-6 Rα.
o 1000 U/ml de LIF.
(Aubel & Pain, 2013)
2. ¿Por qué razón es importante la capa alimentadora (alimentador STO
inactivado/inactivated STO feeder) para el cultivo de células madre
embrionarias y de que están constituidas?
La importancia de la capa alimentadora (alimentador STO inactivado) en el
cultivo de células madre embrionarias de pollo se debe a que gracias a esta capa
las células podrán ser almacenadas durante más tiempo. Además, de que esta capa
permite que las células blastodérmicas se desarrollen de mejor manera ya que esta
contiene factores de crecimiento (Han, et al., 2018). Para que este alimentador
STO inactivado funcione correctamente es necesario que contenga 0,75 ml de
medio completo ESA PM, lo que permitirá que las células se desarrollen
correctamente (Aubel & Pain, 2013).
3. ¿Cuál es la temperatura y porcentaje de CO2 que se requieren para el cultivo
de células madre embrionarias de pollo? Justificar las razones.
• Temperatura: La temperatura óptima para que se realice un cultivo de
células madre embrionarias de pollo es de 37 a 38 °C. Esto se debe a que
estas temperaturas simulan las condiciones óptimas de desarrollo del
embrión dentro del huevo.
• CO2: Por otro lado, el porcentaje de CO2 necesario para el cultivo de células
madre embrionarias de pollo debe ser menor a 10%, puesto que a mayores
niveles se podría alterar el pH del medio, lo que podría afectar el desarrollo
de las células.
(Lavoir & Mather, 2006)
4. Busque una imagen de cómo se observarían las células madre embrionarias
de pollo una vez que estas hayan sido cultivadas adecuadamente y que se
hayan adherido al medio.
Figura 10. Células madre adheridas al medio.
En esta imagen se puede observar como las células ya se encuentran adheridas al
medio, que en este caso es el medio completo de diferenciación ESA DM. Esta
masa celular se la pudo obtener después de 3 días de incubación a 39 °C y 10%
de CO2. Además, para que el proceso pueda continuar dando buenos resultados el
medio debe ser cambiado cada 2 días (Aubel & Pain, 2013).
5. Decida a que tejido quisiera diferenciar las células madre embrionarias de
pollo aisladas en esta práctica. Investigue el medio de cultivo, factores y
condiciones necesarias para su obtención.
Dado que las células madre embrionarias tienen la capacidad de diferenciarse a
varios de los tejidos presentes en el organismo, la diferenciación se realiza para
músculo liso. Para la diferenciación de estas células es necesario un medio de
cultivo de diferenciación ESA DM, el cual tiene la misma composición del medio
completo ESA CM, con la diferencia de qué se adicionan 25 ml de suero bovino
fetal y que este medio no cuenta con factores de crecimiento. Así mismo, para la
incubación del medio es necesario que se mantenga una temperatura de 39 °C y
un porcentaje de CO2 del 10%. Para el análisis de las muestras se realiza una
inmunofluorescencia de desmina y DAPI lo cual permite comprobar la
diferenciación direccional a células del músculo liso (Han, et al., 2018).
6. Finalmente, realice un esquema gráfico de todo el proceso: desde el
aislamiento de células hasta la obtención del tejido diferenciado (combine la
práctica con lo teórico).
Figura 11. Protocolo para aislamiento de células madre embrionarias.
Figura 12. Protocolo para preparación de células blastodérmicas.
Figura 14. Protocolo para diferenciación celular.
(Aubel & Pain, 2013); (Han, et al., 2018)
VI. DISCUSIÓN
En el pollo y el pato, el período de desarrollo embrionario hasta llegar al individuo
completo tarda alrededor de 28 días y 32 días respectivamente y empieza con la
diferenciación embrionaria que dura aproximadamente 6 días, durante este período, en
específico, tres horas después de la ovulación se produce la fecundación del huevo, el
desarrollo se detiene ya que no está expuesto a una temperatura que lo fomente (Zeman
et al., 2016), sin embargo, se evidencia que existe un área translúcida rodeada de una
opaca, esto se denomina estado temprano de la blástula y cuya última etapa integra
alrededor de cincuenta mil células lo que permite diferenciar dos cavidades superpuestas
(Figura 3), este estado se mantiene mientras el huevo esté sometido a temperatura
ambiente (Enrique & Henao, 2013).
El número de células que se integra a la blástula en su periodo temprano explica el número
de células viables una vez estas han sido recontadas, por lo que es necesario realizar una
dilución 1:10 para su mejor visualización (Figura 7 y 8), sin embargo, hay que diferir
considerablemente entre una célula viable de una que no, esta última es observada si
existe daño irreparable de la pared celular, esto atribuido al proceso de homogeneización
del embrión mecánicamente mediante el pipeteo (Cisneros, 2002), la primera muestra
(Figura 7) posee un porcentaje de 90,16% de viabilidad mientras que la segunda (Figura
8) posee un porcentaje de 81,25%.
Por otra parte, la observación de células de pato indica que se trató de un embrión de
aproximadamente cinco días, poseía vascularización y membrana vitelina en su superficie
además poca diferenciación entre cabeza y tronco (Ricaurte, 2005), sin embargo este
criterio puede ser cuestionable debido a los factores de incubación a los que el huevo
estuvo sometido, en la observación celular (Figuras 9 y 10) se evidencia que existe una
proliferación abundante a comparación de las células de pollo, esto se debe a que no están
diluidas por lo que la concentración será mayor.
VII. CONCLUSIONES
• Las células madre embrionarias de pollo se aislaron a partir de un huevo de gallina
una vez recuperado el embrión a través de los procesos mencionados en el
protocolo.
• Una célula blastodérmica es aquella que se encuentra presente durante la
embriogénesis animal; en el caso de las aves como el pollo, el blastodermo se
forma en un polo de la yema y es a partir de éste que se aíslan las células madre
embrionarias.
• El hemocitómetro es un dispositivo de cámara para el recuento originalmente de
células sanguíneas y funciona como un portaobjetos de microscopio de vidrio
grueso en el que existe una muesca rectangular donde se encuentra una cámara
grabada con cuadrícula de líneas perpendiculares grabadas con láser para poder
contar la concentración de células en un fluido; a través de este, se determinó que
existe una alta tasa de viabilidad celular de las CME de pollo en base a lo
observado bajo el microscopio y con sus respectivos cálculos.
VIII. RECOMENDACIONES
• A la hora de realizar la limpieza de la yema de huevo con el papel filtro, es
importante realizarlo con mucho cuidado puesto que le lleva podría romperse,
además de qué si el papel filtro se queda pegado con la yema por mucho tiempo
será más difícil retirarlo.
• Antes de realizar cada actividad, asegurarse de qué se posean todos los equipos
e instrumentos necesarios para poder desarrollar el proceso correctamente, esto
permitirá que cada actividad se la realice mucho más rápido
IX. BIBLIOGRAFÍA
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