“AÑO DE LA UNIDAD, LA PAZ Y EL DESARROLLO"
UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ FAUSTINO SANCHEZ CARRIÓN
FACULTAD BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
INFORME N°6
ASIGNATURA: Bioquímica General
SEMESTRE ACADÉMICO: III
DOCENTE: María Luisa Socorro Solano Timoteo
TÍTULO: Espectrofotometría
MESA: 2
GRUPO: 2
FECHA: 19/06/23
HORA: 2:00 - 5:00 pm
INTEGRANTES:
▪ Romero Lázaro, Miharu Kazumi
▪ Rosales Espinoza, Jennifer Maricielo
▪ Vidal Pacheco, Rosaflor Alexandra
▪ Villareal Mejía, Kristell Adriana
2023
INTRODUCCIÓN
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección
específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son
relativamente sencillos.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto
permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en
plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está compuesta de fotones cada uno
de los cuáles tiene una energía:
Efotón = h⋅ν = h⋅c/λ
Donde c es la velocidad de la luz, ν es su frecuencia, λ su longitud de onda y h= 6.6 10 -34 Joules
es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de
onda λ, esto significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda.
Cuando una molécula absorbe un fotón, se excita pasando un electrón de un orbital del estado
fundamental a un orbital excitado de energía superior.
Cada molécula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que dependen de su
estructura electrónica y que la distinguen del resto de moléculas. Como consecuencia, el espectro
de absorción, es decir, la luz absorbida en función de la longitud de onda, constituye una verdadera
seña de identidad de cada sustancia o molécula.
Los espectros de absorción se miden mediante un instrumento denominado espectrofotómetro. En
esta práctica nos centraremos a utilizar las radiaciones electromagnéticas de longitudes de onda
que van de 420 a 620 nm, denominada región VISIBLE (VIS).
Los procesos de absorción de las radiaciones electromagnéticas son explicados por la Ley de
Lambert-Beer.
Su expresión es:
A = log Io/It = e. l. C
A = - log It/Io = e. l. C
Donde:
A: Absorbancia o Extinción
Coeficiente de extinción molar. Valor constante
e: que depende de la naturaleza de la sustancia y de
la longitud de onda
I: Ancho del recipiente de la muestra = 1cm
C: Concentración de la muestra problema
OBJETIVOS:
o Conocer las partes fundamentales de un espectrofotómetro y el
fundamentodel método de la espectrofotometría.
o Aplicar la ley de Lambert-beer para cuantificar una muestra coloreada
problema.
METODOS:
Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para la
determinación de moléculas o elementos constitutivos de los organismos se
encuentra la espectrofotometría, que utiliza la medición de la intensidad de la luz
transmitida y/o absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos
químicos en solución.
MATERIALES Y EQUIPOS:
Tubos de ensayo Pipeta
Piseta Agua destilada
Propipeta Gradilla
Celdas Vaso precipitado de 250 ml
Permanganato de Potasio Electrofotómetro
PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS:
A. Determinar la longitud de onda (𝝀) óptima para la muestra coloreada.
- Preparar una solución diluida de la muestra coloreada de permanganato de potasio
(KMno4)
1 ml de (KMno4)
+
9 ml de agua
destilada
- Realizar un barrido (o escaneado) de 400 a 700 nm, con una escala (espacios de 20en
20 nm).
- Usar agua destilada para calibrar el espectrofotómetro a CERO, en cada cambio de
longitud de onda, antes de la lectura de la solución diluida.
- Luego, colocar la muestra, pero no olvidar que antes se debe de lavar 3 veces las
pequeñas celdas y después añadir la muestra y colocarla en el espectrofotómetro y
tomar las lecturas de absorbancia de la muestra teniendo en cuenta su longitud de
onda (𝜆).
- La longitud de onda óptima para su solución coloreada será donde obtuvo la mayor
lectura de absorbancia (A). Observar los resultados.
Determinación de la longitud de onda óptima
de la muestra coloreada (KMnO4)
1.4
1.156 1.144
1.2
Longitud de onda (nm)
1
0.672
0.8 0.724
0.6
0.4 0.274 0.258
0.2 0.0040.01
0.002 0.0020.0020.002 0.01 0.01 0.01 0.01
0
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
Lectura de absorbancia (A)
Como resultado del experimento, obtuvimos que la longitud de onda (λ) óptima de la muestra
coloreada de permanganato de potasio (KMnO4) es 520 con una lectura de absorbancia de 1.156.
B. Determinación de la curva estandar o curva de trabajo
a) Preparar soluciones (estándares) coloreadas a partir de la solución coloreada madre.
Tubos
Reactivo 1 2 3 4 5 ¿?
KMnO4 0,1 % 1 ml 2ml 3ml 4ml 5ml Al ojo
Agua ml 9 ml 8ml 7ml 6ml 5ml Al ojo
[] 0,001 0,002 0,003 0,004 0.005 0.006
KMnO4 0,1 % b) De acuerdo a los datos que nos muestran
en la tabla, verteremos en un tubo 1 ml de
KMnO4.
Repetimos el mismo procedimiento para el
resto de tubos con su respectiva cantidad
(ml).
c) Una vez que tenemos el KMnO4 debemos
Agua destilada
verter agua destilada en cada tubo según nos
indican los ml en la tabla.
d) Cuando tenemos los tubos listos, lo
colocamos en las celdas y lo llevamos para
que sean leídos en el espectrofotómetro.
e) El espectrofotómetro debe estar
calibrado a la longitud de onda
óptima encontrada.
Leer la Absorbancia de cada
solución estándar.
f) Graficar en la ordenada de Y las lecturas (A) y en la ordenada X, las concentraciones (mg/dl)
Curva estándar del KMnO4
4.5
4.097
3.812
4
3.408
3.5
Lectura de Absorbancia (A)
3
2.563
2.431
2.5
1.5
1.064
0.5
0
0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
Concentraciones [ ]
1. Demostrar la ley de Lambert-Beer
La Ley de Lambert-Beer que relaciona la intensidad de la luz incidente (Io) y la transmitida (It)
en función de la concentración de las moléculas y átomos que absorben la luz.
Su expresión es:
A = log Io/It = e. l. C o
A = - log It/Io = e. l. C
Donde:
A: Absorbancia o Extinción
e: Coeficiente de extinción molar. Valor constante que depende de la naturaleza de la sustancia y
de la longitud de onda.
l: ancho del recipiente de la muestra = 1 cm
C: Concentración de la muestra problema
Concentración [] Absorbancia
0.001 1.064
0.002 2.563
0.003 3.408 Error= 2,431
y = 733.33x
0.004 3.812 x = 2,431 = 0.0033150 = 0.003
0.005 4.097
733.33
¿? 2.431
Curva estándar del KMnO4
5
4.5
y = 733.33x
R² = 0.8655
4
Lectura de Absorbancia (A)
3.5
2.5
1.5
0.5
0
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007
Concentraciones [ ]
2. Realizar la regresión lineal de los puntos graficados, utilizando un software estadístico
(Excel).
Curva estándar del KMnO4
5
y = 733.33x
4.5 R² = 0.8655
4
Lectura de Absorbancia (A)
3.5
2.5
1.5
0.5
0
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007
Concentraciones [ ]
3. Determinar el Coeficiente de Determinación (R2)
3. Determinar el Coeficiente de Determinación (R2)
Curva estándar del KMnO4 y = 733.33x
5 R² = 0.8655
4.5
4
Lectura de Absorbancia (A)
3.5
2.5
1.5
0.5
0
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007
Concentraciones [ ]
C) Cuantificar la concentración de la muestra coloreada usando la curva de trabajo y el
programa Excel.
1. Leer las concentraciones de optima, la muestra problema, determinar la concentración.
733.33 x muestra problema
733.3 x 0.006
= 4.39998
RESULTADOS:
1. La muestra N°1 con una concentración de 0,1/10ml de la solución madre
diluido en agua destilada obtuvo una longitud de onda de 1,064 A.
2. La muestra N°2 con una concentración de 0,2/10ml de la solución madre
diluido en agua destilada obtuvo una longitud de onda de 2,563 A.
3. La muestra N°3 con una concentración de 0,3/10ml de la solución madre
diluido en agua destilada obtuvo una longitud de onda de 3,408 A.
4. La muestra N°4 con una concentración de 0,4/10ml de la solución
madre diluido en agua destilada obtuvo una longitud de onda de 3,812 A.
5. La muestra N°5 con una concentración de 0,5/10ml de la solución madre
diluido en agua destilada obtuvo una longitud de onda de 4,097 A.
6. El problema X con una concentración de 0,6/10ml de la solución madre
diluido en agua destilada obtuvo una longitud de onda de 2,431 A.
Muestra Longitud de
onda
1 1,064 A
2 2,563 A
3 3,408 A
4 3,812 A
5 4,097 A
X 2,431
DISCUSIÓN:
En esta sección se espera que se discutan los resultados obtenidos para cada
objetivo.
En particular se debe trabajar en lo siguiente:
• Cómo cambia cualitativamente el espectro de absorción según
la concentración de una sustancia
• Qué relación mantiene la Absorbancia de una muestra, a una dada
longitud de onda, con la concentración de dicha muestra.
CONCLUSIONES:
- La espectrofotometría es un método analítico indirecto porque se basa en la medición de
la absorbancia o transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la actualidad para
la identificación de un analito en una muestra problema.
- Se identificó que el equipo presenta una adecuada precisión y exactitud determinando que
las mediciones realizadas en este pueden ser confiables.
- Se ha llegado a la conclusión de que la espectrofotometría es u método o un conjunto de
técnicas para identificar sustancias o analitos, porque se basa en la medición de la
absorbancia o transmitancia de las radiaciones, es de gran utilidad en la actualidad para
la identificación de un analito en una muestra.
- Por último, cuando se desea hacer análisis a una sustancia mediante el método de
fotometría visible, debemos conocer la longitud de onda en el que la sustancia presenta
su máxima de absorción, brindando una idea de cuál es la sustancia, pues estos máximos
son característicos de cada especie permitiendo la obtención de óptimos resultados.
BIBLIOGRAFÍA:
● Sanchez, M. A. S. (s/f). TRANSMITANCIA, ABSORBANCIA Y LEY DE LAMBERT-BEER.
Innovacionumh.es. Recuperado el 27 de junio de 2023, de
https://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel_Angel_Sogo
rb/Wimba/Espectroscopia_05.htm
● (S/f). Upo.es. Recuperado el 27 de junio de 2023, de
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/FQpractica4.pdf
