Universidad Privada Antenor Orrego
Facultad de Medicina Humana
Informe de Genética Semana 10
Docentes:
● Peña Piscoya, Hugo
● Rodriguez Salvatierra, Alvaro
Integrantes:
● Montenegro Parraguez Nelly
● Neciosup Zare Ernesto Alonso
● Quito Mendoza Angela
● Rodriguez Liñan Carlton Kaoru
● Rojas Marrufo Sofia
2023
Trujillo, Perú
Semana 10
Instructivo para la práctica 10
Interpretación de resultados de pruebas moleculares de apoyo al diagnóstico
de enfermedades genéticas
Instrucciones: Lea el siguiente caso clínico y resuelva las preguntas del cuestionario.
Caso clínico práctico
Se presenta 2 niños de 10 (paciente N°1) y 8 (paciente N°2) años respectivamente,
con clínica típica de Síndrome de Marfan, el médico entre otros estudios de
laboratorio pide un estudio diferencial de PCR punto final para el gen de la fibrilina 1
(FBN1), implicado en este síndrome; obteniéndose los siguientes resultados:
LEYENDA:
● PM: Leader / peso molecular
● C (+): control positivo
● C (-): control negativo
● Ig: inmunoglobulina
● P-1: paciente 1
● P-2: paciente 2
1) ¿Cuál es el papel del gen FBN1 en el S. de Marfan y cómo es su expresión
normal?
El síndrome de Marfán es un trastorno genético autosómico dominante que afecta
las fibras elásticas del tejido [Link] fibra elástica tiene como función la
distensión y retracción, forma parte de la matriz extracelular de los tejidos y está
compuesta por elastina y una red de microûbrillas que sirve de armazón para el
depósito de elastina y el ensamblaje de las ûbras elásticas.
Esta red de microfibrillas está formada por fibrilina 1 que está codiûcada por el gen
FBN1 en el cromosoma 15q21, cuyo defecto se expresa mediante un efecto
dominante negativo, es decir, en los heterocigotos, la fibrilina 1 mutante destruye el
ensamblaje de las microfibrillas normales, posiblemente, al actuar con los productos
del alelo normal, ocasiona una formación de fibras elásticas anormales, con la
disfunción de los tejidos que la poseen. Además, se ha postulado que la fibrilina
normal inhibiría el crecimiento de los huesos largos y que las fibras elásticas a través
de su tensión controlarán el crecimiento de éstos, por lo tanto, al existir una
alteración en estas estructuras se produciría el crecimiento óseo exagerado propio
de la enfermedad.
2) Qué es el PCR de punto final o convencional:
La PCR punto final amplifica solo una región o secuencia diana elegida dentro de una
muestra compleja de DNA mediante dos pequeñas moléculas de DNA monocatenario
llamados iniciadores (primers o cebadores) de PCR.
3. Pasos para hacer un PCR punto final:
El primer paso en la PCR es mezclar los siguientes componentes o ingredientes en un
tubo: ❖ La molécula de DNA original o el DNA diana en una pequeña cantidad es
suficiente. El DNA diana puede ser parte de una muestra de DNA compleja, que
contiene múltiples genomas de diferentes organismos, pero también podría ser tan
simple como un fragmento de DNA previamente amplificado por PCR.
❖ Se necesitan dos iniciadores de PCR para comenzar la síntesis de DNA. Estos son
fragmentos cortos de DNA monocatenario que son complementarios a las secuencias
en cada extremo del segmento de DNA diana. Estos iniciadores se obtienen mediante
síntesis química de DNA.
❖ Se necesita DNA polimerasa para sintetizar las copias de DNA. La PCR implica
varios pasos de alta temperatura, por lo que se requiere una DNA polimerasa resistente
al calor. Las polimerasas termoestables se aíslan de bacterias que viven en ambientes
a temperaturas de hasta 90 o más. La DNA polimerasa Taq de Thermus aquaticus es la
más usada, pero muchas especies diferentes de bacterias termófilas han proporcionado
características mejoradas para realizar copias de una secuencia de DNA diana durante
la PCR.
❖ La DNA polimerasa necesita un suministro de nucleótidos, o bloques de
construcción para el nuevo DNA, con el objetivo de sintetizar las nuevas copias. Estos
se suministran como desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP).
❖ Una solución amortiguadora o tampón que contiene las concentraciones adecuadas
de iones y pH que garantizan las condiciones óptimas. El segundo paso de la PCR es
colocar el tubo con los ingredientes en una máquina especial llamada máquina de PCR
o termociclador, que es capaz de alternar la temperatura del tubo de reacción de PCR
de forma rápida y precisa. El termociclador alterna la temperatura desde un máximo de
95 °C hasta un mínimo de 4 °C. Normalmente, una reacción de PCR se realiza en
20-40 ciclos con tres temperaturas diferentes en cada uno de los ciclos. Cada ciclo
consta de una temperatura de desnaturalización, una temperatura de alineamiento y
finalmente una temperatura de extensión
4. ¿Qué es la electroforesis en gel?
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar moléculas cargadas
eléctricamente, como proteínas, ácidos nucleicos o carbohidratos, en función de su tamaño
y carga. Se basa en el principio de que las moléculas se moverán a través de un gel en
respuesta a un campo eléctrico aplicado.
La electroforesis en gel es una técnica ampliamente utilizada en la investigación científica y
en aplicaciones clínicas, como la detección de variantes genéticas, el análisis de proteínas y
la identificación de patógenos. Permite la separación y análisis de mezclas complejas de
moléculas, lo que proporciona información valiosa sobre su tamaño, cantidad y otras
características.
5. Según los resultados del PCR punto final ¿Cuál es la interpretación?
Según los resultados del PCR de punto final podemos inferir que el paciente número uno no
presentará el síndrome de Marfan a comparación del paciente número dos que según las
pruebas se puede deducir que si presenta dicho síndrome.
6. ¿Cómo es el proceso de migración del ADN a través del gel?.
La migración del ADN se produce mediante electroforesis. Consiste en la separación
de ácidos nucleicos a mediante una matriz sólida que actúa como filtro para separar
moléculas en un campo eléctrico en función de su tamaño y carga eléctrica. Esta
separación se realiza bajo un búfer. Por otra parte, en el caso de los ácidos
nucleicos, el grupo fosfato les confiere una carga negativa, por lo que durante la
electroforesis migran hacia el polo positivo. Para ello, se prepara un gel que se
diluye en el tampón. Luego se calienta hasta que el gel hierva lo suficiente y
posteriormente se vacía en un recipiente que sirve para solidifica
7) Explique genéticamente la razón por la cual el niño N° 1 (P-1) obtiene 80 x 103 pb y
el niño N° 2 (P-2) obtiene 200 x 103 pb; en el corrido electroforético del PCR punto
final para el gen FBN1.
Con respecto al caso del niño N° 1 se obtiene una ampliûcación menor debido a que la PCR
realizada en los exones de la región codiûcante del gen FBN1 son analizados para
mutaciones mediante secuenciación bidireccional utilizando métodos automatizados con
dideoxinucleótidos fluorescentes. Además, se encontró un cambio heterocigoto en el
nucleótido 6684 T>A en el gen FBN1. Este cambio nucleotídico genera a su vez el cambio
de una tirosina por un codón de parada prematura en la posición 2228 (Y2228X), mutación
catalogada como sin sentido.
Con respecto al niño N°2, los exones y parte de los intrones flanqueantes del gen se
ampliûcan por PCR a partir de DNA de pacientes e individuos sanos. Para obtener
resultados favorables, los fragmentos amplificados deben ser de unos 200 pares de bases.
Después de la amplificación los fragmentos se desnaturalizan, se enfrían y se someten a
electroforesis. Cada molécula de DNA de cadena sencilla asume una conformación
tridimensional que depende de su secuencia de nucleótidos. Las diferentes conformaciones
migran con velocidades distintas durante la electroforesis en gel. Por lo tanto, por cada
fragmento amplificado se visualizarán dos bandas después de teñir el gel. Un cambio de un
solo nucleótido hará que los fragmentos adquieran una conformación distinta y por tanto
una movilidad diferente en el gel.
Referencias bibliográficas
¿Qué es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR punto final)? [Internet]. Blog |
Biogenetix-Lab. 2020 [citado 11 de noviembre de 2021]. Disponible en:
[Link] asa/
2. Cruz, S., Larios, A. y Caldera, U. (2016). Estandarización de la PCR punto final, para la
detección de la mutación JAK2 V617F en pacientes con diagnóstico clínico de Síndromes
Mieloproliferativos Crónicos, atendidos en los servicios de hematología de los hospitales de
referencia nacional en el periodo febrero-octubre 2015(Monografía de pregrado).
Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua. Managua
3. Pérez, A. (2011). Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction,
PCR).
