22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

BAM Capítulo 9: Vibrio

Manual analítico bacteriológico (BAM) Página principal (/food/laboratory-methods-food/bacteriological-analytical-manual-bam)

Autores: Charles A. Kaysner (retirado), Angelo DePaola (retirado), Jr. y Jessica Jones (mailto:[email protected])

Historial de revisiones: Capítulo 9 sustancialmente reescrito y revisado en mayo de 2004

Introducción
Los miembros del género Vibrio se definen como bacilos asporógenos gramnegativos que son rectos o tienen una única curva rígida. Son
móviles; la mayoría tienen un solo flagelo polar, cuando crecen en medio líquido. La mayoría produce oxidasa y catalasa, y fermenta la
glucosa sin producir gas (7). Tres especies, V. cholerae , V. parahaemolyticus y V. vulnificus , son patógenos humanos bien documentados
(54, 78, 79, 90, 101). V. mimicus (24,103,111), es un patógeno reconocido (103) con características similares a V. cholerae, excepto la
capacidad de fermentar sacarosa. Otras especies dentro del género, como V. alginolyticus (51), V. fluvialis (71),V. furnissii (15), V.
metschnikovii (39, 70) y V. hollisae (40) son patógenos humanos ocasionales (1, 39, 96). Las especies de Vibrio representan una proporción
significativa de infecciones humanas por el consumo de mariscos crudos o poco cocidos (96). Un estudio de Florida sobre enfermedades por
el consumo de mariscos crudos informó las siguientes especies en orden descendente de frecuencia; V. parahaemolyticus , V. cholerae no
O1/O139 , V. vulnificus, V. hollisae, V. fluvialis, V. cholerae O1 (64,72).

Se han realizado varios cambios sustanciales en esta versión del capítulo sobre Vibrio , incluido un mayor énfasis en métodos moleculares
como la hibridación de colonias de ADN y PCR para la identificación y caracterización de Vibrio spp. Con la adición de estas opciones, se ha
puesto menos énfasis en algunos de los métodos más antiguos y, en algunos casos, se han eliminado algunas secciones que requieren
reactivos peligrosos o difíciles de obtener (p. ej., el reactivo O/129), pero pueden mencionarse en el texto o en las tablas. . Ha habido
avances considerables en las técnicas de detección molecular, como la PCR en tiempo real y, a medida que estos métodos se validen, se
incorporarán a la versión web de este capítulo. 
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 1/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

cholerae
V. cholerae (6), la especie tipo del género Vibrio , es el agente causante de brotes y epidemias de cólera (34, 54, 126). Varias propiedades
bioquímicas y tipos antigénicos lo caracterizan. Se puede diferenciar de otras especies de Vibrio , excepto V. mimicus , porque su
requerimiento obligatorio de iones de sodio (Na + ) (6) se puede satisfacer con las cantidades traza presentes en la mayoría de los
constituyentes de los medios. La enterotoxina del cólera (CT) es el principal factor de virulencia de la enfermedad del cólera. Se demostró
que una isla de patogenicidad genética denominada VPI (isla de patogenicidad de vibrio), que contiene la mayoría de los genes necesarios
para causar el cólera, regula el gen CT (55). La mayoría de V. choleraelas cepas recuperadas de casos epidémicos de cólera contienen un
antígeno somático común e incluyen el serogrupo O1 (54). Se han identificado más de 150 tipos antigénicos somáticos conocidos. Las cepas
que son aglutinables en los serotipos Inaba u Ogawa del antisuero O1 son patógenos humanos bien documentados. Hasta hace poco, solo el
serogrupo O1 estaba asociado con epidemias de cólera. Sin embargo, en 1993, se produjo un gran brote de cólera en India/Bangladesh a
partir de un serogrupo nuevo, hasta entonces desconocido, O139 (3). Se registraron numerosos casos en los que los pacientes tenían los
síntomas típicos del cólera clásico, cólera gravis, que antes solo se observaba con el serogrupo O1. Excepto por el antígeno O y la presencia
de una cápsula de polisacárido, este serogrupo es casi idéntico a la séptima cepa pandémica de V. cholerae(10). La cepa O139 se ha vuelto
endémica en la región de Bengala y es la causa de lo que puede conocerse como la Octava Pandemia de Cólera (34,117).

Las cepas de V. cholerae que son idénticas o muy parecidas a las cepas clínicas en cuanto a características bioquímicas, pero que no se
aglutinan en los sueros anti-O1 o -O139 ahora se denominan V. cholerae.no O1/O139 (34,53,54). Estas cepas serológicamente diversas son
abundantes en ambientes estuarinos. La evidencia indica que las cepas que no son O1/O139 están involucradas esporádicamente en
enfermedades diarreicas similares al cólera (22,73,83,96,105), pero rara vez en brotes. De hecho, se descubrió que el factor de
permeabilidad producido por una cepa distinta de O1/O139 durante una investigación de un brote de cólera era biológica e
inmunológicamente indistinguible de CT. Algunas cepas no O1/O139 también son invasivas, producen una toxina estable al calor y han
causado infecciones sépticas en personas con condiciones médicas predisponentes (83,85,93,99). La mayoría de las cepas no producen CT,
la diferencia clave entre estas y la epidemia de V. cholerae O1/O139.

V. imitar
V. mimicus (24,102) se ha asociado con diarrea después del consumo de mariscos crudos o poco cocidos (96). Aislada de muestras durante
una búsqueda de V. cholerae, V. mimicus puede diferenciarse de ese patógeno estrechamente relacionado por la falta de fermentación de la

sacarosa. El organismo aparecerá como colonias verdes en agar de tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) y crecerá en la Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 2/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

mayoría de los medios comunes sin agregar NaCl. La virulencia no está bien caracterizada, pero se ha encontrado que algunas cepas poseen
el gen de la toxina del cólera (111), producen CT demostrable en un ensayo de cultivo de tejido y el gen ctx puede detectarse mediante
amplificación por PCR.

V. parahaemolyticus
V. parahaemolyticus (36,81), la principal causa de diarrea bacteriana asociada con el consumo de pescados y mariscos en Florida (64) y
probablemente en los EE. UU., y ocasionalmente causa septicemia (96). Es un organismo estuarino halófilo que se encuentra en las aguas
costeras de prácticamente todas las regiones templadas (27, 52, 101). En las regiones templadas se ha reportado una ocurrencia estacional
en mariscos y en infecciones humanas, la mayoría en los meses más cálidos del año. En regiones subtropicales como Florida, la enfermedad
puede ocurrir durante todo el año. Todas las cepas comparten un antígeno H común, pero, hasta la fecha, se han descrito 12 tipos O
(simáticos) y más de 70 antígenos K (capsulares), aunque muchas otras cepas no pueden tipificarse (81,101). La mayoría de los aislamientos
clínicos de V. parahaemolyticusson diferenciables de las cepas ambientales por su capacidad para producir una hemolisina directa
termoestable (TDH), denominada fenómeno de Kanagawa (82,120). El gen tdh ha sido clonado y secuenciado (86,87). Ahora hay
disponibles sondas de ADN para analizar este marcador de virulencia en aislados de V. parahaemolyticus (42,77,87). Una hemolisina
relacionada termoestable (TRH), que comparte un 60 % de homología con la TDH, también se ha asociado con cepas que causan
gastroenteritis (45,46). Actualmente, no existe una prueba in vitro para detectar la producción de TRH. Muchas cepas clínicas de V.
parahaemolyticus producen tanto TDH como TRH (8,106). Taniguchi et al . (123) describieron una hemolisina termolábil, TLH, que se
encuentra en todos los V. parahaemolyticuscepas, pero no en otras especies. Se han desarrollado procedimientos de PCR y sondas de genes
para detectar los genes tlh , tdh y trh en V. parahaemolyticus (8,37,49,76,77).

V. vulnificus
V. vulnificus (33), the leading cause of death in the US related to seafood consumption and nearly always associated with raw Gulf Coast
oysters (90,104), resembles V. parahaemolyticus on TCBS agar, but can be differentiated by several biochemical reactions, including β-
galactosidase activity (31). Epidemiological and clinical investigations have shown that V. vulnificus causes septicemia and death following
ingestion of seafood or after wound infections originating from the marine environment (43,118,129). Recent gene probe assays (29,134),
PCR procedures (41), fatty acid profiles (68) and enzyme immunoassays (31,122) have been developed to detect and identify this pathogen.

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 3/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Other species
The following species have also been isolated from human stools and/or from patients with gastroenteritis, with the consumption of
shellfish as the predominant source of infection (96). V. metschnikovii differs from all other Vibrio species in lacking cytochrome oxidase
(7). Some strains (biotype II) of V. fluvialis sp. nov. (now designated V. furnissii) produce gas during D-glucose fermentation (15). V.
hollisae is a halophilic species that grows poorly, if at all, on TCBS agar which exhibits a delayed motility pattern (>48 hr) uncharacteristic
of the other vibrios (7). A variant of the tdh gene virulence marker of pathogenic V. parahaemolyticus strains was detected in some Cepas
de V. hollisae (40).

Diferenciación de especies
La Tabla 1 presenta las características diferenciales de las especies más frecuentemente asociadas con enfermedades humanas relacionadas
con el consumo de mariscos. Las tablas también se pueden encontrar en varias publicaciones, incluidas Baumann y Schubert (7), Elliot et
al. (31), McLaughlin (78) y West et al. (131).

Tabla 1. Características bioquímicas de las Vibrionaceae patógenas para humanos que se encuentran comúnmente en los mariscos*

A. hidrofilia P. shigelloides
  V. alginolyticus cholerae V fluvialis V. furnisii V.hollisae V. metschnikovii V. imitar V. parahaemolyticus V. vulnificus ** **

agar TCBS Y Y Y Y NG Y GRAMO GRAMO GRAMO Y GRAMO

agar mCPC NG PAG NG NG NG NG NG NG Y NG NG

agar CC NG PAG NG NG NG NG NG NG Y NG NG

AGS ka Ka KK KK Ka KK ka ka ka KK Dakota del Norte

oxidasa + + + + + − + + + + +

Arginina dihidrolasa − − + + − + − − − + +

ornitina descarboxilasa + + − − − − + + + − +

Lisina descarboxilasa + + − − − + + + + V +

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 4/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

A. hidrofilia P. shigelloides
  V. alginolyticus cholerae V fluvialis V. furnisii V.hollisae V. metschnikovii V. imitar V. parahaemolyticus V. vulnificus ** **

Crecimiento 0% NaCl − + − − − − + − − + +
en (p/v):
NaCl al 3 % + + + + + + + + + + +

NaCl al 6 % + − + + + + − + + + −

NaCl al 8 % + − V + − V - + - - -

NaCl al 10 % + − − − − − − − − − −

Crecimiento a 42°C + + V − Dakota del Norte V + + + V +

Ácido sacarosa + + + + − + − − − V −
de:
D-celobiosa − − + − − − − V + + −

Lactosa − − − − − − − − + V −

arabinosa − − + + + − − + − V −

D-manosa + + + + + + + + + V −

D-manitol + + + + − + + + V + −

ONPG − + + + − + + − + + −

Voges- + V − − − + − − − + −
Proskauer

Sensibilidad 10 µg O/129 R S R R Dakota del Norte S S R S R S

a:
150 µg O/129 S S S S Dakota del Norte S S S S R S

gelatinasa + + + + − + + + + + −

ureasa − − − − − − − V − − −

* Adaptado de Elliot et al. (31)

** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 5/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

A. hidrofilia P. shigelloides
  V. alginolyticus cholerae V fluvialis V. furnisii V.hollisae V. metschnikovii V. imitar V. parahaemolyticus V. vulnificus ** **

Abreviaturas: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa; mCPC, celobiosa-polimixina B-colistina modificada; AGS, inclinación de arginina-glucosa;
Y = amarillo NG = crecimiento escaso o nulo S = susceptible nd = no realizado
G = verde V = variable entre cepas R = resistente P = púrpura, V = variable
KK = alcalino inclinado / alcalino extremo KA = alcalino inclinado / ácido extremo, Ka = Slant alcalino/ Butt ligeramente ácido

Distribución y Fuentes de Contaminación

cholerae
V. cholerae O1 se excreta en grandes cantidades en las heces de pacientes con cólera y convalecientes (34,54). La enfermedad se transmite
principalmente por vía fecal-oral, indirectamente a través de suministros de agua contaminada (30,78,80,116,126,130). La propagación
directa de persona a persona no es común. Los suministros de alimentos pueden estar contaminados por el uso de heces humanas como
fertilizante o por refrescar las verduras para el mercado con agua contaminada (30, 57, 58, 80, 94). Se cree que los brotes de cólera en
varios países y en los EE. UU. se debieron al consumo de mariscos crudos, poco cocidos, contaminados o recontaminados. V. cholerae
toxigénicoO1 rara vez se aísla de los ambientes y alimentos de los EE. UU. y no se han informado aislamientos del serogrupo O139 en este
país. Por el contrario, las cepas que no son O1/O139 suelen aislarse de aguas de estuarios y mariscos (5,126). La evidencia sugiere que V.
cholerae O1 es un componente de la flora autóctona de aguas salobres, estuarios y marismas de áreas costeras de la zona templada, lo que
representa un peligro constante para la salud pública (11,126). Varias cepas O1 se han vuelto endémicas en muchas regiones del mundo,
incluidas Australia y la región de la Costa del Golfo de los EE. UU. (19,127).

V. parahaemolyticus
Este organismo se aísla con frecuencia de las aguas costeras y los mariscos en las zonas templadas de todo el mundo. Es la causa más
frecuente de enfermedades transmitidas por los alimentos en Japón (89), donde muchos residentes comen pescado crudo. Se han
producido varios brotes de gastroenteritis de fuente común atribuidos a V. parahaemolyticus en los EE. UU. (57), asociados con el
consumo de ostras (88,96). Algunos alimentos implicados en los EE. UU. son el cangrejo, los camarones y la langosta, que a diferencia del
pescado en Japón, generalmente se cocinaban antes de comer. En estos brotes se sospechan prácticas de manejo inadecuado, como
refrigeración inadecuada, cocción insuficiente, contaminación cruzada o recontaminación. Recientemente, el consumo de ostras crudas
se
Arriba ()
asoció con grandes brotes de V. parahaemolyticusgastroenteritis en la Costa Oeste en 1997 (17) y en Texas y Nueva York en 1998 (18). Las

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 6/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

cepas clínicas de la costa oeste fueron ureasa positivas y poseían los genes tdh y trh . Los brotes de Texas y Nueva York fueron causados ​por
un serotipo O3:K6 negativo para la ureasa, que solo poseía tdh . Esta cepa parece haberse vuelto pandémica y es la cepa más prevalente en
Asia (10,23,74,135).

V. vulnificus
La especie invasora, V. vulnificus, el agente causante del choque septicémico (63,90,118), es un organismo común en las aguas costeras de
algunas áreas de los EE. UU. y otros países (60,90,122,124). Se informa que causa de 20 a 40 casos de septicemia primaria cada año en los
EE. UU. con una tasa de mortalidad del 50% entre personas con enfermedad hepática y niveles elevados de hierro sérico (104). Una
revisión de casos ha determinado una asociación entre la septicemia y el consumo de ostras crudas, casi todas de aguas de la Costa del
Golfo. Esta especie también ha sido responsable de infecciones de heridas en individuos que están asociados con ambientes marinos (90).
Esta especie halófila crecerá sobre o en muchas formulaciones de laboratorio de medios que contienen NaCl; Se recomienda una
concentración mínima de 0,5%. Aunque la virulencia se asocia con una cápsula, no se ha identificado ningún marcador fiable; la mayoría de
las pruebas no pueden distinguir las cepas clínicas de las ambientales (79,108,132).

Otros vibriones halofílicos

Como V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus ; V. alginolyticus, V. fluvialis, V. furnissii, V. metschnikovii y V. hollisae se
recuperan de aguas costeras salobres, sedimentos y vida marina del ambiente de estuarios templados (7). Estas especies son componentes
normales de ese ambiente, aparecen en forma estacional y se han asociado con enfermedades humanas (12,96).

Métodos de aislamiento
Las especies de Vibrio , como muchas otras bacterias Gram-negativas, crecen en presencia de niveles relativamente altos de sales biliares.
Son facultativamente anaeróbicas y crecen mejor en condiciones alcalinas. El aislamiento de los alimentos se facilita mediante el uso de
medios formulados con un pH alcalino. El agua de peptona alcalina (APW) se usa comúnmente para aislar varias especies de interés.

La naturaleza estrictamente halófila de V. parahaemolyticus probablemente explique el hecho de que las enfermedades causadas por este
organismo no se documentaron en los EE. UU. hasta que los trabajadores comenzaron a examinar los alimentos y las heces en medios
apropiados que contenían sal añadida. Los medios utilizados para probar las reacciones bioquímicas de V. parahaemolyticus deben

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 7/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

contener 2% o 3% de NaCl. V. vulnificus requiere NaCl para crecer. Un mínimo de 0,5 % de NaCl, la concentración de la mayoría de los
medios preparados, es adecuada. El diluyente utilizado para la transferencia de suspensiones celulares o la preparación de diluciones debe
contener NaCl; por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, PBS (31).

El agar TCBS (31) es un medio comúnmente utilizado para aislar V. cholerae, V. parahaemolyticus y otras especies de mariscos. Este medio
favorece el buen crecimiento de la mayoría de las especies mientras inhibe a la mayoría de los no vibriones (65). Las formulaciones
recientes de agar selectivo para el aislamiento de V. vulnificus también han resultado eficaces. Entre estos medios, se formularon agares de
celobiosa polimixina colistina modificada (mCPC) (31) y CC (44) para diferenciar V. vulnificus de otros vibriones. Las cepas de V. cholerae ,
excepto el biotipo clásico, crecerán en agar mCPC, mientras que la mayoría de las cepas de V. parahaemolyticuslas cepas y otras especies
no lo harán. Para facilitar la identificación de aislados sospechosos, se puede usar el kit de diagnóstico rápido API 20E en lugar de los
numerosos medios bioquímicos necesarios para la identificación (31,92). Además, se pueden usar sondas de ADN o PCR para la
identificación de V. vulnificus y V. parahaemolítico (29,41)

Consideraciones Generales

Almacenamiento de muestra
La muestra debe enfriarse inmediatamente después de la recolección (alrededor de 7 °C a 10 °C) y luego analizarse lo antes posible. Debe
evitarse el contacto directo con el hielo para maximizar la supervivencia y la recuperación de los vibriones. Los vibriones pueden resultar
dañados por un enfriamiento rápido, pero crecen rápidamente en los mariscos a temperatura ambiente (20,21). A pesar de la fragilidad
reconocida de los vibriones a los extremos de calor y frío, su supervivencia mejora bajo refrigeración suave (13,14,16,38,50,95). Cuando se
requiere el almacenamiento congelado de la muestra, se recomienda una temperatura de -80 °C, si es factible (14).

Las muestras de mariscos deben manipularse de acuerdo con los procedimientos recomendados descritos por la Asociación Estadounidense
de Salud Pública (4). Se agrupan de diez a doce animales, se desbullan asépticamente en un vaso mezclador estéril y se mezclan a alta
velocidad durante 90 segundos. Este compuesto se utiliza para preparar diluciones utilizando una solución que contiene NaCl, como PBS.

Para facilitar el almacenamiento y el análisis posterior de numerosos aislamientos de una muestra, se recomienda el siguiente

procedimiento. Este método permite el análisis de sonda génica de muchos aislamientos obtenidos de una muestra, en contraste con el
Arriba ()
número mínimo que se puede manejar de manera factible mediante las pruebas bioquímicas tradicionales. Se llena una placa de
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 8/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

microtitulación estéril de 96 pocillos con 100 µl/pocillo de APW. Numerosas colonias de presuntos vibriones se recogen de una placa de
agar selectivo utilizando un palillo de dientes estéril o una varilla de transferencia de madera a pocillos individuales. Se registra el patrón de
inoculación y la placa se incuba de 3 a 5 horas o durante la noche a 35 ± 2 °C. Se utiliza un replicador de 48 puntas para replicar/transferir
los aislados de los pocillos a una placa de agar para el análisis de la sonda génica. Después de la replicación, se distribuyen asépticamente
100 µl de TSB-NaCl al 1 %-glicerol al 24 % (TSG) en cada pocillo. La placa se envuelve en una doble capa de papel aluminio o plástico y se
coloca en un ultracongelador, de -72° a -80°C, para el almacenamiento de cultivos. Cuando sea necesario, la placa se descongela
parcialmente y los cultivos de los pocillos se transfieren o replican a una nueva placa de microtitulación o medio en tubo. La pureza del
cultivo se puede determinar rayando en un medio de agar como T1 norte 3 .

Técnicas de Base Genética

Estas tecnologías más nuevas tienen la ventaja de una detección e identificación más rápidas y se incluyen para aquellos laboratorios con el
equipo adecuado. La identificación basada en PCR ofrece un análisis de un día (5, 8, 9, 35, 41, 66, 67, 107, 109, 119, 125), mientras que los
procedimientos de sonda genética, incluidos los presentados en este capítulo, son análisis de uno a dos días (29, 37
,42,61,69,76,77,87,97,100,133,134,136,137). El procedimiento cualitativo tradicional y la técnica del número más probable (NMP) requieren
de cuatro a siete días para completarse (31). Sondas marcadas con fosfatasa alcalina (AP) para identificar la presencia de V.
parahaemolyticus y cepas que albergan el gen tdh , y detectar V. vulnificusen una muestra están disponibles comercialmente. Un lote de
sonda etiquetada comercialmente como AP es suficiente para procesar aproximadamente 200 filtros. Se pueden usar filtros de papel
económicos (Whatman 541) para levantamientos de colonias.

También se presentan sondas de amplicón marcadas con digoxigenina (dig) (97) para las tres especies en cuestión. Las ventajas del
procedimiento de sonda marcada con excavación son: (a) se puede preparar internamente; (b) económico de preparar; (c) más grupos
informadores por molécula de sonda; (d) el doble del número de copias de la sonda preparada ya que también se etiqueta el complemento
inverso, (e) la solución de la sonda se puede usar varias veces, (f) la hibridación y la temperatura de lavado son las mismas para todas las
sondas de excavación, (g ) la membrana de nylon se puede quitar de una sonda e hibridar con una(s) sonda(s) adicional(es), y (h) el uso de
una membrana de nylon permite la transferencia entre superficies de agar, es decir, desde un agar no selectivo para resucitar células antes
de moverlas a un agar selectivo y diferencial.

Controles recomendados

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 9/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Se debe usar más de un medio de siembra para los vibriones porque las cepas pueden variar en sus características de crecimiento. El agar T
1 N 3 funciona bien para todos los vibriones relevantes para la salud humana. Deben utilizarse cepas de control positivas y negativas para
todos los ensayos fenotípicos y genotípicos para garantizar una interpretación adecuada de las reacciones.

Medios, reactivos, suministros y equipos

A. Medios (/food/laboratory-methods/media-index-bam) y reactivos (/food/laboratory-methods/reagents-index-
bam)
1. Agua peptonada alcalina (APW) ( M10 (/food/laboratory-methods/bam-media-m10-alkaline-peptone-water) )
2. LRA medio ( M7 (/food/laboratory-methods/bam-media-m7-aki-medium) )
3. Sesgos de glucosa de arginina (AGS) ( M16 (/food/laboratory-methods/bam-media-m16-arginine-glucose-slant-ags) )
4. Agar sangre (5% glóbulos rojos de carnero) ( M20 (/food/laboratory-methods/bam-media-m20-blood-agar) )
5. Caldo de extracto de levadura de casaminoácidos (CAYE) ( M34 (/food/laboratory-methods/bam-media-m34-casamino-acids-
yeast-extract-salts-ca-ye-broth) )
6. Agar de celobiosa polimixina colistina modificada (mCPC) ( M98 (/food/laboratory-methods/bam-media-m98-modified-
cellobiose-polymyxin-b-colistin-mcpc-agar) )
7. Agar celobiosa colistina (CC) (M189)
8. Medio de prueba de motilidad-1% NaCl ( M103 (/food/laboratory-methods/bam-media-m103-motility-test-medium-semisolid)
)
9. Reactivo de oxidasa (1% N,N,N,N'-tetrametil-p-fenilendiamina.2HCl en dH 2 O) ( R54 (/food/laboratory-methods/bam-r54-
oxidase-reagent) )

10. Diluyente peptona-tween-sal (PTS) (90)

11. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) ( R59 (/food/laboratory-methods/bam-r59-phosphate-buffered-saline-pbs-ph-74)
)
12. Discos de polimixina B, 50 U (Difco o equivalente) ( R64 (/food/laboratory-methods/bam-r64-polymyxin-b-disks-50-units)
)
Arriba ()
13. Sol. salina - 0,85% en dH 2 O ( R63 (/food/laboratory-methods/bam-r63-physiological-saline-solution-085-sterile) )
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 10/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

14. Solución de NaCl al 2% ( R71 (/food/laboratory-methods/bam-r71-sodium-chloride-dilution-water-2-and-3) )

15. Desoxicolato de sodio - 0,5% en dH 2 O estéril (R91)
16. Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS) [ M147 (/food/laboratory-methods/bam-media-m147-thiosulfate-citrate-
bile-salts-sucrose-tcbs-agar) ]
17. Agares T 1 N 1 y T 1 N 3 (1 % de triptona y 1 % o 3 % de NaCl) ( M163 (/food/laboratory-methods/bam-media-m163-tryptone-
salt-agar-t1n1-agar-and-t1n2-agar) )
18. T 1 N 0 , T 1 N 3 , T 1 N 6 , T 1 N 8 , T 1 N 10 caldos ( M161 (/food/laboratory-methods/bam-media-m161-tryptone-broth-and-
tryptone-salt-broths-t1n0-t1n1-t1n3-t1n6-t1n8-t1n10) )
19. Agar tríptico de soja-sulfato de magnesio- 3 % de NaCl (TSAMS) (32) Caldo de tripticasa (o tríptico) de soja (TSB), agar (TSA)
(M152) ( con (/food/laboratory-methods/bam-media-m152-trypticase-tryptic-soy-agar) NaCl añadido, 2 %)

20. TSB-1% NaCl-24% glicerol

21. Caldo de urea ( M171 (/food/laboratory-methods/bam-media-m171-urea-broth) ) (o agar de urea de Christensen ( M40
(/food/laboratory-methods/bam-media-m40-christensens-urea-agar) ) con NaCl añadido (2%) ( R71 (/food/laboratory-
methods/bam-r71-sodium-chloride-dilution-water-2-and-3) )
22. Antisuero polivalente O1 y O139 contra V. cholerae
23. Kit de detección de enterotoxinas VET-RPLA TD920A (Oxoid, Inc.)
24. Agar sacarosa para Vibrio parahaemolyticus (VPSA) ( M191 (/food/laboratory-methods/bam-media-m191-vibrio-vulnificus-
sucrose-agar-vpsa) )
25. Agar Vibrio vulnificus (VVA) ( M190 (/food/laboratory-methods/bam-media-m190-vibrio-vulnificus-agar-vva) )
26. Tiras y reactivos de diagnóstico API 20E (BioMerieux)

B. Reactivos de sonda, equipo y materiales necesarios

1. Baño(s) de agua con agitación capaz de alcanzar una temperatura de hasta 65 °C. (temperaturas necesarias, 42, 54, 55 y 65°C)
2. Plataforma de agitación a temperatura ambiente 
Arriba ()
3. Microonda
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 11/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

4. Caja de luz UV de onda larga o reticulador UV (longitud de onda de 254 nm)

5. Bolsas tolerantes al calor (y sellador) o recipientes de plástico con tapas (300-500 ml de capacidad)
6. Placas de microtitulación de 96 pocillos con tapas
7. Micropipeta de 8 o 12 canales
8. replicador de 48 puntas
9. Filtros Whatman 541, 85 mm (pedido especial para este diámetro, 1541-085 de Whatman)
10. Whatman #3 o filtro o almohadilla absorbente equivalente
11. Membranas de nylon (membrana de transferencia MagnaGraph) (carga positiva), 82 mm (Osmonics, Inc, Westboro, MA,
cuadriculada-NJOHG08250, simple-NJOHY08250)
12. Pantallas de malla de fibra de vidrio, pantalla de ventana doméstica disponible en ferreterías (59)
13. palos de hockey esterilizados
14. Palillos de dientes estériles o palillos de madera para aplicar
15. Placas de petri de vidrio, 100 mm
16. Solución de lisis (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) (Maas I) - (R94) añadir a la lista de reactivos
17. Solución neutralizante (Tris-HCl 1,0 M, pH 7,0 en NaCl 2,0 M) para membranas de nailon (Maas II) (R95)
18. Tampón de acetato de amonio 2M (para sonda marcada con AP y filtros 541) - (R1) modifique el reactivo 1 para incluir esto.
19. 1× SSC, 5× SSC, 20× SSC (citrato salino estándar) - (R77) editar para agregar 1,5,20
20. 1× SSC - 1% SDS (dodecilsulfato de sodio) y 3× SSC- 1% SDS - (R93) agregar nuevo reactivo
21. Solución de Sarkosyl al 10 % (N-lauroil-sarcosina, sal sódica) - (R96) añadir nuevo reactivo
22. Solución SDS al 10 % (dodecilsulfato de sodio) - (R92) agregar nuevo
23. Tris 1M, pH 7,5 (base Trizma; N.° de catálogo Sigma T1503)

24. Tris 1M, pH 9,5 (base Trizma; N.° de catálogo Sigma T1503) Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 12/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

25. NaCl 3M
26. 1 MgCl 2
27. Solución madre de proteinasa K (20 mg/ml)
28. Solución de hibridación (BSA, SDS, PVP en 5× SSC) (para sonda marcada con AP)
29. Reactivo de color NBT/BCIP [cloruro de tetrazolio azul nitro/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo], sal de toluidina, Roche
Diagnostics Cat. No. 1697471 (para detección colorimétrica)
30. Amortiguadores de excavación 1, 2, 3 y 4 (97)
31. Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0
32. Reactivo de bloqueo (Roche Diagnostics Cat. No.1096176)
33. Solución de lavado A y B (97)

34. Anti-Dig AP [Anti-digoxigenina fosfatasa alcalina, fragmentos Fab] (Roche Diagnotics Cat. No. 1093274)
35. dig-11-dUTP (N.º de catálogo de Roche Diagnostics 1093088)
36. N.º de cat. CSPD Roche Diagnostics No. 1755633 (para detección quimioluminiscente)

Precauciones
No se ha desarrollado un buen caldo de enriquecimiento selectivo para V. cholerae . Sin embargo, debido a su rápido tiempo de generación,
los períodos cortos de incubación son efectivos para el aislamiento. APW proporciona un enriquecimiento adecuado para períodos de
incubación de 6 a 8 h, pero otra microflora competidora puede crecer demasiado V. cholerae durante períodos de enriquecimiento más
largos para ciertos tipos de muestras. Se han utilizado períodos nocturnos (16 a 18 h), aunque no deseables, para facilitar el análisis de
muestras durante las horas de trabajo. Si el producto se sometió a un paso de procesamiento, es decir, se espera calentamiento,
congelación, secado o densidades bajas, se recomienda la incubación durante la noche para resucitar completamente las células lesionadas.
La incubación de muestras de ostras crudas en APW a 42 °C durante 6 a 8 h ha resultado eficaz para el aislamiento deV. cholerae y se
recomienda (26). Sin embargo, DePaola y Hwang (28) encontraron que la incubación de enriquecimiento durante 18 a 21 h, en lugar de 6a
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 13/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

8 h, dio una mayor recuperación de O1 V. cholerae cuando se usaron inóculos bajos. Debido a estas consideraciones, se recomienda
sembrar los enriquecimientos de APW después de 6 a 8 h y después de la incubación durante la noche. También se recomienda para las
ostras crudas usar una proporción de 1:100 de ostra a APW (28).

Procedimientos

V cholerae:
A. Enriquecimiento y emplatado
1. Pesar 25 g de muestra en un frasco tarado (capacidad aproximada de 500 ml). Los productos como los mariscos o las verduras
se pueden licuar o cortar en trozos pequeños con unas tijeras esterilizadas.
2. Agregue 225 ml de APW al frasco. Mezcle bien la muestra o mezcle durante 2 minutos a alta velocidad.
3. Incubar APW a 35 ±2°C durante 6 a 8 h. Vuelva a incubar el frasco durante la noche si la muestra se procesó de alguna manera.
Para análisis de ostras crudas, incluir un segundo matraz tarado con 25 g de producto más 2475 ml APW. Este matraz debe
incubarse de 18 a 21 h a 42 ±0,2 °C en un baño de agua (28,31). Si se desea, también se puede realizar una técnica de
enumeración por el número más probable (MPN).
4. Preparar placas secas de agar TCBS. También se pueden incluir agares CPC o CC modificados.
5. Transfiera un asa de 3 mm de la película de superficie del cultivo de APW a la superficie de una placa de TCBS seca (y mCPC o
CC) y estríe de manera que produzca colonias aisladas.
6. Incubar TCBS durante la noche (18 a 24 h) a 35°±2°C. Incube mCPC y CC durante la noche a 39-40 °C; si no se dispone de una
incubadora a 39-40 °C, entonces 35-37 °C suele ser adecuada, ya que la selectividad está determinada principalmente por los
antibióticos en la formulación que por la alta temperatura.
7. Las colonias típicas de V. cholerae en agar TCBS son grandes (2 a 3 mm), lisas, amarillas y ligeramente aplanadas con centros
opacos y periferia translúcida.

8. Las colonias típicas de V. cholerae en agar mCPC o CC son pequeñas, lisas, opacas y de color verde a púrpura, con un fondo
Arriba ()
púrpura en una incubación prolongada.
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 14/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

9. Para la identificación bioquímica, las colonias de las placas llenas se deben sembrar en agar no selectivo (T 1 N 1 , T 1 N 3 o agar
TSA-2% NaCl) para obtener pureza. Incubar durante la noche a 35 ±2 °C y proceder a la identificación utilizando una única
colonia aislada.
10. Subcultive tres o más colonias típicas de cada medio de cultivo en placas inclinadas de agar T 1 N 1 o muestras de medio de
prueba de motilidad. Incube las muestras inclinadas o cortadas durante la noche a 35° ±2°C.
B. Detección y confirmación
1. Arginina glucosa inclinada (AGS). Inocule cada cultivo sospechoso de T 1 N 1 a AGS rayando la inclinación y pinchando el
trasero. Incube AGS con la tapa suelta durante la noche a 35° ±2°C. Los cultivos de V. cholerae y V. mimicus tendrán una
inclinación alcalina (púrpura) y un extremo ácido (amarillo), ya que la arginina no se hidroliza. No se produce gas ni H2S .
2. Tolerancia a la sal. Del cultivo T 1 N 1 , inocule ligeramente un tubo de cada uno de los caldos T 1 N 0 y T 1 N 3 . Incube los tubos
durante la noche a 35° ±2°C. Los cultivos de V. cholerae y V. mimicus crecerán sin NaCl.
3. Prueba de cuerdas. La prueba del hilo (110) es una prueba presuntiva útil para sospechas de V. cholerae , ya que todas las cepas
son positivas. Emulsione una colonia grande de un cultivo de agar T 1 N 1 en una pequeña gota de desoxicolato de sodio al 0,5 %
en dH 2 O estéril. En 60 segundos, las células se lisan (pérdida de turbidez) y las cadenas de ADN cuando se levanta un asa llena
(hasta 2 a 3 cm) del portaobjetos.
4. Reacción de oxidasa. Transfiera el crecimiento de T 1 N 1 durante la noche usando un alambre de platino (no se debe usar
alambre de nicrom) o una varilla aplicadora de madera a un papel de filtro saturado con reactivo de oxidasa (1% N,N,N,N'-
tetrametil-p-fenilendiamina. 2HCl). Un color púrpura oscuro que se desarrolla dentro de los 10 segundos indica un crecimiento
de prueba positivo. Alternativamente, agregue una gota de reactivo al crecimiento en una placa inclinada o de agar T 1 N 1 . V.
cholerae y V. mimicus son oxidasa positivos.
5. Prueba de aglutinación serológica. La serotipificación de cultivos sospechosos de V. cholerae que pasan la prueba del hilo
utilizando antígenos somáticos u O brinda evidencia epidemiológica importante. Dos serotipos principales del serogrupo O1,
Ogawa e Inaba, y el serogrupo O139 se reconocen como patógenos humanos. Los dos serotipos de O1 se observan tanto en el
biotipo clásico de V. cholerae como en el de El Tor. El serogrupo O139 se asemeja únicamente al biotipo El Tor.

a. Para cada cultivo, marque tres secciones (con lápiz de cera) de aproximadamente 1 × 2 cm en el interior de una placa de

Petri de vidrio o en un portaobjetos de vidrio de 2 × 3 pulgadas y agregue una gota de solución salina al 0,85% en la parte
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 15/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

inferior de cada sección marcada. Con un asa o aguja de transferencia estéril, emulsione el cultivo T 1 N 1 en la solución salina
para una sección y repita para la otra sección. Comprobar si hay aglutinación.
b. Agregue una gota de antisuero polivalente contra V. cholerae O1 a una sección de cultivo emulsionado y mezcle con un asa
o aguja estéril. Agregue una gota de anti-O139 a una sección separada. (Tercera sección)
c. Incline la mezcla de un lado a otro durante un minuto y observe contra un fondo oscuro. Una reacción positiva se indica
mediante una aglutinación fuerte y rápida en un fondo claro.
d. Si es positivo, pruebe por separado con los antisueros de Ogawa e Inaba. El serotipo Hikojima reacciona con ambos
antisueros.
e. Los anticuerpos contra Inaba y Ogawa, y el antígeno del grupo O1 están disponibles comercialmente (es decir, Columbia
Diagnostics Inc., Springfield, VA). De manera similar, el antisuero O139 está disponible comercialmente.
Los resultados de cultivos no aglutinables deben informarse como V. cholerae no O1/O139 .

C. Pruebas bioquímicas
La Tabla 2 presenta el número mínimo de caracteres necesarios para identificar las cepas de V. cholerae . La capacidad de V. cholerae
para crecer en triptona al 1% sin añadir NaCl lo diferencia de otros vibrios positivos para sacarosa. La tira diagnóstica API 20E se ha
utilizado con éxito para la identificación y confirmación de aislamientos (92). Aquí se puede utilizar el sistema de placas de
microtitulación para el almacenamiento de aislados sospechosos.

D. Diferenciación de biotipos El Tor y Clásico.

Aunque el biotipo Clásico rara vez se encuentra, las siguientes son pruebas opcionales para diferenciarlos del biotipo El Tor:

1. Beta-hemólisis. El medio más común para diferenciar los biotipos de V. cholerae O1 , y quizás el más fácil, es determinar la
capacidad β-hemolítica en agar sangre de carnero. Las cepas El Tor son β-hemolíticas, mientras que las cepas clásicas no
producen hemolisina. Inocular una placa de agar sangre con cultivos de prueba mediante la aplicación de manchas en la
superficie e incubar 18-24 h a 35° ±2°C. La beta-hemolisina puede determinarse por una zona clara alrededor del crecimiento
del cultivo.

2. Sensibilidad a la polimixina-B. Vierta un cultivo sospechoso en una placa de agar seco T 1 N 1 y coloque un disco de 50 unidades

de polimixina-B en la superficie. Invierta la placa, incube durante la noche a 35° ±2°C y registre el resultado. Las cepas clásicas
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 16/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

son sensibles (zona >12 mm); Las cepas El Tor son resistentes. Si el cultivo sospechoso crece en agar mCPC, que contiene
polimixina B, se considera que es del biotipo El Tor.
E. Determinación de la enterotoxigenicidad

La mayoría de las cepas de V. cholerae aisladas de los alimentos o del medio ambiente no producen la toxina del cólera (CT) y no se
consideran virulentas. Los aislamientos identificados como V. cholerae o V. mimicus deben analizarse para determinar la producción
de CT o el gen ctx (111).
1. Ensayo de células suprarrenales de ratón Y-1 (98). Se ha demostrado que la TC estimula la enzima adenilato ciclasa con la
producción de monofosfato de adenosina cíclico que finalmente influye en varios procesos celulares. En el ensayo de células Y-1,
CT promueve la conversión de células similares a fibroblastos alargados en células refráctiles redondas.
El mantenimiento y paso de cultivos celulares, la preparación de placas de ensayo de microtitulación y la realización e
interpretación del ensayo se llevan a cabo como en el Capítulo 4- Escherichia coli (/food/laboratory-methods/bam-4-
enumeration-escherichia-coli-and-coliform-bacteria) de este manual.

a. Inocular los cultivos de prueba de cultivos inclinados T 1 N 1 en tubos de caldo CAYE e incubar durante la noche a 30°
±2°C.

b. Inocular una porción de 10 ml de caldo CAYE en un matraz Erlenmeyer de 50 ml de cada cultivo estacionario; incubar
durante 18 horas con agitación. Centrifugar cada cultivo de prueba; filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm.
Los filtrados refrigerados se pueden almacenar hasta por 1 semana.

c. Agregue alícuotas de 25 µl de cada filtrado, tanto sin calentar como calentado a 80 °C durante 30 min, a los pocillos de la
placa de ensayo de microtitulación. Además de los filtrados de cultivos toxigénicos y no toxigénicos conocidos, agregue
alícuotas de 0,025 ml de preparaciones que contengan 1,0 y 0,1 ng de CT/ml. La supresión del redondeo celular mediante
el tratamiento de los filtrados de prueba con suero anti-CT es un control aconsejable para las reacciones inespecíficas.

2. Inmunoensayo para TC. Se ha desarrollado un inmunoensayo comercialmente disponible para detectar la presencia de CT en
filtrados de cultivo de V. cholerae y V. mimicus (VET-RPLA, Oxoid, Inc., Ogdensburg, NY).

a. Inocular los cultivos de prueba en medio AKI e incubar a 35 ± 2 °C durante 18 h con agitación a 100 rpm. Centrifugar de 5
a 7 ml de cultivo a 8.000 × g durante 10 min. Esterilizar por filtración el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 µm o
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 17/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

utilizarlo tal cual. Pruebe el sobrenadante o el filtrado siguiendo el protocolo del fabricante utilizando placas de
microtitulación cónicas de 96 pocillos. Incubar la placa durante la noche, sin perturbaciones a temperatura ambiente.
3. Otras toxinas

La importancia de otras toxinas en la patogenicidad humana es poco conocida y estos ensayos no se recomiendan para análisis
de rutina. Madden et al. (73) también demostraron aislamientos clínicos que eran patógenos para conejos lactantes. McCardell
et al . encontraron una citolisina termolábil producida por V. cholerae no O1/O139 . (75) ser citotóxico para las células
suprarrenales de ratón Y-1 y las células de ovario de hámster chino, ser rápidamente letal tras la inyección intravenosa en
ratones adultos y provocar la acumulación de líquido en las asas ileales de conejo (112). Si se desea, los cultivos pueden
analizarse para enterotoxina termoestable (ST) (75,121) o citotoxina (83,100).
F. Detección genotípica del gen de la toxina del cólera por reacción en cadena de la polimerasa (67)

El gen CT puede estar presente en cepas de V. cholerae y V. mimicus , pero no se expresa en condiciones experimentales. Por lo tanto,
se recomienda un ensayo genotípico como la amplificación por PCR del gen ctx . Este procedimiento ofrece un resultado más rápido y
es menos complicado que los ensayos fenotípicos.

1. Cebadores de PCR de toxina del cólera, soluciones madre de 10 pmol/µl.

a. Adelante 5'-tga aat aaa gca gtc agg tg-3'

b. Inversa 5'-ggt att ctg cac aca aat cag-3'

El producto de la PCR es un fragmento de 777 pb.

2. Enriquecimiento APW. A partir de la preparación de muestras anterior a la incubación de 6 a 21 h, prepare un lisado crudo para
PCR hirviendo 1 ml de mezcla de enriquecimiento APW en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 10 min. El lisado puede
usarse inmediatamente para PCR o almacenarse a -20 °C hasta su uso. Para aislados sospechosos de V. cholerae y V. mimicus y
cultivos de control, inocular 1 ml vol. de APW, incubar 18 h a 35 ° ±2 °C y continuar con el paso de ebullición.

3. Para minimizar la contaminación cruzada de los reactivos de PCR, se recomienda preparar una mezcla maestra de PCR y
almacenar alícuotas congeladas (-20 °C) hasta su uso. Las mezclas maestras contienen todos los reactivos necesarios excepto
Taq polimerasa y el lisado (plantilla) que se amplificará. La reacción final contiene: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; MgCl2 1,5 mM ; 200
µM cada uno de dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 2 a 5% (v/v) de lisado APW (plantilla); 0,5 µM de cada cebador y 2,5 U Taq 
Arriba ()
polimerasa por 100 µl de reacción. Pueden usarse volúmenes de 25 a 100 µl. Agregue la polimerasa Taq a la mezcla maestra y

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 18/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

agregue la plantilla después de la distribución a los recipientes de reacción de tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Algunos
termocicladores pueden requerir una capa de aceite mineral (50-70 µl). Se deben utilizar las siguientes condiciones del
termociclador:

tiempo temperatura
Condiciones del termociclador: (min) (°C)

Desnaturalización inicial 3 94

desnaturalización 1 94

Primer recocido 1 55

Extensión de imprimación 1 72

Extensión final 3 72

Nº ciclos: No más de 35

4. Análisis en gel de agarosa de productos de PCR. Mezcle 10 µl de producto de PCR con 2 µl de gel de carga 6X y cargue los
pocillos de muestra de gel de agarosa al 1,5 a 1,8 % que contenga 1 µg/ml de bromuro de etidio sumergido en TBE 1×. Use un
voltaje constante de 5 a 10 V/cm. Ilumine el gel con un transiluminador UV y visualice las bandas relativas a la migración del
marcador de peso molecular. Los cebadores enumerados dan un fragmento de 777 pb de ctxAB . Se pueden tomar fotografías
Polaroid del gel para documentación. Se deben incluir controles de cultivo positivos y negativos y control de reactivos con cada
serie de PCR.
Probes have been developed to also detect the presence of ctxAB (133) A dig-labeled probe can also be prepared of the PCR
amplification product for detection of the ctxAB gene using colony hybridization. The preparation of the probe, the
hybridization conditions for colony blots of suspect isolates and wash protocol follow those outlined in the technical literature of
Roche Diagnostics, Indianapolis, IN(97).

5. Final report.

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 19/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

The final report for V. cholerae should include biochemical and serological identification of the isolate and enterotoxicity
results. The minimal number of characters to identify the species are presented in Table 2.

Table 2. Minimal Number of Characters needed to Identify

V. cholerae and V. parahaemolyticus Strains

  Positive Reaction Percentage

Gram-negative, asporogenous rod + 100

oxidase + 100

String ± 100

L-lysine decarboxylase + 100

L-arginine dihydrolase - 0

L-ornithine decarboxylase + 98.9

growth in 1% tryptone brotha + 99.1b/0c

a No sodium chloride added.

bV. cholerae (and V. mimicus)
cV. parahaemolyticus

From Hugh and Sakazaki (48)

Other Vibrios

V. parahaemolyticus

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 20/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Three analytical schemes for enumerating V. parahaemolyticus are presented. The first is the MPN procedure commonly used by many
laboratories. In addition, this procedure is nearly identical for enumeration of V. vulnificus. The second is a membrane filtration procedure
using hydrophobic grid membrane filter (HGMF) (32). The third is a direct plating method using DNA probes for identification of the total
V. parahaemolyticus population (76) and pathogenic (TDH containing) strains (77). In addition, a TRH gene probe procedure and a PCR
confirmation analysis (8) are also included.

A. Seafood samples: Enrichment, isolation, and enumeration.

1. Weigh 50 g of seafood sample into a blender. Obtain surface tissues, gills, and gut of fish. Shellfish samples include meat and
liquor. Normally 12 animals are pooled, blended at high speed for 90 sec and 50 g of homogenate used for analysis. For
crustaceans such as shrimp, use the entire animal if possible; if it is too large, select the central portion including gill and gut.
Note: same for V. vulnificus

2. Add 450 ml PBS dilution water and blend for 1 min at 8,000 RPM. This constitutes the 1:10 dilution.

Prepare 1:100. 1:1000, 1:10,000 dilutions or higher, if necessary, in PBS.

a. For molluscan shellfish, pool 12 animals. Blend 90 sec with an equal vol of PBS (1:2 diln) (4). Prepare a 1:10 dilution by
transferring 20.0g (weighing is recommended because air bubbles in the 1:2 dilution prevent accurate volumetric transfer)
of the 1:2 to 80 ml of PBS. Additional 10-fold dilutions can be prepared volumetrically (i.e. 1ml of 1:10 to 9.0ml of PBS for
a 1:100 dilution.

b. For product that has been processed, i.e. heated, dried, frozen, inoculate 3 × 10 ml portions of the 1:10 dilution into 3 tubes
containing 10 ml of 2× APW. This represents the 1 g portion. Similarly, inoculate 3 × 1 ml portions of the 1:10, 1 :100, 1:
1000, and 1 :10,000 dilutions into 10 ml of single-strength APW. If high numbers of V. parahaemolyticus are expected,
the examination may start at the 1:10 dilution of product.
3. Incubate APW overnight at 35 ±2°C.

4. Streak a 3-mm loopful from the top 1 cm of APW tubes containing the three highest dilutions of sample showing growth onto
TCBS (and mCPC or CC agars for V. vulnificus isolation)

5. Incube las placas TCBS a 35 ±2 °C (y las placas mCPC o CC preferiblemente a 39-40 °C o 35-37 °C si no se dispone de 39-40 °C)
durante la noche. 
Arriba ()
V. parahaemolyticus aparece como colonias redondas, opacas, verdes o azuladas, de 2 a 3 mm de diámetro en agar TCBS. Las

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 21/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

colonias de V. alginolyticus que interfieren y compiten son grandes, opacas y amarillas. La mayoría de las cepas de V.
parahaemolyticus no crecerán en agar mCPC o CC. Si ocurre crecimiento, las colonias serán de color verde-púrpura debido a la
falta de fermentación de celobiosa.
Purifique los aislamientos como se describió anteriormente e inocule una placa de microtitulación para el almacenamiento en el
congelador.
B. Detección y confirmación

1. Identificación bioquímica de aislados. A menos que se especifique lo contrario, todos los medios de esta sección están
preparados para contener NaCl al 2 % o al 3 %. La tira de diagnóstico API 20E se puede utilizar alternativamente aquí (92).
Preparar una suspensión celular de los cultivos sospechosos en NaCl al 2 % para el API 20E.
a. Examinar cultivos sospechosos de V. parahaemolyticus (y V. vulnificus ), utilizando AGS y caldos T 1 N 0 y T 1 N 3 como se
describió anteriormente. Incubar los tubos a 35 ±2°C durante 18-24 h.
b. Transfer two or more suspicious colonies from TCBS agar with a needle to arginine glucose slant (AGS). Streak the slant,
stab the butt, and incubate with the cap loose overnight at 35 ±2°C. Both V. parahaemolyticus and V. vulnificus produce
an alkaline (purple) slant and an acid (yellow) butt (arginine dihydrolase negative), but no gas or H2S in AGS.

c. For TSB and TSA slants (supplemented with 2% NaCl), inoculate both media and incubate overnight at 35 ±2°C. These
cultures provide inocula for other tests as well as material for the Gram stain and for microscopic examination. Both V.
parahaemolyticus and V. vulnificus are oxidase positive, Gram-negative, pleomorphic organisms exhibiting curved or
straight rods with polar flagella.
d. Inoculate a tube of motility test medium by stabbing the column of the medium to a depth of approximately 5 cm. Incubate
overnight at 35 ±2°C. A circular outgrowth from the line of stab constitutes a positive test. V. parahaemolyticus and V.
vulnificus are motile.

e. V. parahaemolyticus and V. vulnificus will only grow in T1N3 but not in T1N0. Only the salt-requiring cultures need to be
tested further.
Only motile, Gram-negative rods that produce an acid butt and an alkaline slant on AGS, do not form H2S or gas, and are
salt-requiring require further examination.

f. The identifying characteristics of V. parahaemolyticus and V. vulnificus are presented in Table 1 Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 22/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Biochemically, V. parahaemolyticus and V. vulnificus are phenotypically similar, but can be differentiated by differences
of the ONPG, salt-tolerance, cellobiose and lactose reactions (Table 1). By using selected biochemical traits, V.
parahaemolyticus and V. vulnificus can be distinguished from most interfering marine vibrios and other marine
microorganisms.

Todos los aislamientos de V. parahaemolyticus deben analizarse para detectar la presencia de ureasa, ya sea usando caldo
de urea suplementado con NaCl al 2 % o en agar de urea de Christensen suplementado con NaCl, concentración final al 2
% o usando el API 20E. Las cepas clínicas de la costa oeste de los EE. UU. y de los países asiáticos han sido
predominantemente ureasa positivas. La producción de ureasa se correlaciona con la presencia de los genes tdh y/o trh (2,
49, 62, 88, 91, 114, 115). La reacción de la ureasa es una valiosa prueba de detección de cepas potencialmente patógenas
(62).
Inocular caldo de urea-NaCl al 3% con un inóculo pesado de cultivo o colocar el cultivo en la superficie de la placa de agar
Christensen's-urea-NaCl o inclinada. Incubar 35 ±2°C 18-24 h.
La producción de ureasa está determinada por un color rosa (alcalino) en el medio.

Los cultivos negativos deben incubarse 24 h adicionales para las cepas productoras de ureasa raras y lentas.
Cuando las colonias finalmente se identifiquen bioquímicamente como V. parahaemolyticus, consulte las diluciones
positivas originales en el caldo de enriquecimiento y aplique las tablas NMP de 3 tubos ( Apéndice 2 (/food/laboratory-
methods/bam-appendix-2-most-probable-number-serial-dilutions) ) para la enumeración final del organismo.

g. Como alternativa, los aislamientos se pueden identificar como V. parahaemolyticus o V. vulnificus mediante hibridación
con sonda de ADN o PCR, como se describe en las siguientes secciones.

2. Procedimiento de enumeración de filtración de membrana de rejilla hidrofóbica (HGMF) (25, 32)

El aparato, los filtros y las instrucciones específicas se pueden obtener de QA Laboratories, San Diego, CA.

a. Prepare una dilución 1:10 de muestra de marisco con diluyente de peptona tween-sal (PTS) y mezcle durante 60 segundos
a alta velocidad. Filtrar 1,0 ml u otro volumen de homogeneizado a través de HGMF utilizando diluyente estéril como
vehículo. Con fórceps, transfiera asépticamente el HGMF del aparato de filtración a la superficie de una placa de NaCl de
sulfato de magnesio de agar de soja tríptico seca (TSAMS) M152. Incubar 4 h a 35 ±2°C. Se pueden preparar dilucionesde
diez veces si se esperan niveles altos de V. parahaemolyticus . Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 23/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

b. Con fórceps, transfiera asépticamente el HGMF del TSAMS a la superficie de una placa seca de agar sacarosa V.
parahaemolyticus (VPSA) M191. Invertir la placa e incubar a 42 °C durante 18 a 20 h.

c. En VPSA, las colonias de V. parahaemolyticus serán de color verde a azul y llenarán al menos la mitad del cuadrado de la
cuadrícula. Esta es una enumeración presuntiva. Deben identificarse al menos cinco colonias representativas. Otros
crecimientos normalmente serán amarillos debido a la fermentación de la sacarosa. Los cuadrados confirmados se deben
multiplicar para obtener el total de colonias típicas y calcular el MPN/g de mariscos. Por ejemplo, si 3 de 5 colonias
presuntas se confirman bioquímicamente como V. parahaemolyticus , entonces el número total de colonias presuntas
debe multiplicarse por 0,6 para estimar la densidad de V. parahaemolyticus . Las colonias de V. vulnificus también serán
de color azul/verde. Las sondas de ADN pueden diferenciar las especies (29,61,76,134).

3. Tipificación serológica (47,81)

V. parahaemolyticus posee tres componentes antigénicos: H, O y K. El antígeno H es común a todas las cepas de V.
parahaemolyticus y tiene poco valor en la determinación de serotipos. El antígeno K, o capsular, puede eliminarse del cuerpo
bacteriano calentando el aislado durante 1 o 2 horas a 100 °C. Este proceso expone el antígeno O, o somático, que es
termoestable. Dado que el antígeno K enmascara al antígeno O, es necesario eliminar el primero por calentamiento antes de
realizar las pruebas de aglutinación de O.
Hay 12 grupos O y más de 70 antígenos K conocidos (47). Se ha encontrado que cinco de los antígenos K ocurren con cualquiera
de los dos antígenos del grupo O; por lo tanto, hay 76 serotipos reconocidos ( Tabla 3 ). Las pruebas serológicas por sí solas no se
utilizan para identificar V. parahaemolyticus debido a las reacciones cruzadas con muchos otros organismos marinos. Sin
embargo, durante las investigaciones de brotes de origen alimentario, las pruebas serológicas se convierten en una herramienta
epidemiológica valiosa.

Cuadro 3. Esquema antigénico de V. parahaemolyticus (1986) a

oh grupo tipo k

1 1,25,26,32,38,41,56,58,64,69

2 3,28 
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 24/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

oh grupo tipo k

3 4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65

4 4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67

5 5,15,17,30,47,60,61,68

6 6,18,46

7 7,19

8 8,20,21,22,39,70

9 9,23,44

10 l9,24,52,66,71

11 36,40,50,51,61

12 52

Total 12 sesenta y cinco

a The antigenic scheme was first established by Sakazaki et al. (101) and later extended by the Commission of the Serotyping of V. parahaemolyticus (Japan); K
antigens, 2,14,16,29,35, and 62 were excluded by the Commission (47).
K types 4,5,6,7,8,9, and 19 occur with more than one O group.

V. parahaemolyticus diagnostic antiserum kits are produced commercially in Japan and available from Nichimen Co., 1185
Avenue of the Americas. 31st Floor, New York, NY 10036; (212) 719-1000 or Accurate Chemical and Science Corp, San Diego,
CA 800-255-9378 . Because the antiserum is expensive, it is not recommended for most laboratories. CDC has serotyping
capability.

4. Determining pathogenicity 
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 25/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Kato et al. (56) showed that V. parahaemolyticus isolates from the stools of patients with enteric infections are hemolytic on a
special high-salt human blood agar, whereas V. parahaemolyticus isolates from seafood and marine water usually are not.
Wagatsuma (128) later modified this special agar to avoid confusion with the regular normal hemolytic activity of V.
parahaemolyticus on conventional 5 % sheep blood agar. The special agar was named Wagatsuma agar and the special
hemolytic response the Kanagawa phenomenon. Freshly drawn human, dog or sheep blood is used in preparation of the agar.

The correlation has been well established that V. parahaemolyticus strains that cause illness in humans are almost always
Kanagawa-positive and isolates recovered from seafood are almost always Kanagawa-negative (81,82,101,102,106). In addition,
extensive investigation in animal models suggests that the Kanagawa hemolysin is the primary virulence factor in V.
parahaemolyticus (82,120). The Kanagawa test, or hybridization with the tdh gene probe provides reliable information on the
presence of pathogenic strains isolated from foods. Due to the difficulty of obtaining fresh blood and the strong correlation
between Kanagawa phenomenon and presence of the tdh gene, it is recommended to use DNA probe methods described in this
chapter to determine potential virulence of V. parahaemolyticus isolates instead of the Kanagawa phenomenon.

a. Genotypic detection of hemolysin genes of V. parahaemolyticus.

Alkaline phosphatase- and digoxigenin-labeled DNA probes can be used for the identification of V. parahaemolyticus . A
thermolabile hemolysin gene, tlh, has been found in all strains of V. parahaemolyticus, but not in other species (123) and
DNA probes have been used for identification. Two DNA probe procedures that have been shown to be equivalent are
presented. DNA probes have also been constructed to detect the thermostable direct hemolysin, tdh (87) and thermostable
related hemolysin, trh (46), genes that are associated with pathogenic strains.
An alkaline phosphatase-labeled (AP) tlh probe (76) is commercially prepared for use with Whatman 541 colony lifts. The
hybridization and detection procedure for the AP-tlh and AP-tdh probes (77) are presented below, using a hybridization
and wash temperature of 54°C. Digoxigenin-labeled probes for tlh and trh were constructed of PCR amplification products
using the primer sets reported by Bej et al. (8). The tdh probe was constructed using a primer set based on the
oligonucleotide probes of Nishibuchi et al. (87), using tdh1 as the forward primer and the reverse compliment of tdh4
(tdh4c) as the reverse primer. The probes are labeled with digoxigenin during amplification according to the procedure
described by Roche Diagnostics(97). These amplicons are of the following sizes; 450 bp tlh, 424 bp tdh and 500 bp trh.
1. Alkaline phosphatase-labeled oligonucleotide probes (AP-tlh and AP-tdh) (76,77)

Store probes in the refrigerator for one-to-two years; do not freeze. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 26/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Probe sequences are:

Species specific AP-labeled

thermolabile hemolysin (tlh) 5'Xaa agc gga tta tgc aga agc act g 3'
(where X is the AP-label)

hemolisina directa termoestable ( tdh ), AP-etiquetado

la hemolisina de Kanagawa, 5'Xgg ttc tat tcc aag taa aat gta ttt g 3'

Las sondas se pueden adquirir en DNA Technology ApS, Science Park Aarhus, Gustav Wledsd Vej 10, DK-8000, Aarthus C, Dinamarca. Teléfono 45
86 20 33 88, Fax 45 86 20 21 21, correo electrónico [email protected].

2. La preparación de muestras y las diluciones son las mismas que con el procedimiento MPN. Además, la preparación
de la muestra y las condiciones de hibridación son las mismas para el recuento simultáneo de V. vulnificus , excepto
que se siembra en VVA M190 y una temperatura de hibridación de 55 °C (29). Justo antes de usar, seque
completamente las placas de agar T 1 N 3 M161 (y VVA) invertidas con las tapas abiertas durante 1 hora a 35 °C. Este
es un agar no selectivo.

i. Reúna 10-12 carnes de ostras y homogeneice en partes iguales, por peso, con PBS durante 90 segundos a alta
velocidad (dilución 1:1) (4).

ii. Pesar 0,20 g de este homogeneizado de ostra:PBS (1:2) directamente del mezclador (representa 0,1 g o una
dilución -1 de tejido de ostra) en una placa T 1 N 3 utilizando una balanza con una sensibilidad de 0,01 g para la
placa de tara. Pipetee 100 µl de las diluciones -1, -2 y -3 en placas T 1 N 3 con las diluciones. Para los mariscos
cosechados de diciembre a marzo, las diluciones -1 y -2 de la placa son adecuadas, mientras que de mayo a
octubre, los meses de verano, las diluciones -1, -2 y -3 son adecuadas para la placa. El nivel de detección es de
10 UFC/g.

iii. Para pescados y mariscos que no sean ostras, se debe usar la dilución inicial de 1:10, debido a los restos de
producto de la homogeneización. Inocular la superficie de T 1 N 3 con 100 µl de esta dilución de muestra 1:10.
Así el nivel de detección será de 100 UFC/g.

iv. Use palos de hockey estériles para esparcir el inóculo uniformemente en las placas de agar T 1 N 3 . Las placas
secas y la distribución uniforme del inóculo son esenciales para el aislamiento adecuado de la colonia. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 27/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

v. Incube las placas de 18 a 24 h a 35 ± 2 °C. Todas las placas deben usarse para la hibridación y los
levantamientos de colonias, a menos que haya un crecimiento confluente.

3. Preparación del filtro

i. Superponga las placas T 1 N 3 (y VVA) con filtros Whatman #541 etiquetados (número de muestra, dilución)
(85 mm) durante 1 a 30 min. Para las placas que se utilizarán para la detección de tdh , marque el filtro y la
placa para la alineación y la posterior recuperación de colonias. Guarde el plato en el refrigerador. Transfiera
los filtros con el lado de la colonia hacia arriba a una tapa de placa de Petri de plástico o vidrio que contenga 1
ml de solución de lisis. Microondas en placas de petri de vidrio (potencia máxima) durante 15 a 20
segundos/filtro según la potencia del microondas; rote los platos con filtros y repita el microondas. Los filtros
deben estar calientes y casi completamente secos, pero no de color marrón. Precaución: El tiempo de
microondas debe controlarse de cerca cuando se usa un horno de microondas nuevo o diferente, ya que los
filtros pueden arder con llamas si se usan en exceso. Microondas máximo de 6 filtros a la vez.
ii. Neutralizar filtros 5 min. en agitador a temperatura ambiente en un recipiente redondo con acetato de amonio
(4 ml/filtro).
iii. Enjuague brevemente el filtro Whatman #541 2 veces en tampón SSC 1x (10 ml/filtro). Se pueden combinar
hasta 10 filtros en un contenedor. (Los filtros se pueden secar y almacenar en este punto).
iv. Tratamiento con proteinasa K
Incube hasta 30 filtros en solución de proteinasa K (10 ml/filtro) durante 30 min a 42 °C con agitación (50
rpm) en un recipiente de plástico para destruir la fosfatasa alcalina natural y digerir la proteína bacteriana.

v. Enjuague el filtro 3 veces en 1X SSC (10 ml/filtro) durante 10 min a temperatura ambiente con agitación, 50
rpm. (Los filtros se pueden secar y almacenar en este punto).

4. Hibridación
i. En una bolsa de plástico, remoje previamente el filtro en tampón de hibridación durante 30 min a 54 °C (55 °C
para V. vulnificus ) con agitación, 50 rpm. Utilice un máximo de 5 filtros/bolsa con 10-15 ml de tampón.

ii. Retire el tampón de la bolsa y agregue 10 ml de tampón/filtro precalentado nuevo. Agregue la sonda (la Arriba ()
concentración final es de 0,5 pmol/ml) a la bolsa con filtros e incube durante 1 hora a 54 °C (55 °C para V.
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 28/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

vulnificus ) con agitación. La temperatura es crítica para los pasos de hibridación y lavado.
iii. Enjuague el filtro 2 veces durante 10 min cada una en 1× SSC - 1% SDS (para tlh ) o 3× SSC - 1% SDS (para tdh )
(10 ml/filtro) a 54°C (55°C para V. vulnificus ) con sacudidas. En un recipiente de plástico, enjuague el filtro 5
veces durante 5 min cada una en 1× SSC a temperatura ambiente con agitación, 100 rpm.

5. Desarrollo de color
i. En una placa de Petri, agregue 20 ml de solución NBT/BCIP. Agregue filtros (5 o menos) al plato e incube con
agitación a temperatura ambiente, cubra para omitir la luz. Comprobar el desarrollo del control positivo cada
30 min; la reacción suele completarse en 1-2 h.

ii. Enjuague con agua del grifo (10 ml/filtro) 3 veces durante 10 minutos cada una para detener el revelado. No
exponga los filtros a la luz, ya que seguirán desarrollándose. Cuente las manchas moradas o marrones, en
comparación con una serie de controles en filtros separados. Almacenar en la oscuridad o bajo soportes de
acetato.
iii. Recuperar colonias tdh + alineando los filtros desarrollados con la placa correspondiente. Limpie el área de la
superficie del agar correspondiente a la señal positiva con un asa estéril y raye una placa de agar TCBS. Pruebe
de 5 a 10 colonias con sondas tlh y tdh para confirmar V. parahaemolyticus patógeno

6. Preparación de filtros para el recuento de V. parahaemolyticus mediante sondas marcadas con digoxigenina (97)
i. Las secuencias de cebadores para la preparación de amplicón de sondas marcadas con digoxigenina y las
condiciones de PCR para la construcción se detallan a continuación:

gene proteína codificada ubicación secuencia

tlh hemolisina termolábil (8) L-TLH 5' aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg 3'

R-TLH 5' gct acto ttc etiqueta gato ttt ctc tgc 3'

tdh hemolisina directa termoestable tdh-1 5' cca tct gtc cct ttt cct gcc 3'
(hemolisina de Kanagawa) (87) 
tdh-4c 5' cca cta cca ctc tca tat gc 3' Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 29/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

gene proteína codificada ubicación secuencia

verdad hemolisina relacionada termoestable (8) VPTRH-L 5' ttg gct tcg ata ttt tca gta tct 3'

VPTRH-R 5' gato aac aaa gato atg ccc att tcc g 3'

ii. Se deben utilizar las siguientes condiciones del termociclador:

verdad y verdad tdh

Condiciones de PCR Temperatura Tiempo Temperatura Tiempo

Sostener 94°C 3 minutos 94°C 10 minutos

Desnaturalizar 94°C 1 minuto 94°C 1 minuto

Recocer 60°C 1 minuto 58°C 1 minuto

Extender 72°C 2 minutos 72°C 1 minuto

Sostener 72°C 3 minutos 72°C 10 minutos

Sostener 8°C indefinido 8°C indefinido

  25 ciclos 25 ciclos

iii. Se deben inocular membranas premarcadas por triplicado si se desean hibridaciones con las tres sondas
marcadas con dig de V. parahaemolyticus . Las densidades de V. parahaemolyticus pueden determinarse con
la sonda tlh y las densidades de las cepas patógenas pueden determinarse utilizando hibridaciones tdh y trh .
Los resultados se informan como el número respectivo/g. Aunque las membranas no son estériles, el manejo
cuidadoso no interferirá con el análisis.
iv. Las diluciones de una muestra se preparan como se ha descrito anteriormente. Volúmenes de cien µl (0,2 g
de
homogeneizado de ostra 1:2) se sembraron directamente en membranas de nailon marcadas sobre la superficie
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 30/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

de placas de agar T 1 N 3 bien secas . Se utiliza una membrana separada para cada una de las tres sondas.
Normalmente, las diluciones -1, -2 y -3 son adecuadas. El nivel mínimo de detección es 100/g (10/g para ostra).
Se usa un palo de hockey estéril para esparcir suavemente el inóculo sobre la superficie de la membrana.

v. Incubar las placas T 1 N 3 durante 3 h a 35 ±2°C. Con unas pinzas, transfiera la membrana a la superficie de una
placa de agar TCBS e incube durante la noche a 35 ± 2 °C.

vi. After incubation, estimate the number of green colonies and proceed with the hybridization steps. If no green
colonies are present, no hybridization is necessary. The microtiter plate system of retention of suspect isolates
can be used at this point by picking green colonies to plate wells with sterile toothpicks.
vii. The colonies on membranes are lysed by placing them colony side up on an absorbent pad containing 4 ml lysis
soln. (Maas I) for 30 min at room temperature. A slight heating by microwaving for 20 sec may also be used.

viii. The membranes are then transferred with forceps to an absorbent pad containing 4 ml neutralizing soln. (Maas
II) for 30 min at room temperature.

ix. Dry membranes briefly on a paper or cloth towel, then cross-link the DNA to the membrane for 3 min under
UV light source, 254 nm, or in a UV cross-linker.

7. Día 1. Hibridación con sondas marcadas con excavación y detección colorimétrica o quimioluminiscente. (97)

i. Caliente el baño de agua con agitador a 65°C.

ii. Coloque la(s) membrana(s) en una bolsa sellable tolerante al calor o en un recipiente de plástico con tapa. Las
membranas se pueden apilar espalda con espalda con un espaciador de pantalla de malla de fibra de vidrio
entre cada par (59).

iii. Cubra la pila con solución de prehibridación. Incubar sumergido a 65°C durante 1 h.
iv. Retire la(s) membrana(s) de la bolsa, el recipiente y limpie suavemente cada una con una toallita de laboratorio
humedecida con solución de prehibridación. Este paso elimina el exceso de material de colonia. (Este paso es
opcional dependiendo del tamaño de la colonia).

v. Cubra la(s) membrana(s) con solución de prehibridación e incube a 65 °C sumergido durante 2 h. Son 
aceptables tiempos de prehibridación más prolongados. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 31/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

vi. Hierva la sonda de excavación de doble cadena durante 10 min.

vii. Vierta la solución de prehibridación y agregue la sonda mientras aún está caliente. Hibridar sumergido a 65°C
durante la noche.

8. Día 2. Pasos de lavado y detección

i. Después de la hibridación, guarde la solución de la sonda en un tubo de plástico resistente al calor en el

congelador. La sonda se puede almacenar hasta un año.
ii. Retire la(s) membrana(s) a la bandeja de plástico y lave dos veces (en una pila) cubriéndolas con solución de
lavado A durante 5 min a temperatura ambiente en un agitador, 50-100 rpm.

iii. Lave la(s) membrana(s) dos veces cubriéndolas con solución de lavado B precalentada en una bolsa o
recipiente a 65 °C durante 15 min.
iv. Prepare el tampón Genius Dig 2 agregando 0,25 g de reactivo de bloqueo en polvo a 50 ml de Genius Dig Buffer
1, agite vigorosamente y coloque en el microondas o en un baño a 65 °C para disolver el reactivo de bloqueo.
Agite cada 10 min hasta que se disuelva, luego enfríe a temperatura ambiente.

9. Detección colorimétrica (opción 1) o consulte la opción 2 a continuación.

i. Prepare la solución de color añadiendo una tableta de NBT/BCIP o 0,2 µl de solución madre de NBT/BCIP
disuelta en 10 ml de Dig buffer 3.

ii. Vierta la solución de anticuerpo. Cubra la membrana con Dig buffer 1 en una bandeja de plástico con agitación
durante 15 min a temperatura ambiente, 50 rpm. (Utilice un plato o una bolsa recién lavados, uno que no haya
estado en contacto con anti-Dig)
iii. Vierta Dig buffer 1 y cubra nuevamente con Dig buffer 1. Incube 15 min a temperatura ambiente con agitación.
iv. Vierta el tampón 1 y cubra la bandeja con el tampón Dig 3 durante 3 min a temperatura ambiente.

v. Agregue aproximadamente 10 ml de solución de sustrato de color NBT/BCIP por 2-4 membranas. Las
membranas se pueden colocar espalda con espalda (lados de la colonia expuestos). Incubar en bolsa o plato en

oscuridad a temperatura ambiente. No agite el recipiente mientras se desarrolla el color. El precipitado de color
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 32/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

comienza a formarse en unos pocos minutos y generalmente se completa después de 12 h, pero es evidente en
3-4 h.

vi. Una vez que se detectan los puntos deseados, en comparación con los puntos de control conocidos, lave la
membrana con 50 ml de tampón Dig 1 durante 5 minutos para detener la reacción. Cuente las manchas de
púrpura a marrón y calcule el número/g de muestra.
vii. La membrana se puede almacenar, húmeda, en una bolsa después de un breve enjuague en Dig buffer 4 para
retener el color.

viii. Extracción de la sonda

Las membranas de nailon se pueden pelar y volver a sondear si se desea. Los detalles se describen en el manual
de Roche Diagnostics (97).

10. Para detección quimioluminiscente (opción 2).

i. Caliente el reactivo CSPD a temperatura ambiente.

ii. Retire la(s) membrana(s) de la bolsa/recipiente, cubra el plato con Dig buffer 1 durante 1 min a temperatura
ambiente.
iii. En un recipiente/bolsa, cubra la(s) membrana(s) con Dig buffer 2 e incube a temperatura ambiente en una
bandeja agitadora durante 1 h, 50 rpm. Se aceptan tiempos de bloqueo más largos.
iv. Drene el tampón Dig 2.
Cubra la(s) membrana(s) con el tampón Dig 2 con fosfatasa alcalina anti-dig añadida a 1:5000 (agregue 5 µl de
anti-dig por cada 25 ml de tampón Dig 2).
v. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en la bandeja del agitador, 50 rpm.

vi. Limpie el portadocumentos de acetato con EtOH al 95 %. Coloque la membrana sobre acetato, agregue 0,5 ml
de CSPD/100 cm2 de membrana. Limpie las superficies exteriores de acetato, colóquelo en un casete con
película de rayos X. Exponga (generalmente no más de 1 h) y revele la película según las especificaciones del
fabricante.

Arriba ()
11. Identificación por PCR multiplex de V. parahaemolyticus (8)

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 33/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Análisis de PCR multiplex de V. parahaemolyticus , un paso de confirmación alternativo para aislamientos

sospechosos.
Prepare plantillas de cultivo cultivando durante la noche a 35 ± 2 °C en TSB-2 % de NaCl. Centrifugar un ml de
cultivo en un tubo de microcentrífuga durante 3 min a 15.000 × g. Lave el sedimento dos veces con solución salina
fisiológica. Resuspender el precipitado en 1,0 ml de dH 2 0 y hervir 10 min. Guarde la plantilla a -20°C hasta su uso.
Se deben utilizar los siguientes juegos de cebadores:

Tres juegos de imprimaciones (8)

Específico de la especie del gen tlh (450 pb) L-TL 5' aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg 3'
[igual que antes].

R-TL 5' gct acto ttc etiqueta gato ttt ctc tgc 3'  

gen trh (500 pb) igual que antes. VPTRH-L 5' ttg gct tcg ata ttt tca gta tct 3'

VPTRH-R 5' gato aac aaa gato atg ccc att tcc g 3'

gen tdh (270 pb) VPTDH-L 5' gta aag gtc tct gac ttt tgg ac 3'

VPTDH-R 5' tgg aat aga acc ttc atc ttc acc 3'

Se recomiendan los siguientes reactivos de PCR:

Reacción vol.
Reactivo (la concentración final es la misma que la anterior)

dH 2 O 28,2 µl

10× Tampón.MgCl 2 5,0 µl


dNTP 8,0 µl Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 34/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Reacción vol.
Reactivo (la concentración final es la misma que la anterior)

mezcla de imprimación (6 imprimaciones) 7,5 µl

plantilla 1,0 µl

Taq polimerasa 0,3 µl

Volumen total 50,0 µl

Se deben utilizar las siguientes condiciones de PCR:

Condiciones de PCR:

desnaturalizar 94°C 3 minutos

94°C 1 minuto  

recocer 60°C 1 minuto

extender 72°C 2 minutos

extensión final 72°C 3 minutos

sostener 8°C indefinido

25 ciclos

12. Análisis en gel de agarosa de productos de PCR.

Mezcle 10 µl de producto de PCR con 2 µl de gel de carga 6X y cargue los pocillos de muestra de gel de agarosa al 1,5
a 1,8 % que contenga 1 µg/ml de bromuro de etidio sumergido en TBE 1×. Use un voltaje constante de 5 a 10 V/cm.

Ilumine el gel con un transiluminador UV y visualice las bandas relativas a la migración del marcador de peso Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 35/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

molecular. Se pueden tomar fotografías Polaroid del gel para documentación. Se deben incluir controles de cultivo
positivos y negativos y control de reactivo con cada serie de PCR.
>

V. vulnificus
Método de identificación y enumeración Se describen
dos esquemas analíticos para aislar y enumerar V. vulnificus . El primero es un análisis del número más probable (NMP) junto con la
identificación de aislados sospechosos mediante perfiles bioquímicos, hibridación de colonias con sonda de ADN o PCR. El segundo
esquema incluye dos métodos de siembra directa que emplean hibridación con sondas de ADN para la identificación de colonias que se han
utilizado en varios estudios y han demostrado ser equivalentes al método MPN (29,134). Una técnica de cromatografía de gases que
compara los perfiles de ácidos grasos también ha tenido éxito para identificar V. vulnificus (68).

Muestras de mariscos

A. Enriquecimiento, aislamiento y enumeración

1. Prepare una dilución inicial de muestra de 1:10 en PBS siguiendo el procedimiento para V. parahaemolyticus . Preparar
diluciones decimales en PBS. Prepare una dilución 1:10 del homogeneizado de ostras de la siguiente manera: Pese 20 gramos del
homogeneizado en una botella estéril y agregue PBS para diluir hasta un peso final de 100 g. Mezclar agitando. Se pueden
preparar volumétricamente diluciones adicionales de 10 veces (es decir, 1 ml de 1:10 a 9,0 ml de PBS para una dilución de
1:100).

2. Inocule 3 porciones de 1 ml de las diluciones en 3 tubos que contengan 10 ml de APW. Si se esperan números bajos, se pueden
inocular porciones de 2 g (1 g de ostra) directamente del mezclador en 3 × 100 ml de APW. Incubar los tubos de 18 a 24 h a
35±2°C.
3. Vierta un asa de 3 mm desde la parte superior de 1 cm de los tubos APW con crecimiento en agares selectivos mCPC o CC.
Incube los agares mCPC y CC durante la noche a 39-40 °C (35-37 °C si no se dispone de 39-40 °C). En cualquier agar, las
colonias son redondas, planas, opacas, amarillas y de 1 a 2 mm de diámetro.
4. Tras la identificación de V. vulnificus , consulte las diluciones positivas originales de APW y aplique las tablas NMP de 3 tubos

(Apéndice 2) para la enumeración final del organismo. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 36/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

B. Identificación bioquímica de aislados.

A menos que se especifique lo contrario, todos los medios de esta sección están preparados para contener un mínimo de 0,5 % de
NaCl. Nota: si se usa una sonda de ADN o una PCR para la confirmación, los pasos 5 a 7 no son necesarios.
1. Transfiera dos o más colonias sospechosas con una aguja de placas de agar CC o mCPC a TSA con NaCl al 2 % y estríe para el
aislamiento.
2. Inocular medios bioquímicos usando una sola colonia. Las reacciones de detección, AGS, reacción de oxidasa, motilidad y
tolerancia a la sal se utilizan como para V. parahaemolyticus .
3. También se pueden utilizar tiras de diagnóstico API 20E. Preparar la suspensión de cultivo en solución de NaCl al 2%. Las
reacciones bioquímicas para diferenciar V. vulnificus de V. parahaemolyticus se pueden encontrar en la Tabla 1.

C. Identificación con sonda de ADN del gen de citolisina específico de especie, vvhA (29,134)
La secuencia de oligonucleótidos para el marcador de fosfatasa alcalina:
5'; Xga gct gtc acg gca gtt gga acc a 3';

La fuente de esta sonda es la misma que para V. parahaemolyticus ,

1. La preparación de muestras y las diluciones son las mismas que con el procedimiento MPN y las que se presentan para la
hibridación de sonda AP para V. parahaemolyticus , excepto que el medio de placa es agar Vibrio vulnificus seco (VVA).
2. Pesar 0,20 g de homogeneizado de ostra:PBS directamente del mezclador (0,1 g de tejido de ostra y dilución -1) en una placa
VVA utilizando una balanza con una sensibilidad de 0,01 g para la placa de tara.

3. Pipetee 100 µl de las diluciones -1 y -2 en placas VVA etiquetadas. De diciembre a marzo, las diluciones -1 y -2 son adecuadas
para el enchapado y de mayo a octubre, los meses de verano, las diluciones -1, -2 y -3 son adecuadas.
4. Use palos de hockey estériles para esparcir el inóculo de ostras de manera uniforme en las placas VVA. Las placas secas y la
distribución uniforme del inóculo son esenciales para el aislamiento adecuado de la colonia. Incubar las placas 18-24 h a 35
±2°C. Colonias amarillas opacas relativamente grandes (1-2 mm) (apariencia de huevo frito) son típicas de V. vulnificus en VVA.
5. La detección de cultivos de control ayudará al recuento de colonias para seleccionar placas para levantamientos de colonias y
para seleccionar aislamientos para identificación y almacenamiento. 
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 37/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

6. Se deben usar placas con 25-250 colonias típicas para los levantamientos de colonias y la selección de aislamientos, si están
disponibles. Se pueden usar diluciones adicionales si no se está seguro. Los levantamientos de colonias de placas con
crecimiento confluente o sin colonias típicas probablemente serán improductivos.

7. Los filtros Whatman #541 de los levantamientos de colonias se lisan y neutralizan como se ha descrito anteriormente.
En este punto, se puede utilizar el sistema de placas de microtitulación para la retención de cultivos múltiples.
8. Preparación del filtro y tratamiento con proteinasa K: siga los procedimientos descritos en la sección para V. parahaemolyticus.
D. Enumeración de V. vulnificus por sonda de gen de ADN.

1. Los pasos de hibridación son los mismos que para V. parahaemolyticus , excepto que la temperatura de hibridación y lavado de
filtros es de 55 °C. Todos los demás pasos, incluida la detección colorimétrica, son iguales.
E. Confirmación de V. vulnificus por reacción en cadena de la polimerasa (41).
1. Los aislamientos obtenidos por el procedimiento MPN pueden confirmarse por PCR.

2. Los cebadores para PCR vvhA o marcaje dig de sonda para enumeración (amplicón de 519 bases) son de la base 785 a la 1303
del gen de la citolisina. Se deben utilizar las siguientes imprimaciones:

vvh-785f 5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3'

Vvh-1303R 5'cgc cac cca ctt tcg ggc c 3'

3. Se recomiendan los siguientes reactivos:

Volumen de reacción
Reactivo (las concentraciones finales son
las mismas que las anteriores)

dH 2 O 28,2 µl

10 × tampón. MgCl2 _ 5,0 µl 

Arriba ()
dNTP 8,0 µl

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 38/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Volumen de reacción
Reactivo (las concentraciones finales son
las mismas que las anteriores)

mezcla de imprimación (6 imprimaciones) 7,5 µl

plantilla 1,0 µl

Taq polimerasa 0,3 µl

Volumen total 50,0 µl

4. Se deben utilizar las siguientes condiciones de PCR:

Condiciones de PCR:

desnaturalizar 94°C 10 minutos

desnaturalizar 94°C 1 minuto

recocer 62°C 1 minuto

extender 72°C 1 minuto

extensión final 72°C 10 minutos

sostener 8°C indefinido

25 ciclos

5. Análisis en gel de agarosa de productos de PCR. Mezcle 10 µl de producto de PCR con 2 µl de gel de carga 6X y cargue los
pocillos de muestra de gel de agarosa al 1,5 a 1,8 % que contenga 1 µg/ml de bromuro de etidio sumergido en TBE 1×. Use un
voltaje constante de 5 a 10 V/cm. Ilumine el gel con un transiluminador UV y visualice las bandas relativas a la migración del
marcador de peso molecular. Se pueden tomar fotografías Polaroid del gel para documentación. Se deben incluir controles de
cultivo positivos y negativos y control de reactivo con cada serie de PCR. 
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 39/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

6. Las plantillas de cultivo se preparan cultivando durante la noche a 35 ± 2 °C en TSB-2 % de NaCl. Se centrifuga un ml de cultivo
a 15.000 × g durante 3 min. El sedimento se lava dos veces con solución salina fisiológica. El sedimento se resuspende en 1,0 ml
de dH 2 0 y se hierve durante 10 min. La plantilla se puede almacenar a -20 °C hasta su uso.

7. La enumeración de la sonda génica de V. vulnificus utilizando dig- vvh sigue el mismo procedimiento de cultivo directo descrito
para V. parahaemolyticus, excepto que se utiliza VVA. La temperatura de hibridación y de lavado es la misma, 65°C.

Interpretación de hallazgos microbiológicos

1. La contaminación de alimentos o agua con V. cholerae enterotoxigénico o V. mimicus (aunque rara vez se encuentra) constituye un
hallazgo importante desde el punto de vista de la salud pública. El lote completo de alimentos contaminados debe retenerse de la
distribución hasta que se notifique a las autoridades sanitarias correspondientes y se pueda realizar una investigación epidemiológica.
Se deben reportar los resultados de serogrupo, biotipo y enterotoxigenicidad para cada muestra.
2. El aislamiento de V. parahaemolyticus de los mariscos no es inusual. V. parahaemolyticus es un habitante saprofito normal del
ambiente marino costero y se multiplica durante los cálidos meses de verano (27,52). Durante este período, el organismo se recupera
fácilmente de la mayoría de las especies de mariscos cosechadas en las zonas costeras. Las cepas virulentas se separan de las
avirulentas de V. parahaemolyticus mediante la prueba de Kanagawa o detección del gen tdh (120). En la mayoría de los casos, las
cepas de mariscos negativas para V. parahaemolyticus Kanagawa no causan gastroenteritis humana. La presencia de cepas positivas
de Kanagawa, o tdh y/o trhque contienen cepas, constituye un problema de salud pública. Un producto procesado térmicamente no
debe contener V. parahaemolyticus viable y, de ser así, indicaría un problema significativo en las prácticas de fabricación o
contaminación posterior al proceso.
3. Durante los meses de verano, los mariscos de la Costa del Golfo y del Atlántico Medio normalmente contienen V. vulnificus y se han
aislado niveles altos en áreas cálidas de estuarios (118). El organismo es raro en los mariscos de la costa oeste. Se ha demostrado que
la mayoría de las cepas aisladas son potencialmente virulentas. Se ha encontrado que los aislados clínicos, ambientales y alimentarios
son altamente virulentos para los ratones (60,90,113,124), pero las infecciones son relativamente raras incluso entre aquellos de
mayor riesgo (enfermedad del hígado). Sin embargo, se debe advertir a las personas en riesgo que no consuman mariscos crudos
durante ciertos períodos del año cuando aumentan los niveles de V. vulnificus , normalmente de mayo a octubre (84,104). Al igual
que con V. parahaemolyticus, un producto procesado térmicamente no debe contener V. vulnificus viable y su aislamiento es un

hallazgo significativo. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 40/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Reconocimiento

Los autores desean agradecer a los colaboradores anteriores de la FDA en este capítulo: Robert M. Twedt (retirado), Joseph M. Madden
(retirado), Elisa L. Elliot y Mark L. Tamplin.

Referencias
1. Abbott, SL y JM Janda. 1994. Gastroenteritis severa asociada con infecciones por Vibrio hollisae : Informe de dos casos y revisión.
clin. Infectar. Dis. 18 :310-312.
2. Abbott, SL, C. Powers, CA Kaysner, Y. Takeda, M. Ishibashi, SW Joseph y JM Janda. 1989. Aparición de un bioserovar restringido de
Vibrio parahaemolyticus como causa predominante de gastroenteritis asociada a Vibrio en la costa oeste de los Estados Unidos y
México. J. Clin. Microbiol. 27 :2891-2893.
3. Albert, MJ 1994. Vibrio cholerae O139 Bengala. J. Clin. Microbiol. 32 :2345-2349.
4. Asociación Estadounidense de Salud Pública. 1970. Procedimientos recomendados para el examen de agua de mar y mariscos. 4ª ed.
Asociación Estadounidense de Salud Pública, Washington, DC.

5. Arias, CR, E. Garay y R. Aznar. 1995. Método de PCR anidado para la detección rápida y sensible de Vibrio vulnificus en peces,
sedimentos y agua. aplicación Reinar. Microbiol. 61 :3476-3478.
6. Baumann, P., AL Furniss y JV Lee. 1984. Género I. Vibrio Pacini 1854, 411 AL . En el Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey
(eds. NR Krieg y JG Holt) The Williams & Wilkins Co., Baltimore/Londres.
7. Baumann, P. y RHW Schubert. 1984. Familia II. Vibrionaceae, pág. 516-550. En NR Krieg y JG Holt (eds.), Manual de bacteriología
sistemática de Bergey, 1ª ed. Williams & Wilkins Co., Baltimore/Londres.
8. Bej, AK, DP Patterson, CW Brasher, MCL Vickery, DD Jones y CA Kaysner. 1999. Detección de Vibrio parahaemolyticus total y
productor de hemolisina en mariscos mediante amplificación por PCR multiplex de tlh, tdh y trh . J. Microbiol. metanfetamina 36
:215-225.

9. Bej, AK, AL Smith III, MCL Vickery, DD Jones y MH Mahbubani. 1996. Detección de Vibrio cholerae viable en mariscos usando
Arriba ()
PCR. Prueba de alimentos. Anal. Dic/Ene: 16-21.
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 41/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

10. Berche, P., C. Poyart, E. Abachin, H. Lelievere, J. Vandepitte, A. Dodin y JM Fournier. 1994. La nueva cepa epidémica O139 está
estrechamente relacionada con la cepa pandémica O1 de Vibrio cholerae . J. infectar. Dis. 170 :701-704.
11. Blake, PA, DT Allegra, JD Snyder, TJ Barrett, L. McFarland, CT Caraway, JC Feeley, JP Craig, JV Lee, ND Puhr y RA Feldman. 1980.
Cólera: un posible foco endémico en los Estados Unidos. N. ingl. J.Med. 302 :305-309.

12. Blake, PA, RE Weaver y DG Hollis. 1980. Enfermedades de los humanos (aparte del cólera) causadas por vibriones. Ana. Rev.
Microbiol. 34 :341-367.
13. Boutin, BK, AL Reyes, JT Peeler y RM Twedt. 1985. Efecto de la temperatura y suspensión del vehículo sobre la supervivencia de
Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus . J. Protección de alimentos. 48 :875-878.
14. Bradshaw, JG, DW Francis y RM Twedt. 1974. Supervivencia de Vibrio parahaemolyticus en pescados y mariscos cocidos a
temperaturas de refrigeración. aplicación Microbiol. 27 :657-661.
15. Brenner, DJ, FW Hickman-Brenner, JV Lee, AG Steigerwalt, GR Fanning, DG Hollis, JJ Farmer III, RE Weaver, SW Joseph y RJ
Seidler. 1983. Vibrio furnissii (anteriormente biogrupo aerogénico de Vibrio fluvialis ), una nueva especie aislada de heces humanas
y del medio ambiente. J. Clin. Microbiol. 18 :816-824.

16. Bryan, PJ, RJ Steffan, A. DePaola, JW Foster y AK Bej. 1999. Respuesta adaptativa a temperaturas frías en Vibrio vulnificus . actual
Microbiol. 38 (3): 168-175.
17. Centros para el control de enfermedades. 1998. Brote de infecciones por Vibrio parahaemolyticus asociadas con el consumo de
ostras crudas -- Noroeste del Pacífico, 1997. MMWR 47 (22): 457-462.

18. Centros para el control de enfermedades. 1999. Brote de infección por Vibrio parahaemolyticus asociado con el consumo de ostras y
almejas crudas cosechadas en Long Island Sound, Connecticut, Nueva Jersey y Nueva York, 1998. MMWR 48 (3): 48-51.
19. Colwell, RR, RJ Seidler, J. Kaper, SW Joseph, S. Garges, H. Lockman, D. Maneval, H. Bradford, N. Roberts, E. Remmers, I. Huq y A.
Huq. 1981. Ocurrencia de Vibrio cholerae O1 en los estuarios de Maryland y Louisiana. aplicación Reinar. Microbiol. 41 :555-558.
20. Cook, DW 1997. Refrigeración de moluscos de ostras: Condiciones que minimizan el crecimiento de Vibrio vulnificus . J. Protección
de alimentos. 60 :349-352.
21. Cook, DW y AD Ruple. 1989. Bacterias indicadoras y multiplicación de Vibrionaceae en ostras de marisco poscosecha. J. Alimentos.

Proteger. 52 :343-349. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 42/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

22. Craig, JP, K. Yamamoto, Y. Takeda y T. Miwatani. 1981. Producción de una enterotoxina similar al cólera por una cepa no O1 de
Vibrio cholerae aislada del medio ambiente. Infectar. inmune 34:90-97.

23. Daniels, NA, B. Ray, A. Easton, N. Marano, E. Kahn, AL McShan, L. Del Rosario, T. Baldwin, MA Kingsley, ND Puhr, JG Wells y FJ
Angulo. 2000. Aparición de un nuevo serotipo de Vibrio parahaemolyticus en ostras crudas: un dilema de prevención. JAMA. 284
:1541-1545.
24. Davis, BR, GR Fanning, JM Madden, AG Steigerwalt, HB Bradford Jr., HL Smith Jr. y DJ Brenner. 1981. Caracterización de cepas
bioquímicamente atípicas de Vibrio cholerae y designación de una nueva especie patógena, Vibrio mimicus . J. Clin. Microbiol. 14
:631-639.
25. DePaola, A., LH Hopkins y RM McPhearson. 1988. Evaluación de cuatro métodos para la enumeración de Vibrio parahaemolyticus .
aplicación Reinar. Microbiol. 54 :617-618.
26. DePaola, A., ML Motes y RM McPhearson. 1988. Comparación de los métodos de enriquecimiento APHA y temperatura elevada para
la recuperación de Vibrio cholerae de ostras: Estudio colaborativo. J. Asociado. Apagado. Anal. química 71 :584-589.

27. DePaola, A., LH Hopkins, JT Peeler, B. Wentz y RM McPhearson. 1990. Incidencia de Vibrio parahaemolyticus en aguas costeras y
ostras de EE.UU. aplicación Reinar. Microbiol. 56 :2299-2302.
28. DePaola, A. y GC. Hwang. 1995. Efecto de la dilución, el tiempo de incubación y la temperatura de enriquecimiento en la detección
por cultivo y PCR de Vibrio cholerae obtenido de la ostra Crassostrea virginica . Molec. Celúla. Sondas. 9 :75-81.

29. DePaola, A., ML Motes, DW Cook, J. Veazey, WE Garthright y R. Blodgett. 1997. Evaluación de una sonda de ADN marcada con
fosfatasa alcalina para la enumeración de Vibrio vulnificus en las ostras de la Costa del Golfo. J. Microbiol. metanfetamina 29 :115-
120.
30. Dobosh, D., A. Gómez-Zavaglia y A. Kuljich. 1995. El papel de los alimentos en la transmisión del cólera. Medicina 55 :28-32.

31. Elliot, EL, CA Kaysner, L. Jackson y ML Tamplin. 1995. Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y otras Vibrio spp, pág.
9.01-9.27. En FDA Bacteriological Analytical Manual, 8ª ed. AOAC Internacional, Gaithersburg, MD.
32. Entis, P. y P. Boleszczuk. 1983. Recuento nocturno de Vibrio parahaemolyticus en pescados y mariscos mediante filtración con
membrana de rejilla hidrofóbica. J. Protección de alimentos. 46 :783-786.

33. Agricultor, JJ, III. 1980. Resurgimiento del nombre Vibrio vulnificus . En t. Sistema J. Bacteriol. 30 :656. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 43/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

34. Faruque, SM, MJ Albert, and JJ Mekalanos. 1998. Epidemiología, genética y ecología de Vibrio cholerae toxigénico . Microbiol.
Molec. Biol. Rev. 62 :1301-1314.
35. Fields, PI, T. Popovic, K. Wachsmuth y O. Olsvik. 1992. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa para la detección de cepas
toxigénicas de Vibrio cholerae O1 de la epidemia de cólera en América Latina. J. Clin. Microbiol. 30 :2118-2121.
36. Fujino, T. 1951. Intoxicación alimentaria bacteriana. Saishin Igaku 6 :263-271.

37. Gooch, JA, A. DePaola, CA Kaysner y DL Marshall. 2001. Evaluación de dos métodos directos de siembra usando sondas no
radiactivas para la enumeración de Vibrio parahaemolyticus en ostras. aplicación Reinar. Microbiol. 67 :721-724.
38. Guthrie, RK, CA Makukutu y RW Gibson. 1985. Recuperación de Vibrio cholerae O1 después de calentar y/o enfriar. Higiene de
alimentos lácteos. 5 :427-430.

39. Hansen, W., J. Freney, H. Benyagoub, MN Letouzey, J. Gigi y G. Wauters. 1993. Infecciones humanas severas causadas por Vibrio
metschnikovii . J. Clin. Microbiol. 31 :2529-2530.
40. Hickman, FW, JJ Farmer III, DG Hollis, GR Fanning, AG Steigerwalt, RE Weaver y DJ Brenner. 1982. Identificación de Vibrio
hollisae sp. nov. de pacientes con diarrea. J. Clin. Microbiol. 15 :395-401.
41. Hill, WE, SP Keasler, MW Trucksess, P. Feng, CA Kaysner y KA Lampel. 1991. Identificación por reacción en cadena de la polimerasa
de Vibrio vulnificus en ostras contaminadas artificialmente. aplicación Reinar. Microbiol. 57 :707-711.
42. Hill, WE, AR Datta, P. Feng, KA Lampel y WL Payne. 1995. Identificación de patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos
mediante sondas genéticas, p. 24.01-24.33. Manual analítico bacteriológico de la Administración de Alimentos y Medicamentos, 8ª
ed. AOAC Internacional, Gaithersburg, MD.

43. Hlady, WG, RL Mullen y RS Hopkins. 1993. Vibrio vulnificus de ostras crudas. Causa principal de muertes reportadas por
enfermedades transmitidas por alimentos en Florida. Flor. J.Med. Asoc. 80 :536-538.
44. Hoi, L., I. Dalsgaard y A. Dalsgaard. 1998. Aislamiento mejorado de Vibrio vulnificus del agua de mar y sedimentos con agar
celobiosa-colistina. aplicación Reinar. Microbiol. 64 :1721-1724.

45. Honda, S., I. Goto, I. Minematsu, N. Ikeda, N. Asano, M. Ishibashi, Y. Kinoshita, M. Nishibuchi, T. Honda y T. Miwatani. 1987.
Gastroenteritis por Vibrio parahaemolyticus negativo de Kanagawa . Lanceta I: 331-332.

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 44/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

46. Honda, T., Y. Ni y T. Miwatani. 1988. Purificación y caracterización de una hemolisina producida por un aislado clínico de Vibrio
parahaemolyticus negativo al fenómeno de Kanagawa y relacionado con la hemolisina directa termoestable. Infectar. inmune 56
:961-965.

47. Hugh, R. y JC Feeley. 1972. Informe (1966-1970) del subcomité sobre taxonomía de vibrios al Comité Internacional sobre
Nomenclatura de Bacterias. En t. Sistema J. Bacteriol. 2 :123-126.
48. Hugh, R. y R. Sakazaki. 1972. Número mínimo de caracteres para la identificación de especies de Vibrio , Vibrio cholerae y Vibrio
parahaemolyticus . Laboratorio de Salud Pública. 30 :133-137.
49. Iida, T., KS. Park, O. Suthienkul, J. Kozawa, Y. Yamaichi, K. Yamamoto y T. Honda. 1998. Proximidad cercana de los genes tdh, trh y
ure en el cromosoma de Vibrio parahaemolyticus . Microbiología 144 :2517-2523.
50. Jackson, H. 1974. Relaciones de temperatura de Vibrio parahaemolyticus . En T. Fujino, G. Sakaguchi, R. Sakazaki y Y. Takeda
(eds.), Simposio internacional sobre Vibrio parahaemolyticus . Editorial Saikon. págs. 139-146.
51. Ji, SP 1989. El primer aislamiento de Vibrio alginolyticus de muestras que causaron intoxicación alimentaria. Mentón. J. Prevenir.
Medicina. 23 :71-73.
52. Kaneko, T. y RR Colwell. 1973. Ecología de Vibrio parahaemolyticus en la bahía de Chesapeake. J. Bacteriol. 113 :24-32.
53. Kaper, J., H. Lockman, RR Colwell y SW Joseph. 1979. Ecología, serología y producción de enterotoxinas de Vibrio cholerae en la
bahía de Chesapeake. aplicación Reinar. Microbiol. 37 :91-103.

54. Kaper, JB, JG Morris Jr. y MM Levine. 1995. Cólera. clin. Microbiol. Apocalipsis 8 :48-86.
55. Karaolis, DK, JA Johnson, CC Bailey, EC Boedeker, JB Kaper y PR Reeves. 1998. Una isla de patogenicidad de Vibrio cholerae
asociada con cepas epidémicas y pandémicas. proc. nacional Academia ciencia EE.UU. 95 (6):3134-3139.
56. Kato, T., Y. Obara, H. Ichinoe, K. Nagashima, A. Akiuama, K. Takitawa, A. Matsuchima, S. Yamai e Y. Miyamoto. 1965. Agrupación
de Vibrio parahaemolyticus con una reacción de hemólisis. Shokuhin Eisae Kankyu 15 :83-86.

57. Kaysner, CA 2000. Especies de Vibrio . En BM Lund, AD Baird-Parker y GW Gould (eds.), The Microbiological Safety and Quality of
Food. vol. II. Capítulo 48. Editores de Aspen, Gaithersburg, MD. pp1336-1362
58. Kaysner, CA y WE Hill. 1994. Toxigenic Vibrio cholerae O1 en alimentos y agua, p. 27-39. En IK Wachsmuth, PA Blake y O. Olsvik

(eds.), Vibrio cholerae and Cholera: New Perspectives on a Resurgent Disease. ASM Press, Washington, DC. Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 45/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

59. Kaysner, CA, SD Weagant y WE Hill. 1988. Modificación de la técnica de hibridación de colonias de ADN para análisis de filtros
múltiples. Molec. Celúla. Sondas 2 :255-260.

60. Kaysner, CA, CA Abeyta, Jr., MM Wekell, A. DePaola, Jr., RF Stott y JM Leitch. 1987. Cepas virulentas de Vibrio vulnificus aisladas
de estuarios de la costa oeste de EE.UU. aplicación Reinar. Microbiol. 53 :1349-1351.
61. Kaysner, CA, C. Abeyta Jr., KC Jinneman y WE Hill. 1994. Enumeración y diferenciación de Vibrio parahaemolyticus y Vibrio
vulnificus por hibridación de colonias de ADN-ADN usando la técnica de filtración de membrana de rejilla hidrofóbica para el
aislamiento. J. Protección de alimentos. 57 :163-165.
62. Kaysner, CA, C. Abeyta Jr., P. Trost, JH Wetherington, KC Jinneman, WE Hill y MM Wekell. 1994. La hidrólisis de urea puede
predecir la patogenicidad potencial de cepas de Vibrio parahaemolyticus aisladas en el noroeste del Pacífico. aplicación Reinar.
Microbiol. 60 :3020-3022.
63. Kim, JJ, KJ Yoon, HS Yoon, Y. Chong, SY Lee, CY Chon e IS Park. 1986. Vibrio vulnificus septicemia: Informe de cuatro casos.
Yonsei Med. J. 27 :307-313.
64. Klontz, KC, L. Williams, LM Baldy y M. Campos. 1993. Infecciones por Vibrio asociadas con ostras crudas : vinculación de datos
epidemiológicos con pruebas de laboratorio de ostras obtenidas de un punto de venta minorista. j _ Protección de alimentos. 56
:977-979.

65. Kobayashi, T., S. Enomoto y R. Sakazaki. 1963. Un nuevo medio de aislamiento selectivo para el grupo vibrio en medio de Nakanishi
modificado (agar TCBS). Jpn. J. Bacteriol. 18 :387-392.
66. Kobayashi, K., K. Seto, S. Akasaka y M. Makino. 1990. Detección de Vibrio cholerae O1 toxigénico mediante la reacción en cadena de
la polimerasa para amplificar el gen de la enterotoxina del cólera. Kansenshogaku Zasshi 64 :1323-1329.

67. Koch, WH, WL Payne y TA Cebula. 1995. Detección de Vibrio cholerae enterotoxigénico en alimentos por la reacción en cadena de la
polimerasa, p. 28.01-28.09. En FDA Bacteriological Analytical Manual, 8ª ed. AOAC Internacional, Gaithersburg.
68. Landry, WL 1994. Identificación de Vibrio vulnificus por composición de ácidos grasos celulares utilizando el sistema de
identificación microbiana Hewlett-Packard 5898A: estudio colaborativo. JAOAC Int. 77 :1492-1499.
69. Lee, C., LH. Chen, ML. Liu y YC. Su. 1992. Uso de una sonda de oligonucleótidos para detectar Vibrio parahaemolyticus en ostras
contaminadas artificialmente. aplicación Reinar. Microbiol. 58 :3419-3422. 
Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 46/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

70. Lee, JV, TJ Donovan y AL Furniss. 1978. Caracterización, taxonomía y descripción modificada de Vibrio metschnikovii . En t. J. Sys.
Bacteriol. 28 :99-111.
71. Lee, JV, P. Shread, AL Furniss y TN Bryant. 1981. Taxonomía y descripción de Vibrio fluvialis sp. nov. (sinónimo Grupo F Vibrios,
Grupo EF6). Aplicación J. Bacteriol. 50 :73-94.

72. Levine, WC y PM Griffin. 1993. Infecciones por Vibrio en la Costa del Golfo: resultados del primer año de vigilancia regional y el
Grupo de Trabajo de Vibrio de la Costa del Golfo. J. infectar. Dis. 167 :479-483.
73. Madden, JM, WP Nematollahi, WE Hill, BA McCardell y RM Twedt. 1981. Virulencia de tres aislados clínicos del serogrupo no O-1
de Vibrio cholerae en infecciones entéricas experimentales en conejos. Infectar. inmune 33 :616-619.
74. Matsumoto, C., J. Okuda, M. Ishibashi, M. Iwanaga, P. Garg, T. Rammamurthy, HC. Wong, A. DePaola, YB Kim, MJ Albert y M.
Nishibuchi. 2000. Propagación pandémica de un clon O3:K6 de Vibrio parahaemolyticus y aparición de cepas relacionadas
evidenciadas por análisis de secuencias de PCR y toxRS cebados arbitrariamente. J. Clin. Microbiol. 38 :578-585.
75. McCardell, BA, JM Madden y DB Shah. 1985. Aislamiento y caracterización de una citolisina producida por Vibrio cholerae
serogrupo no-O1. Poder. J. Microbiol. 31 :711-720.

76. McCarthy, SA, A. DePaola, DW Cook, CA Kaysner y WE Hill. 1999. Evaluación de sondas marcadas con fosfatasa alcalina y
digoxigenina para la detección del gen de hemolisina termolábil ( tlh ) de Vibrio parahaemolyticus . Letón. aplicación Microbiol. 28
:66-70.
77. McCarthy, SA, A. DePaola, CA Kaysner, WE Hill y DW Cook. 2000. Evaluación de métodos de hibridación de ADN no isotópicos
para la detección del gen tdh de Vibrio parahaemolyticus . J. Protección de alimentos. 63 :1660-1664.

78. McLaughlin, JC 1995. Vibrio , p. 465-474. En PR Murray, EJ Baron, MA Pfaller, FC Tenover y RH Yolken (eds.), Manual of Clinical
Microbiology, 6.ª ed. ASM Press, Washington.
79. McPherson, VL, JA Watts, LM Simpson y JD Oliver. 1991. Efectos fisiológicos del lipopolisacárido de Vibrio vulnificus en ratones y
ratas. Microbios 67 :141-149.

80. Mintz, ED, T. Popovic y PA Blake. 1994. Transmisión de Vibrio cholerae O1. En IK Wachsmuth, PA Blake y O. Olsvik (eds.), Vibrio
cholerae y el cólera: Molecular a perspectivas globales. Prensa ASM, Washington, DC.

81. Miwatani, T. e Y. Takeda. 1976. Vibrio parahaemolyticus : Una bacteria causante de intoxicación alimentaria. Saikon Publishing Co.,
Arriba ()
Ltd., Tokio.
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 47/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

82. Miyamoto, Y., T. Kato, Y. Obara, S. Akiyama, K. Takizawa y S. Yamai. 1969. Características hemolíticas in vitro de Vibrio
parahaemolyticus : su estrecha correlación con la patogenicidad humana. J. Bacteriol. 100 :1147-1149.

83. Morris, JG, Jr. 1994. Cepas de Vibrio cholerae del grupo no O1 no asociadas con enfermedades epidémicas. En IK Wachsmuth, PA
Blake y O. Olsvik (eds.), Vibrio cholerae y el cólera: Molecular a perspectivas globales. ASM Press, Washington.
84. Mouzin, E., L. Mascola, MP Tormey y DE Dassey. 1997. Prevención de infecciones por Vibrio vulnificus : evaluación de estrategias
educativas regulatorias. JAMA 278 :576-578.
85. Newman, C., M. Shepherd, MD Woodard, AK Chopra y SK Tyring. 1993. Septicemia fatal y ampollas causadas por Vibrio cholerae
no O1 . Mermelada. Academia Dermatol. 29 :909-912.
86. Nishibuchi, M. y JB Kaper. 1985. Secuencia de nucleótidos del gen de la hemolisina directa termoestable de Vibrio
parahaemolyticus . J. Bacteriol. 162 :558-564.
87. Nishibuchi, M., WE Hill, G. Zon, WL Payne y JB Kaper. 1986. Sondas sintéticas de oligodesoxirribonucleótidos para detectar Vibrio
parahaemolyticus positivo al fenómeno de Kanagawa . J. Clin. Microbiol. 23 :1091-1095.
88. Nolan, CM, J. Ballard, CA Kaysner, J. Lilja, LB Williams y FC Tenover. 1984. Gastroenteritis por Vibrio parahaemolyticus : un brote
asociado con ostras crudas en el noroeste del Pacífico. Diagnóstico Microbiol. Infectar. Dis. 2 :119-128.
89. Okabe, S. 1974. Revisión estadística de intoxicaciones alimentarias en Japón, especialmente por Vibrio parahaemolyticus . En T.
Fujino, G. Sakaguchi, R. Sakazaki y Y. Takeda (eds.), Simposio internacional sobre Vibrio parahaemolyticus . Saikon Publishing Co.,
Ltd., Tokio. págs. 5-8.
90. Oliver, JD 1989. Vibrio vulnificus , p. 569-600. En MP Doyle (ed.), Patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos. Marcel
Dekker, Inc., Nueva York.
91. Osawa, R., T. Okitsu, H. Morozumi y S. Yamai. 1996. Ocurrencia de Vibrio parahaemolyticus ureasa-positivo en Kanagawa, Japón
con referencia específica a la presencia de hemolisina directa termoestable (TDH) y genes de hemolisina relacionados con TDH.
aplicación Reinar. Microbiol. 62 :725-727.
92. Overman, TL, JF Kessler y JP Seabolt. 1985. Comparación de API20E, API Rapid E ​y API Rapid NFT para la identificación de
miembros de la familia Vibrionaceae . J. Clin. Microbiol. 22 :778-781.

93. Pal, A., T. Ramamurthy, RK Bhadra, T. Takeda, T. Shimada, Y. Takeda, GB Nair, SC Pal y S. Chakrabarti. 1992. Reevaluación de la
Arriba ()
prevalencia de enterotoxina estable al calor (NAG-ST) entre cepas no O1 de Vibrio cholerae ambientales aisladas de Calcuta, India,
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 48/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

mediante el uso de una sonda de ADN NAG-ST. aplicación Reinar. Microbiol. 58 :2485-2489.

94. Popovic, T., Ø. Olsvik, PA Blake y K. Wachsmuth. 1993. Cólera en las Américas: Aspectos transmitidos por los alimentos. J.
Protección de alimentos. 56 :811-821.
95. Reily, LA y CR Hackney. 1985. Supervivencia de Vibrio cholerae durante el almacenamiento en frío en mariscos contaminados
artificialmente. J. ciencia de los alimentos. 50 :838-839.

96. Rippey, S. R. 1994. Infectious diseases associated with molluscan shellfish consumption. Clin. Microbiol. Rev. 7:419-425.
97. Roche Diagnostics Corp. (formerly Boehringer Mannheim Corp.) 1992. The Genius™ System User's Guide for Filter Hybridization.
Version 2. Indianapolis, IN. 79 pages
98. Sack, D. A., and R. B. Sack. 1975. Test for enterotoxigenic Escherichia coli using Y-1 adrenal cells in miniculture. Infect. Immun.
11:334-336.
99. Safrin, S., J. G. Morris Jr., M. Adams, V. Pons, R. Jacobs, and J. E. Conte Jr. 1988. Non O1 Vibrio cholerae bacteremia: Case report
and review. Rev. Infect. Dis. 10:1012-1017.
100. Said, B., S. M. Scotland, and B. Rowe. 1994. The use of gene probes, immunoassays and tissue culture for the detection of toxin in
Vibrio cholerae non-O1. J. Med. Microbiol. 40:31-36.

101. Sakazaki, R., S. Iwanami, and H. Fukumi. 1963. Studies on the enteropathogenic, facultatively halophilic bacteria, Vibrio
parahaemolyticus. I. Morphological, cultural and biochemical properties and its taxonomic position. Jpn. J. Med. Sci. Biol. 16:161-
188.
102. Sakazaki, R., and T. Shimada. 1986. Vibrio species as causative agents of food-borne infection. In R. K. Robinson, ed., Developments
in Food Microbiology. 2nd. Ed. Elsevier Applied Science Publishers, New York, NY.
103. Shandera, W. X., J. M. Johnston, B. R. Davis, and P. A. Blake. 1983. Disease from infection with Vibrio mimicus, a newly recognized
Vibrio species. Ann. Intern. Med. 99:169-173.
104. Shapiro, R. L., S. Altekruse, L. Hutwagner, R. Bishop, R. Hammond, S. Wilson, B. Ray, S. Thompson, R. V. Tauxe, P. M. Griffin, and
the Vibrio Working Group. 1998. The role of Gulf Coast oysters harvested in warmer months in Vibrio vulnificus infections in the
United States, 1988-1996. J. Infect. Dis. 178:752-759.

Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 49/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

105. Sharma, C., M. Thungapathra, A. Ghosh, A. K. Mukhopadhyay, A. Basu, R. Mitra, I. Basu, S. K. Bhattacharaya, T. Shimada, T.
Ramamurthy, T. Takeda, S. Yamasaki, Y. Takeda, and G. B. Nair. 1998. Molecular analysis of non-O1 non-O139 Vibrio cholerae
associated with an unusual upsurge in the incidence of cholera-like disease in Calcutta, India. J. Clin. Microbiol. 36:756-763.

106. Shirai, H., H. Ito, T. Hirayama, Y. Nakamoto, N. Nakabayashi, K. Kumagai, Y. Takeda, and M. Nishibuchi. 1990. Molecular
epidemiologic evidence for association of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin of Vibrio
parahaemolyticus with gastroenteritis. Infect. Immun. 58:3568-3573.
107. Shirai, H., M. Nishibuchi, T. Ramamurthy, S. K. Bhattacharya, S. C. Pal, and Y. Takeda. 1991. Polymerase chain reaction for
detection of the cholera enterotoxin operon of Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 29:2517-2521.

108. Simpson, L. M., V. K. White, S. F. Zane, and J. D. Oliver. 1987. Correlation between virulence and colony morphology in Vibrio
vulnificus. Infect. Immun. 55:269-272.
109. Skangkuan, Y. H., Y. S. Show, and T. M. Wang. 1995. Multiplex polymerase chain reaction to detect toxigenic Vibrio cholerae and to
biotype Vibrio cholerae O1. J. Appl. Bacteriol. 79:264-273.

110. Smith Jr., H. L. 1970. A presumptive test for vibrios: The "string" test. Bull. W.H.O. 42:817-819.
111. Spira, W. M., and P. J. Fedorka-Cray. 1984. Purification of enterotoxins from Vibrio mimicus that appear to be identical to cholera
toxin. Infect. Immun. 45:679-684.
112. Spira, W. M., R. Sack, and J. L. Froehlich. 1981. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli
diarrhea. Infect. Immun. 32:739-743.

113. Stelma, G. N., Jr., A. L. Reyes, J. T. Peeler, C. H. Johnson, and P. L. Spaulding. 1992. Virulence characteristics of clinical and
environmental isolates of Vibrio vulnificus. Appl. Environ. Microbiol. 58:2776-2782.
114. Suthienkul, O., M. Ishibashi, T. Iida, N. Nettip, S. Supavej, B. Eampokalap, M. Makino, and T. Honda. 1995. Urease production
correlates with possession of the trh gene in Vibrio parahaemolyticus strains isolated in Thailand. J. Infect. Dis. 172:1405-1408.

115. Suzuki, N., Y. Ueda, H. Mori, K. Miyagi, K. Noda, H. Horise, Y. Oosumi, M. Ishibashi, M. Yoh, K. Yamamoto, and T. Honda. 1994.
Serotypes of urease producing Vibrio parahaemolyticus and their relation to possession of tdh and trh genes. Jpn. J. Infect. Dis.
68:1068-1077.

116. Swerdlow, D. L., E. D. Mintz, M. Rodriguez, E. Tejada, C. Ocampo, L. Espejo, K. D. Greene, W. Saldana, L. Seminario, R. V. Tauxe, J.
Arriba ()
G. Wells, N. H. Bean, A. A. Ries, M. Pollack, B. Vertiz, and P. A. Blake. 1992. Waterborne transmission of epidemic cholera in
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 50/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

Trujillo, Peru: Lessons for a continent at risk. Lancet 340:28-32.

117. Swerdlow, D. L., and A. A. Ries. 1993. Vibrio cholerae Non-O1 - the eighth pandemic? Lancet 342:382-383.
118. Tacket, C. O., F. Brenner, and P. A. Blake. 1984. Clinical features and an epidemiological study of Vibrio vulnificus infections. J.
Infect. Dis. 149:558-561.
119. Tada, J., T. Ohashi, N. Nishimura, Y. Shirasaki, H. Ozaki, S. Fukushima, J. Takano, M. Nishibuchi, and Y. Takeda. 1992. Detection of
the thermostable direct hemolysin gene (tdh) and the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrio
parahaemolyticus by polymerase chain reaction. Molec. Cell. Probes 6:477-487.
120. Takeda, Y. 1983. Thermostable direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus. Pharmac. Ther. 19:123-146.
121. Takeda, Y., T. Peina, A. Ogawa, S. Dohi, H. Abe, G. B. Nair, and S. C. Pal. 1991. Detection of heat-stable enterotoxin in a cholera toxin
gene-positive strain of Vibrio cholerae O1. FEMS Microbiol. Lett. 80:23-28.

122. Tamplin, M. L. 1992. The seasonal occurrence of Vibrio vulnificus in shellfish, seawater and sediment of United States coastal waters
and the influence of environmental factors on survival and virulence, 87 pp. In Final Report. Saltonstall-Kennedy Program. National
Marine Fisheries Service, Washington, D.C.
123. Taniguchi, H., H. Hirano, S. Kubomura, K. Higashi, and Y. Mizuguchi. 1986. Comparison of the nucleotide sequences of the genes for
the thermolabile hemolysin from Vibrio parahaemolyticus. Microb. Pathogenesis. 1:425-432.

124. Tison, D. L., and M. T. Kelly. 1986. Virulence of Vibrio vulnificus strains from marine environments. Appl. Environ. Microbiol.
51:1004-1006.
125. Varela, P., M. Rivas, N. Binsztein, M. L. Cremona, P. Herrmann, O. Burrone, R. A. Ugalde, and A.C. C. Frasch. 1993. Identification of
toxigenic Vibrio cholerae from the Argentine outbreak by PCR for ctxA1 and ctxA2-B. FEBS Lett. 315:74-76.

126. Wachsmuth, I. K., P. A. Blake, and O. Olsvik. (eds.) 1994. Vibrio cholerae and cholera: Molecular to Global Perspectives. ASM Press,
Washington, DC.
127. Wachsmuth, K., O. Olsvik, G. M. Evins, and T. Popovic. 1994. Molecular epidemiology of cholera, p. 357-370. In I. K. Wachsmuth, P.
A. Blake, and O. Olsvik (eds.), Vibrio cholerae and Cholera: Molecular to Global Perspectives. ASM Press, Washington.

128. Wagatsuma, S. 1968. On a medium for hemolytic reaction of Vibrio parahaemolyticus. Media Circ. 13:159-162. 
Arriba ()
129. Warnock, I. I. I., EW, and T. L. MacMath. 1993. Primary Vibrio vulnificus septicemia. J. Emerg. Med. 11:153-156.

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 51/52
22/6/23, 17:47 BAM Capítulo 9: Vibrio | FDA

130. Weber, J. T., E. D. Mintz, R. Canizares, A. Semiglia, I. Gomez, R. Sempertegui, A. D'avila, K. D. Greene, N. D. Puhr, D. N. Cameron,
F. C. Tenover, T. J. Barrett, N. H. Bean, C. Ivey, R. V. Tauxe, and P. A. Blake. 1994. Epidemic cholera in Ecuador: Multidrug-
resistance and transmission by water and seafood. Epidemiol. Infect. 112:1-11.
131. West, P. A., P. R. Brayton, T. N. Bryant, and R. R. Colwell. 1986. Numerical taxonomy of vibrios isolated from aquatic environments.
Int. J. Syst. Bacteriol. 36:531-543.
132. Wright, A. C., L. M. Simpson, and J. D. Oliver. 1981. Role of iron in the pathogenesis of Vibrio vulnificus infections. Infect. Immun.
34:503-507.
133. Wright, A. C., Y. Guo, J. A. Johnson, J. P. Nataro, and J. G. Morris Jr. 1992. Development and testing of a nonradioactive DNA
oligonucleotide probe that is specific for Vibrio cholerae cholera toxin. J. Clin. Microbiol. 30:2302-2306.

134. Wright, A. C., G. A. Miceli, W. L. Landry, J. B. Christy, W. D. Watkins, and J. G. Morris Jr. 1993. Rapid identification of Vibrio
vulnificus on nonselective media with an alkaline phosphatase-labeled oligonucleotide probe. Appl. Environ. Microbiol. 59:541-546.
135. Wong, HC, S.H. Liu, T.K. Wang, C.L. Lee, C.S. Chiou, D.P. Liu, M. Nishibuchi, and B.K. Lee. 2000. Characteristics of Vibrio
parahaemolyticus O3:K6 from Asia. Appl. Environ. Microbiol. 66:3981-3986.

136. Yamamoto, K., T. Honda, T. Miwatani, S. Tamatsukuri, and S. Shibata. 1992. Enzyme-labeled oligonucleotide probes for detection of
the genes for thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) of Vibrio parahaemolyticus. Can. J.
Microbiol. 38:410-416.
137. Yoh, M., K. Miyagi, Y. Matsumoto, K. Hayashi, Y. Takarada, K. Yamamoto, and T. Honda. 1993. Development of an enzyme-labeled
oligonucleotide probe for the cholera toxin gene. J. Clin. Microbiol. 31:1312-1314.

Fuente de hipertexto: Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus y otras Vibrio spp., Manual Analítico Bacteriológico, 8ª Edición,
Revisión A, 1998.


Arriba ()

https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-9-vibrio 52/52