Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de ciencias biológicas

Escuela profesional de

Microbiología y Parasitología

PRACTICA N° 4:

Amplificación del ADN mediante PCR

DOCENTE:

Giovanna Elizabeth Sotil Caycho

ALUMNOS:

Emmanuel Oscar Albines Seclen - 21100171

Miguel Angel Espinoza Champi - 21100139

Elias Lizarraga Condorhuacho - 21100142

Tiago Aron Chaparro Mayhua - 18100139

ASIGNATURA:

Biología Molecular

Abril del 2023

 I. INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica molecular

ampliamente usada y se caracteriza por la especificidad y sensibilidad. Esta
técnica consiste en una replicación exponencial in vitro de una molécula de
ADN (Rodríguez, 2016). La cual se basa en el mismo principio de la replicación
donde se usa la ADN polimerasa para sintetizar una cadena complementaria de
ADN en la dirección 5'-3'. Se utilizan dos primers de 20-25 pares de bases cada
uno, que son complementarios a las cadenas en los extremos de la región del
ADN. Estos primers se colocarán una vez que el ADN se haya desnaturalizado
por calor y guiarán la síntesis del ADN hacia el otro primer (Pérez de Castro,
2011). Este proceso consta de ciclos repetitivos, así como 3 temperaturas. En
cada ciclo, el cual incluye tres pasos consecutivos, se obtiene ADN duplicado.
En el primer paso, se desnaturaliza el ADN a una temperatura de 92-95°C, lo
que provoca la separación de las cadenas del ADN. En el segundo paso, se
produce el anillamiento de los primers a una temperatura de 50-70°C, donde se
ubican los amplímeros en el ADN molde por complementariedad. En el tercer
paso, se lleva a cabo la elongación con una temperatura de 70-75°C, en la cual
la DNA polimerasa sintetiza la cadena de ADN. Los requisitos para llevar a
cabo esta reacción son simples y consisten en desoxinucleótidos para proveer
energía y nucleósidos para la síntesis de ADN, ADNpolimerasa, primers, ADN
molde y un buffer que contenga magnesio. Para lograr la amplificación selectiva
es necesario obtener información sobre la secuencia de ADN y diseñar dos
primers que sean específicas para la secuencia de ADN a amplificar (Rodríguez,
2016).

II. MATERIALES Y MÉTODOS

Para realizar la reacción en cadena de la polimerasa, se debe preparar primero el

máster mix, que está compuesto por una serie de elementos como buffer
loxPCR, primers Forward y Reverse, dNTPs, agua y hot star taq ADN
polimerasa en cantidades específicas. Una vez que se ha completado el master
mix, se agrega una muestra de ADN vegetal, animal y una mezcla de estas.
Después, se coloca en el termociclador con los tubos que ya han sido preparados
para la PCR, incluyendo un control negativo. Las temperaturas adecuadas se
eligen para que la PCR pueda completarse en aproximadamente una hora y
media.

III. PROCEDIMIENTO 1

La calidad y cantidad de ADN extraído es fundamental para la amplificación

exitosa de una región por PCR. El ADN debe estar lo más puro posible, sin
contaminación de proteínas, ARN, polisacáridos, sales, etc. La cantidad óptima
de ADN puede variar dependiendo del tipo de muestra y del protocolo de
amplificación utilizado, y debe ser suficiente para la amplificación de la región
de interés. Además, el ADN debe estar íntegro y sin degradación, ya que el
ADN degradado puede afectar la eficiencia y la especificidad de la
amplificación y provocar resultados falsos. Es importante eliminar inhibidores
químicos o biológicos que pueden estar presentes en la muestra, ya que pueden
interferir con la reacción de PCR. Por último, la extracción de ADN debe ser
específica para el tipo de muestra de interés, para evitar la presencia de ADN de
otras especies o tejidos dentro de una misma especie que puedan interferir con
la amplificación específica de la región de interés. En conjunto, estas
características son importantes a considerar durante la extracción de ADN para
obtener resultados precisos y confiables.

IV. PROCEDIMIENTO 2

a. Identificación de región a amplificar y primers (emanuel)

Tabla 2.
Datos de región a amplificar y cebadores
¿Qué región del ADN amplificarán los primers?

COI
¿Cuál es el tamaño esperado (pb) del amplificado?

750 pb
Tipo de primers (universales, específicos, degenerados, etc)

Usaremos Universales
Indique los nombres de los primers a utilizar ™ (°C)
Forward
Reverse

- Según los primers seleccionados, lea y explique el artículo donde los

describen.

En este PCR se usó primers universales que son aquellos que se pegan a la
región altamente conservada del gen, lo que permite su uso en una gama alta y
variable de identificación de bacterias pero tiene una desventaja cuando se
quiere saber de una especie en específico

- ¿Cómo se sabe el tamaño a amplificar?

Se sabe gracias a los primers (con un tamaño de 18-24pb) y la cantidad de ellos

, que va a la par con la cantidad de bases nitrogenadas y en nuestro caso de ha
usado un tamaño de 750 pb

- ¿Qué características debe tener un set de primers (F y R) para utilizarlos

juntos en una reacción de PCR?
Se utilizan en pareja: uno para polimerizar la hebra + (forward) y otro para la
hebra (reverse). Al diseñarlos debe procurarse que se hibriden a la misma
temperatura al ADN molde (normalmente unos 60º) y debe evitarse que puedan
hibridar entre ellos.

- Describir el tipo de primers (universales, específicos, etc) con el cuál

realizará la reacción, y explicar sus ventajas y/o desventajas,
consideraciones particulares (temperatura de annealing, especificidad,
utilidad, etc.)

El que usamos fue el universal que como ventaja es que se puede usar para una
gran variedad de bacterias, y como desventaja es que si queremos aislar una
especie única nos va a dificultar mucho , ahí se haría uso de primers específicos.

- Investigue y explique en qué ocasiones (y ventajas) se realizan

reacciones de PCR considerando en la mezcla más de 1 set de primers.

En ocasiones de que sea grande la concentración de ADN y se necesite una

mezcla entre set de primers.

b. Ciclo de PCR

Tabla 3
Condiciones de PCR considerando la enzima, la región a amplificar
utilizando los cebadores designados.
Kit de PCR: Hot star PCR Master Mix
Enzima DNA Polimerasa: Hot star taq DNA polimerasa
Región a amplificar: COI
Cebadores: Forward: Reverse:
ETAPA Número de ciclos T(°C)x tiempo(min o s)
1. Predenaturacion 1X 95°C x 2min
2. Denaturación 30X 90°C x 30seg
 3. Hibridación 30X 45°C x 50 seg
4. Extensión 30X 72°C x 50 seg
5. Extensión final 1X 72°C x 5min

- Al determinar la Tm (temperatura de melting), ¿ambos primers

presentan ™ similares? Sea afirmativa o negativa la respuesta, explique
cuál es la ventaja y/o desventaja de ésto.

La temperatura de melting esta depende de la composición de los primers,

dado que la secuencia inicial y final del gen de interés es diferente la
composición de los primers también lo son, en consecuencia la
temperatura será diferente, pero por lo general esta variación no debe
superar los 5ºC, para evitar una amplificación desequilibrada y asimétrica
de los fragmentos de ADN deseados. Esto puede dar lugar a una menor
cantidad de productos de amplificación, así como a una mayor cantidad
de productos secundarios no deseados.

- Explicar, según referencias que encuentre, cuáles son las aplicaciones en

investigación de la región designada a amplificar
En la presente práctica se amplificó la secuencia del gen COI mitocondrial,
presente en animales. En la actualidad, el proyecto "Barcode of life" tiene como
objetivo crear una biblioteca de referencia para la vida, mediante el uso del gen
Citocromo Oxidasa I (COI) como método para identificar de manera rápida y
económica especies animales. Una gran ventaja de este método es que solo se
requiere una pequeña muestra del espécimen, por lo que no es necesario
sacrificar al individuo para su identificación (Angélica, 2018). En otro trabajo se
secuenció un fragmento de 451pb del gen mitocondrial de la citocromo oxidasa
I (COI) en 62 secuencias del género Spodoptera y una secuencia de Bombix
mori (grupo externo) para estimar la diferenciación genética (distancia K2)
entre los haplotipos de Spodoptera frugiperda de Colombia y Estados Unidos,
asimismo los resultados demuestran que la secuenciación de este gen permite
diferenciar los estadios larvales (Saldamando, 2012).
c. Preparación del master mix (Miguel)

Tabla 4.
Componentes para preparar el master mix PCR, utilizando la enzima ADN
Polimerasa del kit asignado.

Componente Concentración Concentració µ𝐿 para 1 µ𝐿 para total

inicial n final reacción de reacciones

1. 𝐻2𝑂 NFW (necesario hasta - - 2.9 µ𝐿 14.5 µ𝐿

completar 20 µ𝐿)

2. Buffer PCR 2x 1x 7.5 µ𝐿 37.5 µ𝐿

3. Primer Forward 10 µ𝑀 0.2 µ𝑀 0.3µ𝑙 1.5 µ𝑙

4. Primer Reverse 10 µ𝑀 0.2 µ𝑀 0.3 µ𝑙 1.5 µ𝑙

5. dNTPs

6. PCR Enhancer 5X 1X 3 µ𝐿 15 µ𝐿

7. DNA Polimerasa

8. DNA molde 50 ng/µ𝑙 3.3 mg/µ𝑙 1 µ𝑙 5 µ𝑙

TOTAL volumen de cocktail de reacción 15 µ𝑙 75 µ𝑙

- Justificar por qué estableció esos protocolos (para cada variable)

Concentración Inicial.- Dicho protocolo es importante para tener en cuenta la
cantidad inicial de los componentes (cantidad o proporción) que se encuentran
en el kit para preparar la master Mix PCR, además de anotar la cantidad de
ADN molde que se va a emplear (ng/µ𝐿).
Concentración Final.- El protocolo se usa para poder hallar la concentración
final de los componentes de la master mix, de acuerdo a la cantidad de ADN
molde que se ha empleado. En tanto la concentración de este, se halla de
acuerdo al volumen del cóctel de reacción que se va a preparar.
µ𝐿 para 1 reacción.- Dicho protocolo tiene como finalidad hallar el volumen de
cada componente para preparar el cóctel de reacción. Esto se ve influido acorde
al volumen total del cocktail que se desea obtener en general, la cantidad de
ADN molde que se va a implementar y las proporciones entre una sustancia y
otra.
µ𝐿 para 1 reacción.- De acuerdo a la cantidad de reacciones que se va a
realizar, es importante obtener la cantidad total de cada componente que se va a
implementar en el proceso, con excepción del volumen del ADN molde.

- Discutir las condiciones establecidas en cada mesa de trabajo vs las

utilizadas en clase.

Nuestra mesa de trabajo: En nuestra reacción, hemos incluido un componente

llamado PCR Enhancer, que se implementa 3 µ𝐿 para cada reacción y la
concentración de 𝐻2𝑂 NFW de 2.9 µ𝐿.

Mesa de trabajo 3 : En sus reacciones no están incluyendo el PCR Enhancer y la

cantidad de 𝐻2𝑂 NFW de 5.9 µ𝐿. El volumen de cocktail y otros componentes
del kit de PCR son las mismas que la del nuestro grupo.

- Explicar las ventajas y desventajas, aplicaciones, de la DNA polimerasa

asignada para el ejercicio (según literatura)

Ventajas Desventajas
➢ Permite generar copias de ➢ Para que funcione
ADN a través de la hebra. correctamente, requiere que
➢ Actúa sobre el complejo la temperatura esté a los 72
templado-primers y °C.
comienza su función ➢ Las condiciones del pH
catalítica a mayot velocidad. deben ser las adecuadas
➢ La incorporación de para que no involucre en su
nucleótidos se realiza de desempeño e integridad.
forma completa a partir del ➢ El desempeño del ADN
extremo 3’. Polimerasa depende de la
concentración de magnesio
que hay en la reacción.

- Investigue cómo podría identificar de forma específica la presencia

de:
 De las muestras que se tienen presente, para poder identificar a través del
ADN, debemos de tener en cuenta los siguientes detalles:
(a) A. purpuratus
(b) P. sativum
(c) Bacterias patógenas
a partir de la mezcla de muestras de ADN de tejido animal y vegetal
preparada.

Desarrollo:
(a) A. purpuratus
La clave para poder identificar es lograr encontrar la secuencia del ADN
vinculado al citocromo oxidasa (COI), componente vital para los
animales.

(b) P. sativum
En P. sativum, podemos encontrar mitocondrias que pueden ser
encontradas en la PCR. Sin embargo, para identificarlo, se debe encontrar
hebras de ADN vinculadas al ADN del cloroplasto.

(c) Bacterias patógenas

Se debe diseñar cebadores que sean específicos para un gen presente en la
mayor parte de las bacterias. Es el caso del gen 16s rRNA. Si se logra
amplificar este gen y se logra obtener el producto en el PCR, habrá
presencia de ADN bacteriano en la muestra.

V. CUESTIONARIO (tiago)

1. Defina y mencione qué parámetros son necesarios en una PCR para

lograr la máxima (justificando sus respuestas con referencias):
*referencias en la bibliografía.
a. Especificidad: La especificidad se refiere a la capacidad de la PCR para
amplificar específicamente el fragmento de ADN de interés sin amplificar
otros fragmentos no deseados. Los parámetros que influyen en la
especificidad son: la temperatura de hibridación de los cebadores, la
longitud y secuencia de los cebadores, la temperatura de extensión y la
concentración de MgCl2. Para lograr la máxima especificidad, se deben
utilizar cebadores específicos que se unan solo al fragmento de ADN de
interés y no a otros fragmentos, y ajustar la temperatura de hibridación
para permitir que se unan específicamente. Además, se deben evitar la
formación de dúplex inespecíficos ajustando la temperatura de extensión
y la concentración de MgCl2 adecuadas.

b. Fidelidad: La fidelidad se refiere a la capacidad de la PCR para replicar

fielmente el fragmento de ADN de interés sin introducir errores o
mutaciones durante la amplificación. Los parámetros que influyen en la
fidelidad son: la actividad de la enzima polimerasa, la temperatura de
extensión, la concentración de dNTPs y la calidad del ADN template.
Para lograr la máxima fidelidad, se debe utilizar una enzima polimerasa
de alta fidelidad que tenga una actividad de corrección de errores, y
ajustar la temperatura de extensión y la concentración de dNTPs
adecuadas para permitir una extensión completa y precisa del fragmento
de ADN. Además, se debe usar una buena calidad de ADN template para
minimizar la introducción de errores durante la PCR.

c. Rendimiento: El rendimiento se refiere a la cantidad de producto

amplificado generado durante la PCR. Los parámetros que influyen en el
rendimiento son: la cantidad de ADN template, la concentración de
cebadores, la temperatura de hibridación, la temperatura de extensión y la
concentración de MgCl2. Para lograr el máximo rendimiento, se deben
utilizar una cantidad óptima de ADN template y una concentración
adecuada de cebadores y MgCl2. La temperatura de hibridación y
extensión también deben ser adecuadas para permitir una amplificación
eficiente del fragmento de ADN de interés.

d. Eficiencia: La eficiencia se refiere a la capacidad de la PCR para

amplificar la cantidad máxima de producto con el mínimo número de
ciclos de PCR. Los parámetros que influyen en la eficiencia son: la
cantidad de ADN template, la concentración de cebadores, la temperatura
de hibridación, la temperatura de extensión y la concentración de MgCl2.
Para lograr la máxima eficiencia, se deben utilizar una cantidad óptima de
ADN template y una concentración adecuada de cebadores y MgCl2. La
temperatura de hibridación y extensión también deben ser adecuadas para
permitir una amplificación eficiente del fragmento de ADN de interés.
Además, se debe realizar un ciclo térmico óptimo para evitar la formación
de productos no específicos y para asegurar una amplificación óptima del
producto de interés.

2. Explique el fundamento y las aplicaciones de los diferentes tipos de

PCR (ventajas, desventajas, diferencias, puede tomar ejemplos de
aplicación de artículos científicos):
a. PCR anidada (o también llamada Nested-PCR): es una técnica de
amplificación de ADN que utiliza dos pares de cebadores en dos etapas
separadas de la PCR. En la primera etapa de la PCR, se amplifica una
región de interés utilizando un par de cebadores externos que flanquean la
región de interés. Luego, en la segunda etapa de la PCR, se amplifica una
región más específica dentro del producto de la primera etapa, utilizando
un par de cebadores internos que se diseñan para unirse dentro de la
región amplificada en la primera etapa.

La PCR anidada se utiliza comúnmente en aplicaciones donde se

requiere una alta sensibilidad y especificidad, como en la detección de
virus, bacterias, parásitos y enfermedades genéticas.

b. Long-PCR: La técnica se basa en la optimización de las

condiciones de la PCR para superar los desafíos asociados con la
amplificación de fragmentos de ADN largos.
Para superar estos desafíos, la Long-PCR utiliza una combinación de
ajustes en las condiciones de la PCR, como la optimización de la
concentración de los reactivos, la temperatura de annealing y la cantidad
de ADN diana, así como la selección de enzimas de PCR específicas para
la amplificación de fragmentos de ADN largos. Además, la técnica puede
incluir el uso de cebadores múltiples y la optimización del tiempo y la
temperatura de extensión para lograr una amplificación específica para
asi superar los desafios como la inestabilidad térmica del ADN, la
formación de estructuras secundarias y la amplificación no específica.

c. Multiplex-PCR: El fundamento de la Multiplex-PCR es el

mismo que el de la PCR convencional. La técnica se basa en el uso de
cebadores que se unen a regiones complementarias del ADN diana y que,
mediante ciclos de calentamiento y enfriamiento, amplifican de forma
exponencial una región específica del ADN. En la Multiplex-PCR, se
utilizan múltiples pares de cebadores que se unen a diferentes regiones
del ADN, lo que permite la amplificación de múltiples fragmentos de
ADN en una sola reacción. La Multiplex-PCR tiene varias aplicaciones,
como por ejemplo:
-Diagnóstico molecular: La técnica se utiliza en el diagnóstico
molecular de enfermedades infecciosas, genéticas y cancerosas. Por
ejemplo, se pueden diseñar cebadores específicos para múltiples
patógenos y enfermedades genéticas y realizar la amplificación
simultánea de múltiples fragmentos de ADN para la detección de varios
patógenos o mutaciones genéticas.

-Genómica funcional: La Multiplex-PCR se utiliza en la genómica

funcional para la caracterización de genes y regiones reguladoras. Por
ejemplo, se pueden diseñar cebadores específicos para múltiples regiones
de un gen o región reguladora y amplificar simultáneamente los
fragmentos para determinar los niveles de expresión génica y las
modificaciones epigenéticas.

-Identificación de marcadores moleculares: La técnica se utiliza en

la identificación de marcadores moleculares, como polimorfismos de
nucleótido único (SNP) y microsatélites, que pueden utilizarse para la
identificación de individuos y poblaciones, estudios de evolución y
selección natural.

-Análisis de secuencias: La Multiplex-PCR se utiliza en el análisis

de secuencias para la generación de bibliotecas de ADN y la
secuenciación masiva de múltiples fragmentos de ADN.

d. PCR tiempo real: Se utiliza una termocicladora especial que es

capaz de medir la cantidad de fluorescencia emitida por los productos de
amplificación en cada ciclo de la PCR. Las sondas fluorescentes o tintes
intercalantes se incorporan en la reacción de PCR y se unen
específicamente a los productos de amplificación, lo que permite la
detección y cuantificación de la cantidad de ADN o ARN presente en la
muestra en tiempo real. Algunas de sus aplicaciones son:
 -Detección de alimentos y organismos modificados genéticamente:
La PCR en tiempo real se utiliza para la detección y cuantificación de
alimentos y organismos modificados genéticamente (OMG) en productos
alimenticios y en el medio ambiente.

-Estudios de expresión génica: La técnica se utiliza para la

cuantificación de la expresión génica en diversos tejidos y en diferentes
condiciones, lo que permite la identificación de genes y procesos
biológicos implicados en enfermedades y respuestas fisiológicas.

-Secuenciación de nueva generación (NGS): La PCR en tiempo

real se utiliza para la preparación de muestras para la secuenciación de
nueva generación, lo que permite la amplificación de regiones específicas
del ADN y la eliminación de secuencias no deseadas.

e. RT-PCR (RT = retrotranscriptasa): es una técnica de biología

molecular que se utiliza para la detección y cuantificación de ARN en
muestras biológicas. Esta técnica se basa en la conversión del ARN en
ADN complementario (cADN) mediante el uso de una enzima llamada
retrotranscriptasa, seguido de la amplificación del cADN por PCR.
Algunas aplicaciones son:
-Identificación de variantes de splicing: La RT-PCR se utiliza para
identificar y caracterizar variantes de splicing, que son eventos
alternativos de empalme del ARN que generan múltiples isoformas de
proteínas a partir de un solo gen.
-Investigaciones de paternidad y filiación:
-Análisis de muestras forenses:

f. Touchdown-PCR: La técnica se basa en la disminución gradual

de la temperatura de annealing de los cebadores durante las primeras
rondas de amplificación, lo que permite la amplificación selectiva de
fragmentos de ADN específicos. La principal aplicación es:
Amplificación de ADN antiguo o degradado: La técnica se utiliza
para la amplificación de ADN antiguo o degradado, que puede estar
presente en muestras de restos óseos, arqueológicos o forenses.

g. PCR digital: La técnica se basa en la separación física de la

muestra en miles de pequeñas reacciones independientes, permitiendo la
detección y cuantificación de moléculas de ADN individuales. La PCR
digital tiene numerosas aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades,
la detección de mutaciones, el análisis de células individuales, y el
análisis de muestras ambientales.

h. PCR puente: Es una técnica de PCR que permite la

amplificación de fragmentos de ADN más largos que la PCR
convencional, mediante el uso de una sonda de unión que crea una
estructura de puente que permite la amplificación del fragmento de ADN.
La técnica tiene numerosas aplicaciones en la secuenciación de ADN, el
análisis de mutaciones genéticas, el análisis de genes reguladores, y los
estudios de evolución molecular.

i. Single-cell PCR: Es una técnica molecular que permite la amplificación

de material genético de una sola célula. El fundamento de esta técnica se
basa en la obtención de una única célula que posteriormente se somete a
un proceso de lisis celular para obtener su material genético. Una vez
obtenido el material genético de la célula individual, se realiza la
amplificación mediante la técnica de PCR convencional.
Esta técnica se utiliza en diversos campos de investigación y diagnóstico,
incluyendo el análisis de expresión génica, la identificación de
mutaciones, los estudios de diversidad celular y el análisis de células
circulantes. La técnica ha permitido una mayor comprensión de la
biología celular y molecular y ha proporcionado información valiosa en el
campo de la medicina personalizada.

3. Interprete los siguientes resultados de las pruebas moleculares para

detectar COVID-19 en dos pacientes. Las pruebas usaron un kit de
detección por RT-qPCR contra los genes S y RdRP. Mientras que el target
 IPC (Internal Positive Calibrator) amplifica el gen RNase P humana, y se
usó como control interno de amplificación. Considere los controles
positivo y negativo del kit (PC y NTC respectivamente)

* FAM, VIC y ROX son los fluoróforos usados para la detección por
qPCR

Interpretación: En la muestra negativa se puede observar que solo el IPC es amplificado. Al

ser el gen control nos indica que la procedimiento de PCR se realizó correctamente y la curva
de elongación nos muestra que los ciclos de amplificación tambien se realizaron sin
percances.
En la muestra positiva podemos observar que además del gen control (IPC) se replicaron el
Sgen y el RdRP gen ambos con valores cercanos al PC. Hay una ligera variación de IPC en
comparacion con el PC que puede deberse a a diferentes factores, pero principalmente puede
deberse a un menor porcentaje de gen humano presente en la muestra ya que la curva esta
desplazada a la izquierda.
VI. REFERENCIAS

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barras en estudios de genética y biología molecular para la identificación de especies
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• Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M.,
... & Wittwer, C. T. (2009). The MIQE guidelines: Minimum information for
publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical chemistry, 55(4),
611-622.
• Keohavong, P., & Thilly, W. G. (1989). Fidelity of DNA polymerases in DNA
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• Li, T. H., & Weeks, R. J. (2020). Specificity of PCR amplification. En
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• Pérez de Castro, P., & María, A. (2011). Reacción en cadena de la polimerasa
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• Rodríguez A, & Ríos A, & Mosqueda J (2016). Reacción en cadena de la
polimerasa. Montes A, & Rodríguez A, & Borunda J(Eds.), Biología Molecular.
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