TALLER DE ENZIMAS
1. Explique cada uno de los siguientes términos:
a) Oxidorreductasas b) Liasas c)Transferasas d) Isomerasas e) Hidrolásas f) Ligasas
2. En qué consiste la cinética enzimática?
3. Que es el control alostérico?
4. En qué consiste la amplificación de señales reguladoras (cascada de la fosforilasa, coagulación de la sangre)
5. Al estudiar las propiedades de una enzima recién descubierta se obtuvieron los siguientes datos en presencia de dos
inhibidores diferentes A y B. Uno es un análogo del sustrato y otro es un agente alquilante:
[S] (mol/L) v (mol/min) v (mol/min) con A v (mol/min) con B
5 x 10-4 1.25 0.74 0.48
2.5 x 10-4 0.87 0.45 0.33
1.7 x 10-4 0.67 0.32 0.25
1.2 x 10-4 0.54 0.25 0.20
1.0 x 10-4 0.45 0.21 0.17
a) Determinar KM y vmax para esta enzima
b) Qué clase de inhibidor es cada uno?
14. En una reacción enzimática la velocidad máxima es igual a 3.0 mol de sustrato transformados por minuto en presencia
de 1.5 g de enzima (M = 30.000). Cual es el número de recambio?
15. Cuál es la actividad específica de 1.5 mg de enzima que catalizan la transformación de 3 moles de sustrato por minuto
bajo condiciones de máxima actividad?
18. Un bioquímico describió y purificó una nueva enzima, y generó la siguiente tabla de purificación:
Procedimiento Proteína total Actividad
(mg) (unidades)
1. Extracto crudo 20.000 4.000.000
2. Precipitación salina 5.000 3.000.000
3. Precipitación por pH 4.000 1.000.000
4. Cromatografía de intercambio iónico 200 800.000
5. Cromatografía de afinidad 50 750.000
6. Cromatografía de exclusión por tamaño 45 675.000
a) A partir de esta información, calcule la actividad especifica de la enzima después de cada experimento de purificación.
b) Cual de los procedimientos de purificación utilizados para esta enzima es el mas efectivo (El que proporciona el mayor
incremento en la pureza)
c) Cual de los procedimientos de purificación es el menos efectivo
d) Hay alguna indicación en esta tabla de que la enzima ahora es pura? ¿Qué otra cosa se podría hacer para estimar la pureza
de una preparación enzimática?
19. La tripsina y la quimotripsina son enzimas específicas que catalizan la hidrólisis de polipéptidos en sitios específicos (ver
tabla).
ESPECIFICIDAD DE RUPTURA DE ALGUNAS PROTEASAS
Enzima Punto de ruptura (sitio)
Tripsina Lis, Arg (C)
Quimotripsina Fen, Trp, Tir (C)
Pepsina Fen, trp, Tir (N)
Proteasa de Submaxillarus Arg (C)
Proteasa V8 de S aureus Asp, Glu (C)
Proteasas N-Asp Asp, Glu (N)
Bromuro de cianógeno* Met (C)
* Reactivo químico no enzimático
La secuencia de la cadena B de la insulina que se muestra a continuación presenta un enlace cruzado de cistina entre las
cadenas A y B que han sido rotos mediante el uso de ácido perfórmico.
Fen-Val-Asn-Gln-His-Leu-CisSO3--Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tir-Leu-Val-CisO3--Gli-Glu-Arg-Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Pro-Lis-
Ala.
Indique los puntos en la cadena B que serán rotos por a) tripsina y b) quimotripsina. Tenga en cuenta que esas proteasas no
removerán aminoácidos solos de cualquier extremo de la cadena polipeptídica.
22. El sabor dulce del maíz recién cosechado se debe al elevado nivel de azúcar en los granos. Los granos almacenados por
vario días no son tan dulces, debido al que el 50% del azucare del maíz es convertido en almidón al día siguiente de la
cosecha. Para preservar la dulzura y la frescura del maíz. Los granos son inmersos en agua hirviendo durante unos cuantos
minutos (“blanqueado”) y luego enfriados en agua fría. El maíz procesado de esta forma se almacena en congeladores
manteniendo su sabor dulce. ¿Cual es la base bioquímica de este procedimiento?
23. Para calcular la concentración real de enzimas en una célula bacteriana, asuma que la célula contiene 100 enzimas
diferentes en solución en su citosol, que cada proteína tiene un peso molecular de 100.000 y que todas las 1000 enzimas están
presentes en concentraciones iguales. Si se supone que la célula bacteriana es un cilindro (diámetro 1m, altura 2 m). Si el
cistosol (gravedad específica= 1.20) es 20% proteína soluble por peso, y la proteína soluble consiste completamente de
enzimas diferentes, calcule la concentración molar promedio de cada enzima en esta célula hipotética.
24. La enzima ureasa incrementa la tasa de hidrólisis de urea a pH 8.0 y 20ºC por un factor de 10 14. Si una cantidad dada de
ureasa puede hidrolizar completamente una cantidad de urea en 5 minutos y 20ºC a pH 8.0, que tiempo tomará esta cantidad
de urea para ser hidrolizada bajo las mismas condiciones en ausencia de ureasa.
25. El sitio activo de un enzima usualmente consiste en un bolsillo sobre la superficie enzimática alineado con las cadenas
laterales de aminoácidos necesarias para unir el sustrato y catalizar su transformación química. La carboxipeptidasa, que
remueve secuencialmente el aminoácido carboxilo terminal consiste de una sola cadena de 307 aminoácidos. Los dos grupos
esencialmente catalíticos en el centro activo están proporcionados por Arg145 y Glu270.
a) Si la carboxipetidasa fuera una a hélice perfecta que tan lejos deberían estar (en nanómetros) los residuos Arg145 y Glu270?
b) Explique ¿cómo es que esos dos aminoácidos ubicados tan separadamente en la secuencia, pueden catalizar una reacción
que ocurre en un espacio de unas pocas décimas de nanómetro?
c) Si solo esos dos grupos catalíticos están involucrados en el mecanismos e hidrólisis, ¿porqué es necesario para la enzima
contener tan grande número de residuos de aminoácidos?
O OH
26. La enzima muscular
- lactato deshidrogenasa
+ | cataliza- la reacción:
=
CH3 – C – COO + NADH + H CH3 – C – COO + NAD +
|
H
Piruvato Lactato
NADH Y NAD+ son las formas reducida y oxidada de la coenzima NAD respectivamente. Las soluciones de NADH pero no
NAD+, absorben luz a 340 nm. Esta propiedad se usa para determinar la concentración de NADH en solución midiendo
espectrofotometricamente la cantidad de luz absorbida a 340 nm por la solución. Explique como esas propiedades del NADH se
pueden usar para diseñar un ensayo cuantitativo para la lactato deshidrogenasa.
1x10-2 140
[S] (M) V (mo/min)
2.5x10-6 28 27. Aunque existen métodos gráficos para la determinación
4x10-6 40 precisa de los valores de KM y Vmax para una reacción
1x10-5 70 enzimática, esos valores pueden estimarse rápidamente
2x10-5 95 inspeccionando valores de V y de S. Calcule el valor
4x10-5 112 aproximado de KM
1x10-4 128 y Vmax para los datos obtenidos en una reacción
2x10-3 139 enzimática.
28. Ecuación de Michaelis-Menten
a) A que concentración de sustrato una enzima que tiene una Kcat de 30s -1 y una K de 0.005M trabajará a un cuarto de su
velocidad máxima.
b) Determine la fracción de Vmax que reencontraría en cada caso cuando S = 1/KM, 2KM y 10KM.
S (mM) Producto formado
(mol/min) 29. Los siguientes datos experimentales se recogieron
1.5 0.21 durante un estudio de la actividad catalítica de una
2.0 0.24 peptidasa intestinal capaz de hidrolizar el péptido
3.0 0.28 glicilglicina:
4.0 0.33 glicilglicina + H2O 2 glicina
8.0 0.40
16.0 0.45 Con estos datos, determine gráficamente los valores de K M
y Vmax para esta preparación enzimática y su sustrato.
30. La anhidrasa carbónica de los eritrocitos (M=30.000) se encuentra entre las enzimas mas activas conocidas. Ella cataliza la
reacción reversible de hidratación de CO2: H2O+ CO2 ↔ H2CO3, La cual es importante en el transporte de CO2 desde los
tejidos hacia los pulmones.
a) Si 10 g de anhidrasa carbónica pura catalizan la hidratación de 0.30 g de CO2 en 1 min a 37ºC bajo condiciones óptimas,
cual es el número de recambio (Kcat) de la anhidrasa carbónica (¿en unidades de min-1?)
b) A partir de la respuesta anterior calcule la energía de activación de la rehacían cabalizada en kJ/mol?
c) Si la anhidrasa carbónica provee una tasa de realce de la reacción de 10 7, cual es la energía de activación de la reacción no
catalizada?
31. Muchas enzimas son inhibidas irreversiblemente por iones metálicos pesados Tales como Hg 2+, Cu2+, o Ag+, que pueden
reaccionar con grupos sulfhidrilo esenciales para formar mercáptidos:
Enz-SH + Ag+ Enz-S-Ag + H+
La afinidad de la plata por los grupos sulfhidrilo es tan grande que ese metal puede ser utilizado para titular cuantitativamente
grupos –SH. A 10 ml de una solución que contiene 1 mg/ml de una enzima pura, se le añadió suficiente AgNO 3 para inactivar
completamente la enzima. Se requirió un total de 0.342 mol de AgNO3. Calcule el peso molecular mínimo de la enzima.
¿Porqué el valor obtenido mediante este cálculo solo da el peso molecular mínimo?
32. Cuando soluciones enzimáticas son calentadas, hay una perdida progresiva de la actividad catalítica con el tiempo. Esta
pérdida es el resultado del desplegamiento de la molécula de enzima nativa hacia una conformación aleatoriamente plegada,
debido al incremento en la energía térmica. Una solución de l enzima hexocinasa incubada a 45ºC perdió el 50% de su
actividad en 12 min, pero cuando la hexocinasa se incubó a 45ºC en presencia de una gran concentración de uno de sus
sustratos, solo perdió en 3% de su actividad. Explique porqué la desnaturalización térmica de la hexocinasa se ve retardada en
presencia de uno de sus sustratos.
33. El suero sanguíneo humano contiene una clase de enzimas conocidas como fosfatasas ácidas, las cuales hidrolizan ésteres
de fosfatos biológicos bajo condiciones ácidas (pH 5.0):
O- O-
| |
R– O – P – O - + H2O R – OH + HO – P – O -
=
=
O O
Las fosfatasas ácidas son producidas por los eritrocitos, hígado, riñón, bazo, y glándula prostática. La enzima de la glándula
prostática es clínicamente importante porque un incremento en su actividad en la sangre es un indicador de cáncer de próstata.
La fosfatasa de la glándula prostática es inhibida fuertemente por el ión tartrato, pero la fosfatasa de otros tejidos no lo son.
¿Como esta información puede ser utilizada para desarrollar un procedimiento específico para medir la actividad de la fosfatasa
ácida prostática en el suero sanguíneo humano?
34. La anhidrasa carbónica es fuertemente inhibida por el medicamento acetazolamida, que se usa como diurético (incrementa
la producción de orina) y para tratar el glaucoma (reduce la presión intraocular excesivamente alta). La anhidrasa carbónica
juega un papel importante en esos y otros procesos secretorios, porque participa regulando el pH y el contenido de bicarbonato
de varios fluidos biológicos. La curva experimental de velocidad de reacción (dada aquí como porcentaje de Vmax) contra [S]
para la reacción de la anhidrasa carbónica se ilustra en la curva superior de la siguiente gráfica:
100
Cuando el experimento se repite en presencia de
Sin inhibidor
acetazolamida, se obtiene la curva inferior. Inspeccionando
las dos curvas y nuestro conocimiento de las propiedades
V(% de Vmax)
cinéticas de los inhibidores enzimáticos competitivos y no
50
competitivos, determine la naturaleza de la inhibición por
acetazolamida. Explique.
Acetazolamida
0 2 4 6 8 10 100
[S]
35. La actividad enzimática de la lisozima es óptima a pH
100 5.2
El sitio centro activo de la lisozima contiene do residuos de
aminoácidos esenciales para la catálisis: Glu35 y Asp52. Los
máx im )a
valores de pK para las cadenas laterales de esos residuos
d d e la
50
son 5.9 y 4.5 respectivamente. ¿Cuál es el estado de
A c tiv id a(%
ionización (protonado o desprotonado) para cada residuo
al pH óptimo para la lisozima? ¿Como pueden explicar
estos estados de ionización el perfil de actividad mostrado
0
2 4 6 8 10
en la gráfica para esta enzima?
pH
