Guía de Actividades de Microbiología Veterinaria

GUÍA DE ACTIVIDADES de LABORATORIO

Nota: Al finalizar con los laboratorios, cada grupo deberá entregar un informe escrito (Arial
11 en hoja A4), donde se detalle los siguientes puntos en forma sintética y clara:

-Normas de contención utilizadas.

-Marcha bacteriológica.
-Criterios fenotípicos empleados.
-Criterios para la selección de los antibióticos utilizados.
-Interpretación de los resultados de susceptibilidad.

OBJETIVOS GENERALES:
 Reconocer características celulares de los microorganismos por
observación microscópica.
 Desarrollar técnicas microbiológicas.
 Cumplir con normas de bioseguridad en el laboratorio microbiológico
(LM).
 Identificar géneros de importancia clínica.

OBJETIVOS:

 Emplear correctamente materiales y elementos de trabajo de un LM.

 Conocer las condiciones que debe reunir el material microbiológico.
 Respetar el ciclo del material en el laboratorio.
 Reconocer forma, tamaño, agrupación y afinidad tintorial de los microorganismos,
según criterios taxonómicos, presentes en la muestra clínica.
 Aplicar los conocimientos teóricos sobre clasificación de medios de cultivo en la
elección de medios adecuados para la siembra.
 Realizar técnicas de siembra para aislamiento.
 Desarrollar las diferentes habilidades manuales de aplicación en el LM.
 Reconocer situaciones de riesgo de las actividades realizadas.

CONTENIDOS:

Unidad 1: Laboratorio microbiológico (LM). Principios de bioseguridad: Normas generales de

trabajo en un LM. Preparación de materiales. Ciclo del material.
Unidad 2: Morfología y composición química de los microorganismos.
Unidad 3: Métodos de observación. Coloración de Gram: fundamento y técnica.
Unidad 4: Medios de cultivo: clasificación, preparación y conservación. Requerimientos,
metabolismo y nutrición de los m.o. Clasificación de medios de cultivo.
Unidad 5: Reproducción. Técnicas de siembra y aislamiento de bacterias. Concepto de
cultivo puro.
Unidad 7: Acción de los agentes físicos y químicos sobre los microorganismos.
Unidad 8: Microbiota residente normal bacteriana.
Unidad 9: Criterios taxonómicos (fenotípicos).
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TP Nº 1

Unidad 1: Laboratorio microbiológico (LM). Principios de bioseguridad: Normas generales de

trabajo en un LM. Preparación de materiales. Ciclo del material.

ACTIVIDADES:
1A. Reconocimiento de un laboratorio microbiológico, sus riesgos y contenciones.
1B. Preparación de materiales y seguimiento del ciclo del material.
Acondicionamiento de material de vidrio (pipetas, tubos, placas, botellas, etc.).
1C. Realizar una siembra de microbiota residente de la mano en medio sólido
denominada “D2”.

TP Nº 2

Unidad 2 primera parte: Morfología y composición química de bacterias.

ACTIVIDADES:
2A. Observaciones macroscópicas:
-Desarrollo de la placa D2

2B. Realizar observaciones microscópicas:

-Mostración docente (entre porta y cubre) reconocer normas de bioseguridad:

a) Suspender colonias D2 y homogeneizar el material.
b) Montar en fresco.

- Observación de preparados bacteriológicos.

2C. Lavarse las manos.

TP Nº 3

Unidad 2 segunda parte: Morfología y composición química de hongos y virus. Unidad 3:

Métodos de observación. Coloración de Gram: fundamento y técnica.

ACTIVIDADES:
3A. Realizar observaciones microscópicas de preparados micológicos.
3B. Desinfectar la mesada.
3C. Colorear suspensiones de microorganismos (m.o.) obtenidos de cultivos previos.
a) Suspender colonias D2 y homogeneizar el material en agua destilada estéril.
b) Hacer 3 extendidos y fijarlos.
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c) Colorear con técnicas de Azul de Metileno (AZM), Wirtz y Gram:

AZM: AZM 5’ lavar, secar

Wirtz: Verde de malaquita 10’aplicando calor (hasta emisión vapores blancos),
lavar con agua, Safranina 1’ lavar, secar.
Gram: Cristal violeta 1’, lavar con agua, Lugol 1’, lavar, decolorar con alcohol 20",
lavar, Safranina 1’, lavar, secar).

d) Observar con objetivo 100x (con gota de aceite de inmersión).

3D. Desinfectar la mesada.

3E. Lavarse las manos.

TP Nº 4

Unidad 4: Medios de cultivo: clasificación, preparación y conservación. Requerimientos,

metabolismo y nutrición de los m.o. Clasificación de medios de cultivo.

ACTIVIDADES:

4A. Preparación de medios de cultivo bacteriológicos (pesar, hidratar, homogenizar).

4B. Desinfectar la mesa de trabajo.

Fraccionar al abrigo de la llama el caldo embotellado:
4.1 Dispensar aproximadamente 3 ml del caldo en los tubos (o altura  3 cm).
4.2 Reunir los tubos en canastos, cubrir con papel madera, rotular por contenido
y llevar al autoclave.

4C. Plaquear medios sólidos.

4D. Desinfectar la mesa de trabajo.

4E. Observar medios de cultivo bacteriológicos y análisis de su clasificación.

4F. Observar medios de cultivo para m.o. parásitos obligados. Cultivos hísticos.

4G. Analizar métodos para asegurar los requerimientos de O2 o CO2 .

4H. Determinar metabolismo de cultivos puros problema (OF).

4 I. Lavarse las manos.

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TP Nº 5

Unidad 5: Reproducción. Técnicas de siembra y aislamiento de bacterias. Concepto de

cultivo puro.

ACTIVIDADES:

5A. Desinfectar la mesa de trabajo.

5B. Sembrar a partir de la placa D2 en medios líquidos y sólidos.

Incubar 3 caldos para el práctico número 6.

5C. Mostraciones de desarrollo en diversos medios de cultivo para bacterias, hongos y

virus. Interpretar las modificaciones respecto al medio sin sembrar.

5D. Realizar una Cuenta Viable.

Lectura e interpretación de una cuenta viable, NMP y cuenta total (Nefelómetro de
Mc Farland).

5E. Desinfectar la mesa de trabajo.

5F. Lavarse las manos.

TP Nº 6

Unidad 6 y 7: Genética de los microorganismos. Acción de los agentes físicos sobre los
microorganismos.

ACTIVIDADES:

6A. Desinfectar la mesada de trabajo.

6B. Lectura de actividad 5D.
6C. Evaluar la eliminación de microorganismos de cultivos TP 5B mediante:
-filtros de membrana.
-calor a presión (a cargo del docente).
-ebullición por 10 minutos.
6D. Sembrar en medios de cultivo las suspensiones tratadas (6C) e incubar a 37 ºC
hasta el próximo TP.
6E. Analizar el manejo de la autoclave como método de esterilización. Controles.
6F. Desinfectar la mesada de trabajo.
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6G. Lavarse las manos.

TP Nº 7

Unidad 7: Acción de los agentes químicos sobre los microorganismos.

ACTIVIDADES:
7A. Desinfectar la mesada de trabajo.
7B. Interpretar los cultivos obtenidos de TP 6E.
7C. Leer e interpretar antibiogramas por difusión (material provisto por los docentes).
7D. Realizar pruebas de susceptibilidad a Antimicrobianos (AM) in vitro por dilución
según recomendaciones del CLSI (Ver anexo).
D1. Preparar diluciones sucesivas del AM en caldo Mueller Hinton (MH).
D2. Preparar el inóculo:
2.1 Suspender tocando de 3 a 5 colonias (de un cultivo puro en agar
Cerebro Corazón) en 10 ml de SF y homogeneizar.
2.2 Corregir densidad equivalente al tubo Nº 0.5 de Mc. Farland.
D3. Sembrar (volumen constante de inóculo).
D4. Incubar.
7E. Desinfectar las superficies de trabajo.
7F. Lavarse las manos.

TP Nº 8

Unidad 8: Mecanismos de agresión microbiana. Animales de laboratorio.

Unidad 9: Taxonomía microbiana. (Criterios fenotípicos, genotípicos). Algoritmos de
identificación.

ACTIVIDADES:
8A. Desinfectar la mesada de trabajo.
8B. Interpretar la lectura de CIM del TP 7D

A partir de cultivos en pureza provistos por el docente realizar pruebas de habilidades

fisiológicas e interpretar pruebas bioquímicas, significativas para la identificación de taxones
grampositivos y gramnegativos, de importancia veterinaria.
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8C. Realizar la prueba de oxidasa.

8D. Realizar la prueba de catalasa.

8E. Mostraciones a cargo del docente de pruebas bioquímicas: Oxido-fermentación

de la glucosa (OF), fermentación de hidratos de carbono, Rojo de Metilo, Voges
Proskauer, utilización de citrato, producción de Indol, lipasa, lecitinasa, hidrólisis
de la urea, de la esculina, producción de coagulasa, hemólisis, CAMP,
crecimiento en presencia de inhibidores, etc.

8F. Detectar posibles errores de interpretación.

8G. Desinfectar la mesada de trabajo y
8H. Lavarse las manos

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MARCHA BACTERIOLÓGICA

Laboratorio Nº 1

Establecer las normas de bioseguridad para el envío y transporte de la muestra.

 Reconocer forma, tamaño, agrupación, y afinidad tintorial de los microorganismos,
según criterios taxonómicos, presentes en la muestra clínica.
 Aplicar los conocimientos teóricos sobre clasificación de medios de cultivo en su
elección para la siembra de la muestra.
 Desarrollar las diferentes habilidades manuales de aplicación en el LM.
 Justificar el uso de distintas técnicas de siembra acorde a los objetivos de las mismas.
 Reconocer situaciones de riesgo de las actividades realizadas.

CONTENIDOS:

Unidad 1: Bioseguridad.
Unidad 2: Morfología y composición química de los microorganismos.
Unidad 3: Métodos de observación. Coloración de Gram: fundamento y técnica.
Unidad 4: Requerimientos, metabolismo y nutrición de los m.o. Clasificación de medios de
cultivo. Cambios químicos producidos por los m.o.
Unidad 5: Reproducción. Técnicas de siembra. Concepto de cultivo puro.
Unidad 9: Criterios taxonómicos (fenotípicos).

ACTIVIDADES:

A. Procesamiento de una muestra clinica

A.1. Desinfectar la mesada.

A.2. Registrar las muestras.

A.3. Procesar
3.1 Realizar la observación microscópica directa (OD):
a) Homogeneizar o suspender el material.
b) Realizar un extendido: Tomar una gota con el ansa, Extender, Secar y Fijar en
portaobjetos marcado.
c) Colorear con técnica de Gram (Cristal violeta 1', lavar con agua, Lugol 1', lavar,
decolorar con alcohol 20", lavar, Safranina 1', lavar, secar).
d) Observar con objetivo de inmersión (con gota de aceite).

3.2 Sembrar
a) Elegir el/los medios de cultivo: teniendo en cuenta el resultado de la
observación directa y luego de analizar el protocolo que acompaña la
muestra, decida en qué medios de cultivo sembrará.
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b) Rotular y secar las placas de agar, en estufa durante

40 minutos
c) Técnica a utilizar: agotamiento en superficie.

3.3 Rotular cada placa sembrada, con datos de la muestra, grupo, comisión y fecha.

3.4 Reunir en bandeja que identifique a la comisión.

3.5 Incubar: registrar condiciones de incubación (temperatura, ambiente gaseoso,

tiempo) .

B. Reconocer las situaciones de riesgo. Describir las maniobras de contención .

C. Desinfectar las superficies de trabajo y las manos antes de retirarse.

D. Mostraciones a cargo de los docentes

 Observación de leptospiras en campo oscuro.

Laboratorio Nº 2

OBJETIVOS:

Reconocer situaciones de riesgo de las actividades a realizar.

 Reconocer las características macroscópicas del desarrollo de los m.o. en medios
sólidos (hemólisis, pigmento difusible o no, color de la colonia y del medio
circundante en caso de haber utilizado medios diferenciales).
 Observar forma, tamaño y afinidad tintorial de los microorganismos provenientes de
cada colonia.
 Conocer los fundamentos y aplicación de las distintas Pruebas Bioquímicas.
 Justificar el uso de distintas técnicas de siembra acorde a los objetivos.
 Desarrollar las diferentes habilidades manuales de aplicación en el LM.

CONTENIDOS:

Unidad 1: Bioseguridad
Unidad 2: Morfología y composición química de las bacterias.
Unidad 3: Métodos de observación.
Unidad 4: Requerimientos, metabolismo y nutrición de los m.o. Cambios químicos producidos
por los m.o.
Unidad 5: Reproducción bacteriana.
Unidad 7: Acción de los agentes físicos y químicos sobre los m.o.
Unidad 9: Criterios taxonómicos fenotípicos para bacterias y hongos.

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ACTIVIDADES:

Desinfectar la mesada

A. Obtención de cultivos puros

A.1. Reconocer las colonias obtenidas

1.1 Observar, describir y analizar cada una de las diferentes colonias (número, tamaño,
aspecto: color, textura, superficie, bordes, brillo, etc.).
1.2 Registrar otros datos que llamen su atención (hemólisis, pigmento difusible o no,
color de la colonia y/o del medio circundante en caso de haber utilizado medios
diferenciales).
1.3 Suspender la UFC seleccionada con el ansa estéril y al abrigo de la llama en 0,3 ml
de SF.
A.2. Realizar la observación microscópica de la suspensión:
2.1 Delimitar con lápiz o fibra indeleble, un área sobre el revés de un portaobjetos
limpio.
2.2 Tomar con el ansa una gota de la suspensión bacteriana y extender en la zona
delimitada.
2.3 Secar, fijar en la llama. Colorear con técnica de Gram.
2.4 Observar por inmersión (con gota de aceite).
A.3. Reaislar.
3.1 A partir de la suspensión sembrar en un medio de cultivo por agotamiento en
superficie.
3.2 Rotular e incubar.

B. Identificación del metabolismo de los m.o.

A partir de cada suspensión realizada en el punto A.1.3, sembrar por punción 2 tubos de OF
para cada m.o. Cubrir uno de ellos con 0,5 ml de vaselina estéril.

C. Desinfectar las superficies de trabajo y las manos antes de retirarse.

Laboratorio Nº 3

OBJETIVOS:

Reconocer situaciones de riesgo de las actividades a realizar.

 Evaluar la pureza de los cultivos.
 Verificar características microscópicas de las colonias.
 Aplicar distintas Pruebas Bioquímicas acordes a los posibles géneros microbianos.
 Seleccionar distintas técnicas de siembra acordes a las actividades.
 Desarrollar las diferentes habilidades manuales de aplicación en el LM.

CONTENIDOS:
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Unidad 1: Bioseguridad
Unidad 2: Morfología y composición química de las bacterias.
Unidad 3: Métodos de observación.
Unidad 4: Requerimientos, metabolismo y nutrición de los m.o. Cambios químicos que son
producidos por los m.o.
Unidad 5: Reproducción bacteriana.
Unidad 7: Acción de los agentes físicos y químicos sobre los m.o. Determinación de la
susceptibilidad microbiana.
Unidad 9: Taxonomía bacteriana.

ACTIVIDADES:

Desinfectar la mesada

A. Identificación Bacteriana

A.1 Estudiar algunas de las propiedades bioquímicas de cada aislamiento en pureza,

teniendo en cuenta las pruebas sugeridas en la siguiente tabla, útiles para conocer el Género
microbiano al que pertenecen:

Para Bacilos Gram (-)* Para cocos Gram (+)**

Oxidasa
Catalasa Catalasa
OF glucosa OF glucosa
Otras: Otras:
Producción de Indol, RM-VP; Coagulasa, VP.
Utilización de Citrato

Seleccionar los reactivos, medios y/o sustratos adecuados para realizar las pruebas de
oxidasa y catalasa. Utilizar las técnicas de siembra adecuadas a cada estado físico y
presentación de los respectivos medios.

A.2. Otras determinaciones:

* Movilidad.
Sembrar un CCC con la colonia aislada para ver movilidad en el próximo práctico.
** Presencia de la enzima coagulasa (colocar en un tubo estéril 0,25ml de un cultivo de
24h y agregar 0,25 de plasma citratado de conejo. Llevar a incubar a 37 ºC durante 4h.
(Evaluando cada 30 minutos).

A.3. Rotular el medio utilizado, muestra, fecha, grupo y comisión.

A.4. Incubar registrando las condiciones de incubación (temperatura, ambiente gaseoso,

tiempo).

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B. Realizar un Antibiograma por difusión en agar a partir del cultivo puro según
recomendaciones del CLSI (Ver anexo).

B.1. Secar las placas de agar Mueller Hinton en estufa

durante 40 minutos.

B.2. Preparar el inóculo.

2.1 Suspender tocando de 3 a 5 colonias (del cultivo puro en A.C.C.) en 5 ml de SF y
homogeneizar.
2.2 Corregir densidad equivalente al tubo Nº 0.5 de Mc. Farland, por agregado de SF o
de m.o.

B.3. Sembrar.
Técnica de Siembra por diseminación con hisopo y por lo menos, en 3 direcciones
diferentes.

B.4. Dispensar monodiscos.

Seleccionar según tabla los discos de antimicrobianos y colocarlos (con la pinza pasada
por alcohol y flameada en el mechero).
Tener presente las condiciones de almacenamiento de los mismos como así también el
número y disposición de los mismos en la placa.

B.5. Incubar seleccionar condiciones de incubación temperatura, tiempo.

C. Desinfectar las superficies de trabajo y las manos antes de retirarse.

Laboratorio Nº 4

OBJETIVOS:

Reconocer situaciones de riesgo de las actividades a realizar.

 Identificar fenotípicamente bacterias presentes en la muestra: por Lectura e
interpretacion de Pruebas Bioquímicas y habilidades fisiológicas según los algoritmos
aprendidos.
 Leer, interpretar e informar el antibiograma.
 Integrar las diferentes prácticas realizadas por los grupos en el LM.

CONTENIDOS:
Unidad 1: Bioseguridad.
Unidad 2: Morfología y composición química de las bacterias.
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Unidad 3: Métodos de observación.

Unidad 4: Requerimientos, metabolismo y nutrición de los m.o. Cambios químicos
producidos por los m.o.
Unidad 5: Reproducción bacteriana.
Unidad 7: Acción de los agentes físicos y químicos sobre los m.o. Determinación de
susceptibilidad antimicrobiana.
Unidad 9: Taxonomía bacteriana.

ACTIVIDADES:

Desinfectar la mesada

A Identificación bacteriana

A.1 Lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas (utilizando los reactivos necesarios).

A.2 Observación de movilidad microscópica entre porta y cubre.

2.1 Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, depositar una gota del cultivo
2.2 Cubrir la misma con un cubreobjetos, apoyandolo sobre el porta a 45º
2.3 Observar con objetivo de 10 X y 45 X.

A.3 Inferir la ubicación taxonómica de m.o.

Utilizar tablas de clasificación taxonómica y el programa de la materia para inferir los
posibles géneros a los que pertenecen el o los microorganismos aislados.

B. Leer e interpretar antibiogramas por difusión.

1.1 Medir los diametros
1.2 Interpretar los resultados de acuerdo a los puntos de corte (tabla).

C. Desinfectar las superficies de trabajo y las manos antes de retirarse.

D. Puesta en común

E. Presentación del informe grupal escrito.

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