DESCRIPCION DE LA PRACTICA:
Reconocimiento de aminoácidos:
Reacción de millón:
Es específica para grupos fenólicos, por lo tanto, dan positivo todas las sustancias que poseen
esta estructura, por ejemplo, la tirosina. En una primera instancia se procede a la nitración del
anillo fenólico con el ácido nítrico del reactivo. La tirosina nitrada forma complejos con los
iones mercurio Hg (I) y Hg (II) del reactivo produciendo un precipitado rojo o una solución roja,
ambos resultados positivos (a veces se observa un precipitado blanco, que debe calentarse
para que vire a la coloración roja). Reactivo de Millón (preparación según Farmacopea
Nacional Argentina 7° Ed.): transferir 2 ml de mercurio a un Erlenmeyer, agregar 20 ml de
ácido nítrico. Agitar el Erlenmeyer bajo campana extractora para deshacer el mercurio en
pequeños glóbulos. Luego de aproximadamente 10 minutos agregar 35 ml de agua destilada y,
si aparece un precipitado o cristales, agregar ácido nítrico diluido (1 en 5, preparado a partir de
ácido nítrico al que se le hayan retirado los óxidos haciendo pasar aire a través de él hasta que
se torne incoloro) en cantidad suficiente para disolver el sólido separado. Agregar una solución
de hidróxido de sodio (1 en 10) gota a gota, mezclando minuciosamente, hasta que el
precipitado grumoso que se forma luego del agregado de cada gota ya no se redisuelva, pero
se disperse para formar una emulsión. Agregar 5 ml de ácido nítrico diluido y mezclar. Preparar
esta solución al momento de usar:
Procedimiento
- A 2 ml de la solución problema agregar 1 ml del reactivo de Millon.
- Calentar por 10 minutos a Baño María (100 °C) y observar el precipitado y/o color.
Reacción xantoproteica:
Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las
proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en
aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en
presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un
color anaranjado oscuro.
Se lleva a cabo agregando a la muestra a ensayar (por ej. clara de huevo, o leche) ácido nítrico
concentrado en caliente:
El color amarillo indica la presencia de aminoácidos con anillos aromáticos en su estructura
La reacción es positiva para prótidos que contienen aminoácidos con anillos aromáticos. En la
reacción estos anillos se nitran, por lo que aparece el color amarillo intenso de sus derivados
nitrados.
Técnica:
Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de solución problema (clara de huevo).
Añadir 1 cc. de HNO3 concentrado.
Calentar al baño maría a 100º C..
Enfriar en agua fría
Añadir gota a gota una disolución de sosa al 40%.
Reacción de Pauli:
La reacción de Pauly (la prueba de Pauly o la reacción diazo de Pauly) se utiliza para la
detección cualitativa de los aminoácidos tirosina e histidina en proteínas. Lleva el nombre de
su descubridor Hermann Pauly (1870-1950) en 1904.12 Cuando las proteínas que contienen
tirosina o histidina se hacen reaccionar con ácido sulfanílico diazotizado en condiciones
alcalinas, se forma un color rojo por una reacción de acoplamiento.
Reacción
La tirosina y la histidina tienen un anillo aromático que puede sufrir fácilmente sustituciones
electrofílicas. El ácido sulfanílico diazotizado se acopla con el anillo aromático para formar un
color rojo.
En el primer paso, el ácido sulfanílico se diazota añadiendo nitrito de sodio en presencia de
ácido clorhídrico. Después de la adición a la solución de aminoácidos, se alcaliniza y, si están
presentes grupos aromáticos, se forman los colorantes azoicos: azotirosina y azohistidina
Reacción de Hopkins y colf:
Al realizar la reacción de la muestra de proteínas en medio ácido sulfúrico concentrado, frente
al ácido glioxílico (Reactivo de Hopkins-Cole) aparece color violeta en la interfase solución
H2SO4, debido a la formación de un colorante similar al índigo.
La reacción es positiva cuando los prótidos poseen aminoácidos con núcleo indólico
(Triptófano).
Reacción de la ninhidrina:
El hidrato de tricetohidrindeno (ninhidrina) es el reactivo más usado para la identificación y
cuantificación de aminoácidos. En una primera etapa de la reacción, el aminoácido se oxida,
descarboxilándose y liberando amoníaco, mientras que una de las moléculas de ninhidrina de
reduce a hidrindantina.
En el segundo paso de la reacción, la hidrindantina formada con una segunda molécula de
ninhidrina, reaccionan con el amoníaco formando un complejo de color púrpura (Púrpura de
Ruhemann).
Procedimiento
- Sobre un papel de filtro, colocar una gota de las muestras y los patrones.
- Sobre cada una de las muestras, colocar una gota de una solución 0,2 % de ninhidrina en
etanol.
- Llevar el papel a la estufa (entre 110 y 120 °C) hasta la aparición de color en las muestras.
Reacción de Biuret:
Esta reacción es positiva cuando la molécula contiene dos uniones peptídicas o más, cercanas
entre si (es decir, tripéptidos en adelante). Se realiza tratando la solución a ensayar con CuSO4
en medio alcalino de NaOH.
La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la
presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos.
Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia
compleja denominada biuret, de fórmula:
que, en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta
característica.
Técnica:
Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 cc. de albúmina de huevo.
Añadir 2cc. de solución de hidróxido sódico al 20%.
A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%.
Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica
Se observa el color violeta indicador de la presencia de proteínas en ambas muestras
Las proteínas dan color violeta, las peptonas (PM mayor 5000) color rojo-morado. El color
desarrollado se debe a la formación de un complejo de coordinación con el Cu++
Electroforesis:
Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de proteínas es
la electroforesis (técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un
medio aplicando un campo eléctrico). Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que
contiene partículas cargadas, las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o
polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo
(cátodo). Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que
los aminoácidos (a a) constituyentes de las proteínas, y por tanto las proteínas, son
compuestos anfóteros que se comportan como ácidos 6 (ceden protones y quedan con carga
negativa) o bases (captan protones y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el
que estén.
Ensayos de desnaturalización de proteínas:
Si se somete a las proteínas a la acción de ciertos agentes que trastornan su organización, se
alteran sus propiedades físicas, químicas y biológicas naturales, y se dice que las proteínas se
desnaturalizan. Usualmente, debido a la menor solubilidad en agua de la proteína
desnaturalizada se observa la precipitación en la forma de un sólido blanco.
Si se ensaya la albúmina del huevo frente a calor, alcohol etílico, sales neutras (como sulfato
de amonio) o a la presencia de un ácido, se observa lo siguiente:
Efecto de diferentes agentes desnaturalizantes sobre la proteína testigo (albúmina de huevo)
Cuando esto ocurre, las proteínas pierden las estructuras secundaria y terciaria (y
cuaternaria si la tuviere).
1. En este primer experimento se somete a la proteína a temperaturas extremas en el
baño
maría en este caso se utiliza dos muestras en dos tubos de ensayo.
Material Necesario
La clara de un huevo
Tubos de ensayo
Baño maría
Procedimiento:
Hecha la clara del huevo en el interior del tubo de ensayo y someterlo al baño maría
tapa el tubo y espera
A medida que pasa el tiempo observa lo que sucede en el tubo de ensayo
Fig.1 proteína muestra Fig.2 proteína desnaturalizada en
baño maría
Experimento 2
2. En el segundo proceso experimental la proteína es sometida al contacto del Ph del
alcohol que es de 6 es decir acido.
Material Necesario
La clara de un huevo
Tubos de ensayo
alcohol
Procedimiento:
Hecha la clara del huevo en el interior del tubo de
ensayo con el alcohol
Tapa el tubo de ensayo y espera
A medida que pasa el tiempo observa lo que sucede en
el tubo de ensayo
Fig.3 muestra de proteína Fig.4 proteína mas alcohol.
Desnaturalización lenta
Las cadenas de proteínas que hay en la clara de huevo se encuentran enrolladas adoptando
una forma esférica. Se denominan proteínas globulares. Al freír o en este caso cocer un huevo,
el calor hace que las cadenas de proteína se desenrollen y se formen enlaces que unen unas
cadenas con otras. Este cambio de estructura da a la clara de huevo la consistencia y color que
se observa en un huevo cocinado. Este proceso que se conoce con el nombre de
desnaturalización se puede producir de muy diversas maneras:
calentando: cocer o freír
batiendo las claras
por medio de agentes químicos como alcohol, sal, acetona, etc.
Los ácidos y las bases rompen los puentes salinos de las proteínas, sobre todo, mediante la
modificación del pH. Cuando un ácido o una base están en solución, se disocian en cationes
(H+ u otro elemento químico positivo en una base, como Na + en NaOH) y aniones (OH- u otro
elemento químico negativo en un ácido, como Cl - en HCl). Los elementos disociados
interactúan con el grupo amonio positivo y el grupo ácido negativo de los aminoácidos. Por lo
tanto, tiene lugar un tipo de reacción con dos reemplazos: los iones positivos y negativos en la
sal del aminoácido cambian de pareja con los iones positivos y negativos en el ácido o la base
que se ha añadido (figura 1).
Figura 1: Ruptura de la interacción del puente salino debido a la adición de ácido clorhídrico.
Normalmente, las estructuras alteradas en la proteína dependen de la fuerza del ácido o la
base. Un ácido o una base débil suele alterar las estructuras terciarias y cuaternarias, mientras
que un ácido o base fuerte también altera las secundarias.
Hay varios procesos donde ocurre esta reacción, como en el aparato digestivo, cuando los
jugos gástricos ácidos hacen que la leche se cuaje (coagule); o mientras preparamos mayonesa
y añadimos zumo de limón (ácido cítrico) a los huevos para favorecer una mejor emulsión.
